چکیده

مایعات یونی را می­توان به عنوان محیط واکنش­های بیوکاتالیز جایگزین­هایی سبز برای حلال­های آلی به شمار برد. ترکیبات مختلفی از کاتیون­ها و آنیون­ها را می­توان جهت دست­یابی به طیف وسیعی از مایعات یونی با ویژگی­های فیزیکی شیمیایی مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسیع خصوصیات مایعات یونی، نیاز است که مایعات یونی مناسب برای هر آنزیم خاص و هر محیط واکنش خاص مشخص شود. آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس (TTL) یک لیپاز مقاوم به دما است که اختصاصیت انانتیومری خوبی نسبت به الکل­های ثانویه دارد. بنابراین از TTL می­توان به عنوان یک آنزیم بالقوه صنعتی، در انجام واکنش های تفکیک مخلوط­های راسمیک استفاده کرد. در این پژوهش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور غلظت­های مختلف مایعات یونی [CnMIM][Br] (12، 6، 4، 2 = n) مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این موضوع که پایداری دمایی آنزیم در محیط­های حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیط­ها در فرایندهای صنعتی می­باشد، پایداری دمایی آنزیم از نظر سینتیکی و ساختاری در 10 نوع مایع یونی با کاتیون­ها و آنیون­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج افزایش فعالیت هیدرولازی و پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی نسبت به محیط بافری را نشان می­دهد. غلظت بهینه مایعات یونی [CnMIM][Br] در جهت افزایش فعالیت آنزیمی نیز به دست آمد. نتایج نشان داد که آنزیم TTL به ترتیب در غلظت های 3/0، 1 و 3/0 مولار از مایعات یونی [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترین فعالیت را داشته است. در حالی­که در مورد مایع یونی [C12MIM][Br] هیچ اثر مثبتی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم مشاهده نشد. همچنین مشخص گردید که نوع کاتیون و نوع آنیون مایعات یونی، شدت اثر آن­ها بر پایداری آنزیم TTL را تحت تأثیر قرار می­دهد. نوع آنیون به دلیل اندازه کوچک و چگالی بار بالایی که دارند، اهمیت بیشتری نسبت به نوع کاتیون دارد. در مقایسه­ای که بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF6– اثر پایدارکننده بیش­تری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد. پایداری آنزیم در حضور مایعات یونی با طول زنجیره آلکیلی کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مایعات یونی با زنجیره کاتیونی طویل اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم می­گذارند. همچنین در این پژوهش نشان داده شد با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمی­ شود. مطالعات ساختاری پایداری دمایی آنزیم پس از حرارت­دهی در °C 85، با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس نیز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتی TTL نشان داد که در مایعات یونی با آنیون PF6– ساختار آنزیم تا حد زیادی حفظ می­ شود؛ به طوری که تفاوت کمی بین شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از 1 ساعت حرارت­دهی در °C 85 دیده می­ شود. در مایعات یونی [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از 45 دقیقه آنزیم همچنان بیش از 50 % از فعالیت خود را حفظ کرد. این درحالی است که پایداری آنزیم در محیط آبی در دماهای بالاتر از °C 80 کمتر از 15 دقیقه است. با توجه به یافته های پژوهش حاضر، می توان از آنزیم TTL برای کاتالیز فرایند­های زیستی در مایعات یونی و دماهای بالا بهره برد.

کلمات کلیدی: مایعات یونی، لیپاز، ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس ، پایداری دمایی.

 

 

 

فهرست مطالب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- آنزیم­ها	2
1-2- لیپازها	3
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن	5
1-3- آنزیم­ها در محیط آلی	6
1-4- مایعات یونی	8
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی	9
1-5-1- آنزیم­ها در مخلوط­های مایع یونی – آب	10
1-5-2- فعالیت آنزیم­ها در شرایط نسبتا بی­آب در مایعات یونی	11
1-5-3- پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی تقریبا بی­آب	13
1-5-4- آنزیم­ها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت	13
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپاز­ها و استرازها	14
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس	15
فصل دوم: بر پژوهش­های پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز	18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم	19
2-3- بررسی ساختار آنزیم­ها در مایعات یونی	22
اهداف	23
فرضیه	23
فصل سوم: مواد و روش­ها
3-1- ابزار	25
عنوان	صفحه
3-2- مواد	26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی	26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL	26
3-2-2-1- سوش باکتری	26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون	26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی	26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز	26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE	27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز	27
3-2-4- نرم افزارها	27
3-3- روش­ها	28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی	28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید	28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات	28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب	29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli	29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli	29
3-3-2-2-1-  تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی	29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد	30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری	31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب	31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب	31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL	31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا	32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL	32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL	33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی	33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی	33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی	33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین	34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد	34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280	34
عنوان	صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS (SDS-PAGE)	35
3-3-5-1- آماده سازی محلول­های الکتروفور	35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز	36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات	38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی	39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا	39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف	39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی	40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب	42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL	43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا	43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL	44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی	44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز	45
4-3- سنتز مایعات یونی	47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL	47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL	48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی	48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی	49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف	49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی	51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم	51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی	54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL	57
عنوان	صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL	59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی	61
فصل ششم: نتیجه ­گیری و پیشنهادات
6-1- نتیجه ­گیری	63
6-2- پیشنهادات	63
فهرست منابع	65
چکیده انگلیسی	75

فهرست جدول­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز	4
جدول2-1- آنیون­های متداول در مایعات یونی	19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani	29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB	30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM	31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد	34
جدول 3-5-  نحوه تهیه بافر نمونه 4X	37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید	37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم	38
جدول 4-1- فعالیت­های لیپازی عصاره­های سلولی کلنی­های 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون	44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL.	46
جدول 5-1- غلظت­های بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه	58

فهرست شکل­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL)	6
شکل 1-2- آنیون­ها و کاتیون­های مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز	9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب	12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز	18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید	28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL	42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی	45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL	46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL	47
شکل 4-5- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی	48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50	49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90	50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون	52
شکل 4-9-  نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL	53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL	53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85	54
شکل 4-12- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6	55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6]	55

مقدمه

 

 

1-1- آنزیم­ها

آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که می­توانند سرعت واکنش­ها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده[1] زمین لیپیدها هستند و آنزیم­ های لیپولیتیک[2] نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیم­ های لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلول­های یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).

آنزیم­ها مزایای زیادی در انجام واکنش­ها دارند که از جمله آن­ها می­توان اختصاصیت بالای آن­ها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینه­ها و