فهرست مطالب

 

• توپولوژی عموم ……………………………………………………………………………………………………….. 3
• اصول جداسازی………………………………………………………………………………………………………. 8
• ترکیبیات ………………………………………………………………………………………………………………. 9

2  تعداد توپولوژی های روی یک مجموعه متناهی

• توپولوژی هایی باکمترین تعداد از مجموعه های با……………………………………………………………………………………… 14
• توپولوژی ها بابیشترین تعداد مجموعه های باز …………………………………………………………………………………………. 14

3  تعداد توپولوژی های محدب روی یک مجموعه متناهی ترتیب کلی

3-1   توپولوژی های محدب آشیانه ای…………………………………………………………………………………………………………………..    32

3-2 Tcvx(n) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

4   اندازه کمین ممکن برای یک مجموعه تحت یک توپولوژی معین

4-1 به دست آوردن تعداد(n, k)   T ……………………………………………………………………………………………………………………… 41

4-2 شرح ماشینی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 44

4-3 کران های نمایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

4-4 معین کردن اندازه مینیمال مجموعه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

4-5 کارایی بهتر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

4-6 مقایسه نوع دیگری از دنباله ها…………………………………………………………………………………………………………………………… 60

مراجع

واژه نامه فارسی به انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………..    65

واژه نامه انگلیسی به فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………… 67

فهرست جدول ها

3-1 TNest(n, k)تعدادی از توپولوژی ه ای روی یک مجموعه−n نقطه ای  ترتیب کلی شامل مجموعه محدب آشیانه ای است            33

3-2 تعداد Tcvx(n) و Tnest(n) از توپولوژی محدب آشیانه ای و توپولوژی محدب روی یک مجموعه ی ترکیب کلی –n نقطه ای، و تعداد T(n) از توپولوژی روی یک  مجموعه ی –n نقطه است……………………………………………………………………………………. 40

4-1 تعدادی از اعداد مینیمال از نقاط m(k) هستند که برای ساختن یک توپولوژی دارای k مجموعه باز در محاسباتی در (27) به ازای ]٢, ٢۵ k ∈ [ نیاز داریم………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44

4-2  مقادیر f(n)را به ازای 10 n≤بدست می آوریم ، در سطر پایین اندازه اندازه کوچکترین توپولوژی که بیشتر از 1 است، با بهره گرفتن از قضیه بالا بدست نمی آید، در این صورت 4/(2– (n23از قضیه بالا بدست می آید، واعداد بدست امده را برای اینکه به اعداد صحیح تبدیل شوند، به سمت پایین روند می کنیم………………………………………………………………………………………………………………………………………… 44

فهرست شکل ها

• گراف جهتدار رابطهR……………. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8

2-1  شبکه ای از مقسوم علیه های عدد صحیح 60 است که به صورت مرتب تقسیم شده است…………………………………………………………. 14

 

2-2 شبکه ای از ریز مجموعه های {x, y, z}……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 19
• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 20
• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 21
• شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …… …………………………………………………………………………………………………………………………………….22
• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 26
• …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 28
• ……………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………28

3-1 یک نمونه از توپولوژی روی(8و1) است………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 37

3-2 در مثال ممکن است نقطه اضافه شده به خارج همسایگی ها شامل هیچ یک از همسایگی ها نباشد یا خارج دوتا همسایگی باشد و شامل یک همسایگی و همچنین امکان دارد شامل سه همسایگی باشد.. ……………………………………………………………………………………………………….38

3-3 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر همسایگی مینیمال MN(J) بسطی برای

(8و1)j ∈  نباشد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-4 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر MN(2)و MN(6) بسطی شامل 9 باشند………………………………………………………………………… 39

4-1 مجموعه ترتیب جزئی) P(T  مربوط به توپولوژی القاء شده T  به وسیله توپولوژیT در مثال2.4 اس

4-2 شیوه قضیه 3.3 به ازای K=105که در آن K2=1101001 است…………………………………………………………………………………………………………… 51

4-3 شیوه قضیه 7.3 به ازای K=5550 که در آن K2=1010110101110 دوگان ایده آل مرتب یکریخت به • ⊕• است، که به وسیله روش دایره ای تعریف می کنیم. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

4-4 یک روش کارا برای ساختن یک مجموعه ترتیب جزئی با 65535 پادزنجیر با بهره گرفتن از 19 عنصر است  59

4-5 شیوه قضیه 3.3 را برای K=4681 بکار می بریم………………………………………………………………………………………………………………………………………  60

 

چکیده :

مقدمه: سوختگی با واکنش های التهابی و تولید رادیکال آزاد از جمله ROS و RNS و کاهش سیستم ایمنی بدن همراه است. بنابراین  این مطالعه به منظور بررسی استرس اکسیداتیو و آنزیم پاراکسوناز (PON1) به عنوان یک شاخص آنتی اکسیدانی در بیماران دچار آسیب سوختگی حرارتی و مقایسه با افراد سالم طراحی شد. مواد وروش ها: در این مطالعه مورد شاهدی 57 بیمار سوختگی حرارتی که در بخش اورژانس بستری شده بودند و حداکثر 4 ساعت از سوختگی آنها گذشته شده بود به عنوان مورد و 57 فرد سالم که از نظر سن و جنس با گروه مورد همسان سازی شد به عنوان کنترل وارد مطالعه شد .فاکتور های بیوشیمیایی، علائم حیاتی و فعالیت آنزیم پاراکسوناز (PON1) در هر دو گروه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: ارزیابی های کلینیکی و آزمایشگاهی در افراد مورد مطالعه نشان داد تعداد ضربان قلب (04/0=p)، تعداد تنفس (001/0>p)،  سطح گلبول سفید خون (001/0>p)، سطح پلاکت پلاسما (03/0=p)، سطح قند ناشتای خون (001/0>p)، سطح کلسترول تام (007/0=p)، سطح HDL (001/0>p)، سطح SGOT (001/0>p)، سطح SGPT (01/0=p)، سطح پتاسیم (001/0>p)، سطح  کلسیم (04/0=p) و سطح آلبومین سرمی (001/0>p) اختلاف معنی داری بین دو گروه دارد. شایان ذکر است سطح فعالیت پاراکسوناز در گروه دچار سوختگی حرارتی به طور معنی داری کمتر از گروه کنترل بود (001/0>p). یافته های مطالعه حاضر نشان داد حتی پس از تعدیل آنالیزها برای فاکتورهای احتمالی تاثیر گذار بر سطح پاراکسوناز شامل سطح HDL، فعالیت کبدی، مصرف دخانیات و سطح آلبومین پلاسما رابطه معنی داری بین سطح  پاراکسوناز و سوختگی وجود دارد بدین مفهوم که سطح این آنزیم پلاسمایی در بیماران دچار سوختگی کمتر از افراد سالم می باشد (03/0=p). نتیجه گیری: بررسی سطح فعالیت این آنزیم می تواند به عنوان یک بیومارکر در ارزیابی شدت ضایعات دراز مدت ناشی از سوختگی و یا حتی یک نقطه درمانی مفید باشد. با توجه به اینکه می توان پاراکسوناز جهش یافته با فعالیت و حلالیت متفاوت تولید نمود که پتانسیل تولید واریته های از پاراکسوناز با فعالیت بالاتر در حذف پراکسید های لیپیدی و یا فعالیت بیشتر علیه سموم ارگانوفسفات دارند. لذا با انجام تحقیقات بیشتر در این زمینه می توان امیدوار بود که سنجش فعالیت پاراکسوناز جهت پیش آگهی بیماران دچار آسیب سوختگی حرارتی در نظر گرفته شود.

هدف از مطالعه

در افراد نرمال، تعادل بین آنتی اکسیدن ها و اکسیدان ها وجود دارد. افزایش در غلظت اکسیدان ها یا افت آنتی اکسیدانی منجر به ازدست رفتن این تعادل و به وجود آمدن حالتی به نام استرس اکسیداتیو می شود به نظر می رسد استرس اکسیداتیو نقش مهمی در پاتوژنر بیماری آسب سوختگی از طریق آسیب مستقیم، یا درگیر کردن مکانیسم های مولکولی موثر در التهاب بافتی داشته باشد. رادیکال های آزاد بواسطه شروع وقایعی که منجر به تخلیه آنتی اکسیدانی می شود سبب القا استرس اکسیداتیو می شود.

آنزیم PON 1 که برروی HDL واقع می باشد مسئول هیدرولیز پراکسید های لیپیدی و بنابراین محافظت در برابر استرس اکسیداتیو ایفا کند. فعالیت و پلی مورفیسم PON1 بر توانایی HDL افراد در جلوگیری از التهاب موثر است. بنابراین اندازه گیری سطح فعالیت آن در عوارض سوختگی و التهاب های ناشی از رادیکال های آزاد به منظور اهداف درمانی می تواند مفید باشد.

فعالیت PON1  در بین افراد مختلف متفاوت می باشد و فاکتور های متعددی در این امر دخیل است. پلی مورفیسم ژنتیکی در ژنوم PON1 یک فاکتورتاثیر گذار در مقداری از این تغییرات میباشد. از پلی مورفیسم ژن پاراکسوناز در موقعیت های M/L 55 وQ/R   192 چندین ایزوزیم ایجاد می شود که فعالیت شان نسبت به سوبستراهای گوناگون متفاوت می باشد.

در این مطالعه فعالیت سرمی آنزیم PON1 در 57 بیمار مواجهه یافته با سوختگی  و 57 نفر از افرادسالم با سن وجنس و بدون هیچ بیماری زمینه ایی مورد مطالعه قرار گرفت.

با توجه به عوارض التهاب در بیماران دچار سوختگی و عدم تعادل اکسیدان / آنتی اکسیدان در بیماران دچار سوختگی بر آن شدیم در این مطالعه فعالیت آنزیم PON1  را در بیماران دچار سوختگی بستری شده در بیمارستان سوانح و سوختگی مطهری تهران را بررسی کنیم .

با وجود ناشناخته بودن مکانیسم عوارض دیررس ناشی از سوختگی در ایجاد ضایعات سوختگی، این مطالعه به منظور تعیین ارتباط آنزیم PON1 به عنوان یک عامل مهم آنتی اکسیدانی با شدت بیماری و عملکرد بافت در ضایعات سوختگی انجام شد. هدف اصلی این مطالعه تعیین ارزشمندی فعالیت PON1 به عنوان یک بیومارکر برای تشخیص حساسیت افراد به بروز عوارض سوختگی، شدت بیماری و عملکرد بافت در ضایعات سوختگی ناشی از التهاب میباشد.

مقدمه:

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                            صفحه

چکیده فارسی……………………………………………………………..15

مقدمه

• هموفیلوس آنفولانزا………………………………………………………………..17
• میکروبیولوژی……………………………………………………………………………………….19
• دسته‌بندی سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا قابل تیپ بندی………………………………………………………….20
• کلون سازی و تهاجم…………………………………………………………….22

1-2-4 کلون‌سازی در مجرای تنفسی فوقانی………………………………………………………………………22

1-3-4  حمله به اپیتلیوم……………………………………………………………………….23

1-4-4 حمله به جریان خون……………………………………………………….24

1-5-4 بقا در جریان خون………………………………………………………………….25

1-6-4 حمله به CNS…………………………………………………………………………………….26

1-1-5 شاخص‌های بیماری زایی هموفیلوس آنفولانزا…………………………………………………………………………………27

1-2-5 OMPs………………………………………………………………………………………………………………………..28

1-3-5-  پیلی……………………………………………………………………………………………………………………28

1-4-5-  ایمونوگلوبولین A1 پروتئاز……………………………………………………………………………….30

1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-6-5-  نقش LPS در بیماری‌زایی……………………………………………………………………………………………………………………………..32

1-1-6 کپسول…………………………………………………………………………………………………………………34

1-2-6-  دخالت کپسول در بیماری‌زایی………………………………………………………36

1-3-6-  ژنتیک بیان کپسول………………………………………………………….36

1-1-8 روش­ها و آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی………………………………………………………38

1-2-8 روش­های تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………….38

1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………39

1-4-8- برتری روش­های تشخیص مولکولی………………………………………………………………………………..40

1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………..40

1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………….44

1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………45

2-1 واکسن های کونژوگه…………………………………………………………………….48

2-2- واکسن‌های Hib………………………………………………………………………………………..49

2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………..50

2-4-  پاسخ های واکسن پلی‌ساکاریدی…………………….51

2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی………………………………………………………………..51

2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی ………………………………..51

2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………52

2-5-3-  مولکول های حامل  ……………………………………………………52

2-6-EDC یا EDAC…………………………………………………………………………………………52

2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون  ………………………………………………………53

2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن1 – حامل……………………………………………………….54

2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………..55

2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………………………………………………………………………….56

2-11- سنجش فعالیت باكتری كشی……………………………………………………………………56

فصل سوم- مواد و روش ها

3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………60

3-2-1- تهیه میكروارگانیسم های به كار گرفته شده در این مطالعه……………………………………………………………………………………………………66

3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن……………………………………………………………66

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP………………………………………………………………………………………………………..66

3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………..66

3-2-5-تیمار عصاره مخمر…………………………………………………………………..67

3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ………………………………………………………………………………………………..70

3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………..72

3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی………………………………………..73

3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………….73

3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم………………………………………………………………………………………….74

3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………74

3-2-12- افزودن فسفات سدیم………………………………………………….75

3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………..75

3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………75

3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت …………………………………………76

3-2-16- لیوفلیزاسیون ……………………………………………………………………………….76

3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده  ………………………………………………………………………………………………………….76

3-2-18- تست ریبوز  …………………………………………………………………………………76

3-2-18- 1- اساس تست بیال  …………………………………………..77

3-2-18- 2- معرف‌های تست بیال  ……………………………….77

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات  ………………………………………….77

3-2-18- 4-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز  ………………………………………………………………………..77

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده  ……………………………………………………………………………….79

3-3-1- آزمون های پروتئین سنجی ……………………………………………………………………………………………….79

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

3-3-3- روش پروتئین سنجی  Lowry ………………………………………………………………81

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن  ………………………………………………………………….83

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

 

 

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103   …………………………………………………………………….84

3-6-1- طرز باز كردن سوش لیوفیلیزه جدید …………………………………………………………………………..84

3-6-2-تهیه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

3-6-8- رسوب با سولفات آمونیوم …………………………………………………………………………………………..87

3-6-9- دیالیز اگزوتوكسین   A …………………………………………………………………………….88

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسین  A   ………………………………………………………………………………..89

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

3-6-11سنجش تولید اگزوتوكسین  ………………………………………………………..89

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی  ……………………………………………………………………………….90

3-6-12- دتوكسیفای كردن اگزوتوكسین A  به روش فرمآلدیئد  ……………………………………………………………………………91

3-7- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb  (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

3-9- سنجش پروتئین  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

3-12- كنترل توكسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-13- آزمون پیروژنی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-16- پلی آكریل آمید ژل الكتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE)  ………………………………………………………..96

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

3-16-3- محلول­های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آكریل آمید  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

3-16-7- محلول­های مورد نیاز  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

3-16-8- روش رنگ آمیزی  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-1- اصول آزمون SBA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

3-17-3-روش انجام آزمون  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم: نتایج

4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

4-3- تعیین خلوص PRP  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109

4-4- اندازه‌گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111

4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و  ETA و  PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113

4-6-  کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و   PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113

4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115

4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116

4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشی سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- واکسن‌های کونژوگه‌ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124

5-2- واکسن کونژوگه‌ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-3-  واکسن کونژوگه‌ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127

5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128

نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130

فهرست شکل ها

شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%)  362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد –  چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78

شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88

شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89

شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107

شکل 4-2  تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

شکل 4-3 طیف سنجی NMR    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110

شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111

شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای  PRP-ETA و  ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها

نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83

جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

نمودار 4-3  تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110

جدول 4-2  تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

جدول 5-3- میزان ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….112

نمودار 5-5- منحنی استاندارد پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113

جدول 4-4- میزان پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113

جدول 5-4- میزان اسید نوکلئیک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..114

نمودار 4-6-منحنی OD  فرکشن های کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

جدول 4-5- عیـار آنتی بادی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….118

جدول 4-6-  تیتر آنتی بادی باكتری كشی واكسن کونژوگه (PRP-ETA)  و PRP  در روزهای  15،30، 45…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….119

چكیده

هموفیلوس آنفلوانزا سروتیپ b مهمترین عامل مننژیت و پنومونی در کودکان زیر 5 سال در سراسر جهان می باشد که پس از کلونیزه شدن در حلق وارد خون شده و باکتریمی می دهد،در ادامه باکتری از طریق خون خود را به مننژ رسانده و مننژیت می دهد که عامل 95% باکتریمی و مننژیت ها هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b می باشد که از کپسول پلی ساکاریدی آن موسوم به پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP) جهت تولید واکسن های کونژوگه گلیکوپروتئینی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b استفاده شده است.به دلیل اینکه پاسخ ایمنی نسبت به این پلی ساکارید غیر وابسته به سلول T بوده و در پاسخ ایمنی سلول خاطره ایجاد نمی گردد،لذا دوز یادآور تاثیری در بالا بردن سطح ایمنی ندارد.برای از بین بردن خاصیت T-INDEPENDT،PRP به طور کوالانسی به اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا (ETA) متصل می گردد.در این پروژه سویه استانانداردهموفیلوس آنفلونزا سروتیپ b ابتدا در فرمانتور حاوی محیط CY (کازآمینواسید – عصاره مخمر )کشت گردید و تخلیص PRP  از مایع کشت با انجام روش های الکل پرسپیتاسیون (رسوب دادن الکلی) و رسوب دادن با ستاولن (هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید)،التراساتریفیوژ و تخلیص با هیدروکسی آپاتیت حاصل گردید.جهت تهیه اگزوتوکسین A نیز سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت تریپتیکازسوی براث کشت گردید و پس از سنجش توکسیسیته در موش با بهره گرفتن از روش قلیایی ،سم زدایی شده و جهت کونژوگه نمودن با PRP  از ADHو سیانوژن بروماید به عنوان اسپیسر و EDAC به عنوان عامل لینکر استفاده گردید و کونژوگه حاصل با عبور از ستون CL-4B تخلیص شد.

کونژوگه بدست آمده جهت ارزیابی ایمونولوژیکی طی 2 مرحله با فاصله 14 روز به تعدای خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق گردید و از هر کدام از خرگوش ها در روزهای 0،15،30،45 خونگیری از قلب انجام شد.تیتر آنتی بادی توسط سرم باکتریسیدال اسی اندازه گیری شد.تیتر باکتری کشی برای PRP خالص در تزریق اول 16 و در تزریق دوم شاهد افزایش تیتر نبودیم.تیتر باکتری کشی برای کونژوگه در تزریق اول 32 و در تزریق دوم 64 بود که شاهد افزایش تیتر بودیم.با توجه به نتایج حاصل شده ،کونژوگه PRP-ETA سبب تحریک بیشتر سیستم ایمنی و افزایش تیتر آنتی بادی در تزریق دوم می گردد.همچنین اگزوتوکسین A دتوکسیفای شده یک کریر مناسب می باشد.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه                                 

چکیده                                                                                                                                       1

مقدمه                                                                                                                                       3       

فصل اول: کلیات

1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول……………………………………………………………………….           12

1-2-راه انتقال                                                                                                   13

1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست……………………………………………………………………………..           14

1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی……………………………………………………………………………….           15

1-2-3-انتقال از طریق جفت  …………………………………………………………………………………………………….           15

1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی………………………………………………………………………….           16

1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی…………………………………………………           18

1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل………………………………………………………………………………………………….           18

1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان………………………………………………………………………………………………           18

1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط……………………………………………………………………………………………….           19

1-4-آنتی ژنهای توكسوپلاسما گوندی…………………………………………………………………………………………           19

1-5-واکسیناسیون ……………………………………………………………………………………………………………………….   21

1-6-بیماریزایی                                                                                                  22

1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی………………………………………………………………………………………………..           24

1-8-تظاهرات بالینی …………………………………………………………………………………………………………………….           25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز……………………………………………………………………………………………………….           29

1-9-1- تشخیص مستقیم……………………………………………………………………………………………………………             29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی………………………………………………………………………….             29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی………………………………………………………………………………..             30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم………………             30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ………………………………………………………………………………………………………            31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن…………………………………………………………………………………….             34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم…………………………………………………………..             34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت……………………………………………………………….             35

1-10-الایزا (ELISA)………………………………………………………………………………………………………………….             35

1-10-1- الایزای مستقیم …………………………………………………………………………………………………………..             36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………………….             36

1-10-3- الایزای ساندویچ……………………………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم…………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم………………………………………………………………………………….             37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری……………………………………………………………………………………………….             37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ……………………………………………….             38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب……………………………………………………………………………………………………..             39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی………………………………………………             39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت………………………………………………………………………………..             40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس………………………             42

1-16-درمان                                                                                                      44

1-17-پیشگیری                                                                                                  47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن…………………………………………………………………………………………………..             48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ………………………………………………………………………………………………………             50

1-20-اهداف و فرضیا ت …………………………………………………………………………………………………………….             51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته                             

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته ……………………………………………………………………………………………………………..  53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………………………………..             59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی………………………………………………             59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ………………………………………………………………………………………………………………             60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده………………………………………………………………………..             62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE             62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات…………………………………………………..            66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده……………………………………………………………………………………………             71

 

3-4- تعیین غلظت پروتئین…………………………………………………………………………………………………………             71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) ……………………………………………………………………………………………             71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا……………………………………………………………………………………………..             72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا………………………………………………………………………………………………             72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا……………………………………………………………………………………………             74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا…………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا      …………………………………………………………………………             76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم     ……………………………………             77

3-8-تعیین Cut off  در روش الایزا …………………………………………………………………………………………..             80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun …………………………………             81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ………………………………             82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG …………………………………             82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6                                                                                                   83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از کیت تجاری EUROIMMUN  …..             83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از کیت تجاری Microgen…………………             85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ………………………………             88

3-16- کنترل کیفی …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-16-1- حساسیت …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-17-طراحی تحقیق     …………………………………………………………………………………………………………….             88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری  …………………………………………………………………………………..             89

3-18-1- تعداد نمونه ………………………………………………………………………………………………………………….             89

3-18-2- روش نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………             89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6                                                                                                   92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ………………………………………..             93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun                 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… .           95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun        95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun  ……………………………………………………………………………………………………………………            96

4-4- برقراری شرایط ELISA  Avidity با پروتئین های نوترکیب  ……………………………………….           100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با بهره گرفتن از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار………………………………………………………………………………..           103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با بهره گرفتن از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران  ……………………………………………………………………..           103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با بهره گرفتن از کیت Microgen……………………………………………………………………………….           104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع                                                                                                                                       121

خلاصه انگلیسی   …………………………………………………………………………………………            127

ضمائم                                                                                                                                      129

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                   صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن………………………………………………………………..            87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon………            97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7     …………………………………………………………………………………………………………………….           106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل1-1- شكل شماتیک یک تاكی زوایت و یک برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی …………..              4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یک تاكی زوایت، سوش  VEGكه در حال

نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می باشد………………………………………………………………………………….              7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش…………………………………………………………………………………………              8

شکل1-4- یک كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد…….              9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط………………             16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی………………………………………..            25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا………………………………………………………………………………………….             38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………….             87

شکل 4-1  : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………..             92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………..             93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ………………………………………………………………………………………………..             94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA6 …………………………………………………………………………           101

شکل 4-5 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA6……………………………………….           101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA7…………………………………………………………………………..           102

شکل 4-7 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA7………………………………………..           102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای……………………….           105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………………………… 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

عفونت حاد و مزمن و تحت حاد…………………………………………………………………………………………………..           107

 

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توكسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد تركیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند.  شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با بهره گرفتن از دو پروتئین GRA7 وGRA6  برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارایی روش avidity ELISA با بهره گرفتن از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با بهره گرفتن از تست های استاندارد سرولوژیک برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا  داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم  آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با بهره گرفتن از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.

کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه

 

تاریخچه و طبقه بندی

انگل توکسوپلاسما گوندی[1]، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو[2] در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی[3] در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور[4] در برزیل در یک خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا  است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توكسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود كه انگل از اتوپسی چشم یک كودك مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توكسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیكی تست رنگی[5] به وسیله سابین و فلدمن[6] در 1948 )5(، به طور دقیق  مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل[7] در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاكسونومیک توكسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شكل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن[8] در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.

Kingdom: Protozoa

Phylum: Apicomplexa

Class: Sporozoea

 Sub-class: Coccidia

تهران با روش مولکولی Triplex-PCR