زمستان 1392

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                  شماره صفحه

چکیده. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه. 3

1-2- روابط میكروارگانیسم با ریشه گیاهان. 5

1-3- ترشحات ریشه. 6

1-4- ریزوسفر. 6

1-4-1 جمعیت میكروبی در ریزوسفر. 7

1-4-2 عوامل مؤثر بر میكروارگانیسم ها در منطقه ریشه. 8

1-5- اهمیت فسفر برای موجودات زنده. 9

1-5-1 اشكال مختلف فسفر در طبیعت. 9

1-5-2 تغییر و تبدیلات میكروبی فسفر در طبیعت. 10

1-5-3 میكروارگانیسم های ریزوسفر و انحلال فسفات. 12

1-5-4 مكانیسم های انحلال فسفر توسط میکروارگانیسم ها. 12

1-6- اثر میكروارگانیسم های ریزوسفری بر گیاهان. 14

1-7- کودهای کشاورزی. 17

1-7-1 مقایسه انواع مختلف کودها. 17

1-7-2 کود زیستی (Biofertilizer) 18

1-7-3 دسته بندی کودهای زیستی. 19

1-7-4 اثرات سوء کودهای شیمیایی. 19

1-7-5 دلایل اهمیت استفاده از کودهای زیستی. 20

1-7-5-1 اهمیت کودهای بیولوژیک در سلامتی انسان. 21

1-8- پیشینه استفاده از کودهای زیستی. 22

1-9- جایگاه تولید كودهای زیستی در ایران و جهان. 23

1-10- تولید کودهای زیستی. 25

1-10-1 ویژگی ماده حامل. 26

1-11- کودهای زیستی باکتریایی. 27

1-12- کودهای زیستی فسفاته. 28

1-13- لیگنیت. 29

1-14- ویژگی های گیاه تربچه. 30

1-14-1 خصوصیات گیاه شناسی. 30

1-14-2 شرایط اقلیمی. 31

1-14-3 کشت تربچه. 33

1-15- اهداف تحقیق. 34

1-16- فرضیه های تحقیق. 34

فصل دوم: بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- پیشینه تحقیق. 36

2-2- هدف پژوهش. 40

فصل سوم: روش اجرای تحقیق

3-1- تهیه کشت جوان و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده   42

3-1-1 رنگ آمیزی گرم. 42

3-1-2 تکنیک کاور اسلیپ. 42

3-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات در مقیاس آزمایشگاهی. 43

3-3- ارزیابی به کارگیری افزودنی­های لازم برای افزایش بقا سویه مورد نظر نسبت به تنش های محیطی مشتمل بر خشکی، شوری، دما، UV، pH    44

3-3-1 آماده سازی ماده حامل جهت تلقیح با باکتری. 44

3-3-2 اعمال تنش های محیطی بر روی تیمارها. 45

3-3-2-1 محیط کشت استارچ کازئین آگار. 46

3-3-2-2 محلول  كدورت سنجی مك فارلند. 46

3-3-2-3 محلول رقیق كننده. 47

3-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان ها و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه. 47

3-4-1 روش كشت گلدانی تربچه. 47

3-5- تاثیر سطوح مختلف تلقیح بر روی بقاء در سطح بذر تربچه   48

3-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه تربچه. 48

3-6-1 اندازه گیری غلظت فسفر گیاه تربچه. 48

3-6-2 روش ساخت معرف وانادات – مولیبدات. 49

3-6-3 روش تهیه محلول های استاندارد فسفر و رسم منحنی استاندارد   49

3-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف. 50

3-8- نگهداری سویه مورد نظر برای مطالعات بعدی. 50

3-8-1 محیط كشت نوترینت براث (Nutrient Broth) 51

3-8-2 محیط كشت TSA.. 51

3-9- نتایج آنالیز خاک گلدان قبل از آزمون و پس از آزمون   52

3-10-  تجزیه وتحلیل آماری داده ها. 52

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده‏ها

4-1- تهیه محیط کشت تازه و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده   54

4-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات   54

4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء سویه باکتری. 55

4-3-1 تاثیر تنش دمایی بر افزایش بقاء باکتری در فرمول   55

4-3-2 تاثیر تنش شوری بر افزایش بقاء باکتری در فرمول. 65

4-3-3 تاثیر تنش خشکی بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 73

4-3-4 تاثیر تنش PH بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 76

4-3-5 تاثیر تنش UV بر افزایش بقا باکتری در فرمول. 84

4-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه. 89

4-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه و نتایج آنالیز فسفات خاک گلدان‏ها و آنالیز فسفات گیاه   96

4-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف. 103

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

5-1- نتیجه گیری. 111

5-2- پیشنهادات. 119

منابع و مآخذ. 121

فهرست منابع فارسی. 121

فهرست منابع انگلیسی. 123

چکیده انگلیسی. 126

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

عنوان                                                  شماره صفحه

جدول 1-1- فهرستی از كودهای زیستی فسفاته داخل کشور.. 25

جدول 2-1- درجه حرارت های مورد نیاز گیاه تربچه.. 32

جدول 3-1- ترکیبات محیط کشت PVK.. 43

جدول 3-2- ترکیبات محیط کشت استارچ کازئین آگار.. 46

جدول 3-3- ترکیبات سرم فیزیولوژی.. 47

جدول 3-4-  ترکیبات محیط کشت نوترینت براث.. 51

جدول 3-5- نتایج آنالیز مینرالوژی و تجزیه سرندی خاک.. 52

جدول 3-6- توزیع اندازه ذرات خاک.. 52

جدول 4-1- میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دمایی (درجه سانتیگراد).. 55

جدول 4-2- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 55

جدول 4-3- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف.. 55

جدول 4-4- تجزیه واریانس سطوح مختلف دما بر بقاء باکتری.. 56

جدول 4-5- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 56

جدول 4-6- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 56

جدول 4-7- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دما به روش دانکن (α < 0.05).. 57

جدول 4-8- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف دما به روش دانکن (α <0.05).. 57

جدول 4-9- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن (α <0.05).. 57

جدول 4-10- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش دمایی.. 58

جدول 4-11- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری.. 58

جدول 4-12- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 59

جدول 4-13- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای دما، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 60

جدول 4-14- میزان معنی داری فاکورهای دما (Temperature)، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری در تنش دمایی.. 62

جدول 4-15- میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف شوری.. 65

جدول 4-16- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 65

جدول 4-17- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف.. 65

جدول 4-18- تجزیه واریانس سطوح مختلف شوری بر بقاء باکتری   66

جدول 4-19- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 66

جدول 4-20- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 66

جدول 4-21- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف شوری  به روش دانکن (α <0.05).. 66

جدول 4-22- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف زمان به روش دانکن (α <0.05).. 67

جدول 4-23- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن (α <0.05).. 67

جدول 4-24- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش شوری.. 67

جدول 4-25- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری تحت تنش شوری.. 68

جدول 4-26- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن  در تنش شوری(<0.05).. 68

جدول 4-27- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای شوری، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 69

جدول 4-28- میزان معنی داری فاکورهای شوری (Salinity)، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری در تنش شوری.. 71

جدول 4-29- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف خشکی  و مواد حامل به روش دانکن (α <0.05) ……………………. 72

جدول 4-30- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در تنش خشکی…………………………………… 73

جدول 4-31- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری در تنش خشکی به روش دانکن       (α <0.05)……………….. 73

جدول 4-32- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای خشکی و مواد حامل فرموله شده…………………………….. 73

جدول 4-33- میزان معنی داری فاکورهای خشکی و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 75

جدول 4-34- تجزیه واریانس سطوح مختلف pH بر بقاء باکتری.. 76

جدول 4-35- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری.. 76

جدول 4-36- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری.. 77

جدول 4-37- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف pH  به روش دانکن (α <0.05).. 77

جدول 4-38- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف زمان به روش دانکن تحت تاثیر تنش pH (α <0.05).. 77

جدول 4-39- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن تحت تاثیر تنش pH(α <0.05).. 78

جدول 4-40- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده تحت تاثیر تنش pH.. 78

جدول 4-41- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری.. 78

جدول 4-42- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 79

جدول 4-43- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای pH ، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 80

جدول 4-44- میزان معنی داری فاکورهای pH ، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و                                             مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 82

جدول 4-45- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری در تنش uv. 84

جدول 4-46- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری در تنش uv  84

جدول 4-47- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف uv به روش دانکن (α <0.05).. 85

جدول 4-48- مقایسه میانگین بقاء باکتری در سطوح مختلف رقت به روش دانکن تحت تنش uv  (α <0.05).. 85

جدول 4-49- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده تحت تنش uv. 86

جدول 4-50- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری تحت تنش uv. 86

جدول 4-51- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن تحت تنش uv        (α <0.05).. 86

جدول 4-52- میانگین بقاء باکتری بر اساس فاکتورهای uv، رقت، زمان شمارش کلنی‏ها و مواد حامل فرموله شده.. 87

جدول 4-53- میزان معنی داری فاکورهای uv، رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (min) و                                             مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 88

جدول 4-54- میانگین بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه بر اساس مواد حامل فرموله شده.. 90

جدول 4-55- تجزیه واریانس بین مواد حامل فرموله شده مختلف بر بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه.. 90

جدول 4-56- مقایسه میانگین بقاء باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه به روش دانکن (α <0.05).. 91

جدول 4-57- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل مختلف تلقیح شده به بذر.. 92

جدول 4-58- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش).. 92

جدول 4-59- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 93

جدول 4-60- مقایسه میانگین بقاء باکتری در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 93

جدول 4-61- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل فرموله شده و زمان شمارش کلنی‏ها.. 94

جدول 4-62- میزان معنی داری فاکورهای زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری.. 94

جدول 4-63- میزان معنی داری فاکورهای طول برگ (Leaf Lenght)، وزن خشک (Dry Weight) ،  وزن تر (Fersh Weight) ، فسفات خاک (Soil Phosphate) و فسفات گیاه (Plant Phosphate)بر بقاء باکتری.. 96

جدول 4-64- مقایسه میانگین طول برگ در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 97

جدول 4-65- مقایسه میانگین وزن خشک در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 97

جدول 4-66- مقایسه میانگین وزن تر در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 98

جدول 4-67- مقایسه میانگین فسفات خاک در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05). 98

جدول 4-68- مقایسه میانگین فسفات گیاه در حامل های مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 99

جدول 4-69- میانگین بقاء باکتری در زمان‏ (روز شمارش) در دوره 3 ماهه.. 103

جدول 4-70- میانگین بقاء باکتری در رقت‏های مختلف در دوره 3 ماهه   103

جدول 4-71- تجزیه واریانس سطوح مختلف زمان شمارش کلنی‏ها بر بقاء باکتری در دوره 3 ماهه.. 104

جدول 4-72- تجزیه واریانس سطوح مختلف رقت بر بقاء باکتری در دوره 3 ماهه.. 104

جدول 4-73- مقایسه میانگین بقاء باکتری در حامل‏های مختلف در زمان های شمارش مختلف به روش دانکن (α <0.05).. 104

جدول 4-74- مقایسه میانگین رقت بر بقاء باکتری به روش دانکن  در دوره 3 ماهه (α <0.05).. 105

جدول 4-75- میانگین بقاء باکتری بر اساس مواد حامل فرموله شده در دوره 3 ماهه.. 105

جدول 4-77- مقایسه میانگین تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری به روش دانکن (α <0.05).. 106

جدول 4-78- میانگین بقاء باکتری در مواد حامل فرموله شده، رقت و زمان شمارش کلنی‏ها.. 107

جدول 4-79- میزان معنی داری فاکورهای رقت (Dilution)، زمان شمارش کلنی‏ها (Day) و مواد حامل فرموله شده (Carrier Materials) بر بقاء باکتری   108

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                  شماره صفحه

نمودار 3-1- منحنی استاندارد فسفر(گیاه).. 50

نمودار 4-1- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز).. 63

نمودار 4-2- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور دما (درجه سانتیگراد).. 63

نمودار 4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت   64

نمودار 4-4- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور شوری (درصد).. 72

نمودار 4-5- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش شوری.. 72

نمودار 4-6- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش شوری.. 73

نمودار 4-7- تاثیر سطوح مختلف خشکی و ماده حامل بر بقاء باکتری در فرمول.. 76

نمودار 4-8- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور pH   83

نمودار4 -9- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش pH.. 83

نمودار 4-10- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش pH.. 84

نمودار 4-11- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (دقیقه) تحت تنش uv. 88

نمودار 4-12- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش uv. 89

نمودار 4-14- بقا باکتری در سطوح مختلف تلقیح.. 95

نمودار 4-15- اندازه طول برگ در تیمارها.. 99

نمودار 4-16- وزن خشک گیاه در تیمارها.. 100

نمودار 4-17- وزن تر گیاه در تیمارها.. 100

نمودار 4-18- آنالیز فسفات خاک گلدان ها در تیمارها.. 101

نمودار 4-19- آنالیز فسفات گیاه در تیمارها.. 101

نمودار 4-21- بقا باکتری در حامل‏ و رقت‏های مختلف در مدت 90 روز   108

نمودار 4-22- بقا باکتری در حامل‏های مختلف در مدت 90 روز.. 109

نمودار 4-23- بقا باکتری درمدت زمان 90 روز‏ و رقت‏های مختلف   109

 

 

فهرست شکل ها  

عنوان                                                  شماره صفحه

شکل 1-1- تغییر و تبدیلات فسفر خاک توسط باکتری ها. 11

شکل 1-2- مکانیسم های انحلال فسفات توسط باکتری. 14

شکل 1-3- تاثیر باکتری های حل کننده فسفات روی گیاهان. 16

شکل 1-4- لیگنیت. 30

شکل 1-5- گیاه تربچه. 31

شکل 1-6- تربچه نقلی یا چهار فصل. 34

شکل 3-1- تیمارهای فرموله شده از لیگنیت، سویا، خاک فسفات   44

شکل 4-1- کشت تازه از سویه روی محیط pvk. 54

شکل 4-2-کشت روی محیط pvk. 54

شکل 4-3- مقایسه ظاهری تیمار فرمول با کنترل. 90

شکل 4-4- تیمارهای بکارگرفته شده در گلدان ها در هفته اول و دوم   102

شکل 4-5- مقایسه ظاهری تیمارها با کنترل. 102

 

 

 

 

 

چکیده

مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان­ها و دیگر موجودات زنده شده است. به همین علت امروزه استفاده از کودهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. باکتری­ های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند. با توجه به اینکه اغلب خاک های ایران آهکی بوده و در اقلیم‏های خشک و نیمه خشک هستند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمبود مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اغلب محصولات کشاورزی باشد، لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. جهت حداکثر افزایش بقاء باکتری در ماده حامل از سطوح تلقیح مختلفی که شامل لیگنیت و مواد تکمیلی پودر سویا و خاک فسفاته با نسبتهای مشخص بود استفاده شد و این مواد حامل تلقیح شده تحت تنشهای دما، شوری، خشکی، pH و uv قرار گرفتند همچنین کلیه مواد حامل ساخته و تلقیح شده بطور جداگانه در یک بازه زمانی 90 روز از لحاظ بررسی بقاء باکتری سنجیده شدند. بهترین فرمول به دست آمده از تنشها در گلدان به کارگیری شد. همچنین تیمارهای دیگری نیز از لیگنیت با سطوح مختلف ساخته و با باکتری و بذر تربچه تلقیح شد و بقاء باکتری در بازه 24 ساعته اندازه گیری شد و بعد از آن در گلدان به کار گرفته شدند. با توجه به نتایج به دست آمده بهترین فرمول به دست آمده از تنش­ها و بازه زمانی 90 روز، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% تعیین شد و بعد از بکارگیری در گلدان بهترین نتیجه را نسبت به سایر مواد حامل و کنترل نشان داد و پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه را بهتر از تمامی مواد حامل و کنترل افزایش داده است. از بین تیمارهای ساخته شده و تلقیح شده به بذر تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتایج را نشان داد و بعد از به کارگیری تیمارها در گلدان نیز تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتیجه را نشان داد. این فرمول بهترین نتیجه را در پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در یک نتیجه گیری کلی، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% به عنوان فرمول نهایی و اصلی برای به کارگیری در آزمایشات بعدی و مقیاس مزرعه پیشنهاد می‏گردد.

 

کلید واژگان: باکتری‏های حل کننده فسفات،spp.  Streptomyces ، کود زیستی فسفاته، لیگنیت، پودر سویا، گیاه تربچه

 

 

مقدمه

طی چند دهه اخیر به علت افزایش جمعیت و تقاضای روزافزون برای مواد غذایی، مصرف کود های شیمیایی به منظور افزایش مقدار تولید در واحد سطح به شدت افزایش یافته است. استفاده از کودهای شیمیایی فسفاته تاریخچه دیرینه ای دارد و به انقلاب سبز و معرفی کودهای شیمیایی بر می گردد(ساریخانی و همکاران 1389، 13).‏‏‏ مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان ها و دیگر موجودات زنده خواهد شد. نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی زمانی احساس می شود که بدانیم علاوه بر آسیب های زیست محیطی ناشی از کاربرد کودهای شیمیایی، محدود بودن منابع، افزایش قیمت تمام شده و تثبیت شدن قسمت اعظمی از کودهای فسفاته مصرفی به شکل غیرقابل استفاده برای گیاه نیز پیامدهای استفاده از این کودهای شیمیایی هستند(ساریخانی و همکاران 1389، 13).

ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای رهاسازی فسفات تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس می شود که  بر این امر واقف گردیم که منابع فسفات موجود در خاک  قابلیت تامین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه تا صد سال را دارا می باشد. بنابراین کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورت قابل جذب و استفاده برای گیاه تبدیل نمود (Bashan 1998, 16). به همین علت امروزه استفاده از کودهای بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است که مکانیسم عمل آنها قابلیت جذب عناصر غذایی گیاه در خاک را افزایش می‏دهد. باکتری­ های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر       می رسند (Bashan 1998, 16). فسفر در خاک‌ها به دو شکل آلی و معدنی  وجود دارد اما غلظت فسفات محلول در خاک معمولاً خیلی پایین است (Bashan 1998, 16). قسمت اعظم میکرو ‏‏ارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در ریزوسفر گیاهان متمرکز شده‌اند. میکروب‏های خاک توانایی تبدیل اشکال نامحلول فسفر به اشکال محلول را دارند. ترکیبات آلی و معدنی خارج شده از ریشه، باعث افزایش جمعیت میکروبی در اطراف ریشه می‌گردند . با توجه به اینکه میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در خاک به طور طبیعی وجود دارند و موجب افزایش فسفر قابل دسترس و تحریک رشد گیاه می‌شوند، اما تعداد آن‌ ها در خاک به اندازه کافی نیست تا با سایر میکروارگانیسم‏هایی که در ریزوسفر قرار دارند رقابت کنند. بنابراین تلقیح گیاهان با میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات اثرات مفیدی دارد. باکتری­ های حل کننده فسفات طی سه مکانیسم تولید اسیدهای آلی، کلات کردن و واکنش های تبادل لیگاند موجب انحلال ترکیبات نامحلول فسفات می‏شوند. طی فرایند انحلال بخشی از فسفر محلول، توسط باکتری حل کننده فسفات استفاده می‏شود اما از آنجائیکه مقدار فسفر حل شده بیش از نیاز باکتری‏ها است لذا این مقدار آزاد می‏تواند در اختیار گیاه قرار گیرد. اغلب خاک‏های ایران دارای آهک و گچ بوده و این امر می‏تواند موجب تثبیت فسفر شود. در نتیجه فسفر جذب ذرات کلوئیدی خاک شده و از دسترس گیاه خارج می شود. بنابراین در غالب خاک‌ها از نظر مقدار فسفر کل مشکل وجود ندارد، بلکه مشکل، در دسترس قرار گرفتن آن می‌باشد. فسفر جذب عناصری مانند Ca2+، Fe3+  و Al3+ شده و باعث تشکیل ترکیبات نامحلول می‌گردد (Bhattacharyya and Jha 2012, 28).

[1]PGPR یا باکتری های تحریک کننده رشد گیاه، گروهی از باکتری‏های ریزوسفر هستند که به طور مستقیم (انحلال فسفات، تولید هورمون­ها…) و غیر مستقیم (تولید کاتالاز، سیانید هیدروژن و….) موجب افزایش رشد گیاه می شوند. با توجه به طیف گسترده اثرات مثبت برخی از باکتری­ های سودمند از قبیل تولید سیدروفور، تولید هورمون­ها و ویژگی بیوکنترلی آنها بر ضد قارچها و عوامل بیماریزا، متمرکز شدن بر تحقیقاتی که منجر به حصول چنین میکروارگانیسم های چند منظوره ای باشد بسیار مثمر ثمر خواهد بود، زیرا کودهای زیستی تلقیحات میکروبی هستند که علاوه بر افزایش جذب عناصر غذایی، موجب افزایش رشد گیاه می‏شوند، بنابراین با کاربرد سویه های PGPR  می‏توان چندین هدف را به طور همزمان دنبال کرد ((Boraste 2009, 1; Saharan and Nehra 2011, 21.

استفاده از ماده حامل مناسب در تولید یک کود زیستی با کیفیت بسیار مهم و ضروری است. ذغال­سنگ نارس[2]، ذغال­سنگ قهوه­ای[3]، چارکل[4]، گل یا لجن فشرده، کودهای مزرعه­ای و مخلوط خاک­ها می­توانند به عنوان یک حامل مناسب استفاده شوند. ذغال سنگ طبیعی و ذغال سنگ قهوه ای حامل­های بهتری برای کودهای زیستی هستند. الحاق میکروارگانیسم به ماده حامل باید به گونه ای باشد که قابل حمل و لمس راحت و تجزیه طولانی باشد و کمترین اثر را روی کود زیستی بگذارد. بر طبق تحقیقات هوبن[5] و سوماسه گاران[6] یک ماده حامل خوب برای تلقیح بذر، باید ارزان و به راحتی در دسترس باشد، علاوه بر این نباید برای سویه های باکتریایی و گیاه سمی باشد زیرا حامل می تواند روی بذر اثر بگذارد. همچنین حامل باید ظرفیت جذب رطوبت خوبی داشته باشد و به خوبی به بذر متصل شود و در نهایت حامل باید ظرفیت بافری و pH مناسبی داشته باشد و به راحتی بتوان آن را با اشعه گاما یا اتوکلاو استریلیزه کرد                 (Boraste 2009, 1).

باتوجه به اینکه در خاک های آهکی ایران که در اقلیم های خشک و نیمه خشک تحول پیدا کرده اند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمی مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اکثر محصولات کشاورزی باشد. لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر   spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد.

[1] Plant growth promoting rhizobacteria

فهرست مطالب

چکیده فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………ذ

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………ر

1-1 مقدمه. 2

1-2 نشان‌گر چیست؟. 2

1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی.. 3

1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک… 3

1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی.. 4

1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA  وRNA.. 4

1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR.. 7

1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLP. 7

1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS) 8

1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها 9

1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCR.. 11

1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP) 11

1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی (RAPD) 13

1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP) 13

1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشان‌مند از ردیف (STS) 14

1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP) 15

1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌ها 15

1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنوم. 16

1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری.. 16

1-5-1 کراسینگ‌اور نابرابر. 17

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA  در طول رشته (خطاهای همانند‌سازی) 17

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده 19

1-6-1 مدل جهش گام به گام. 19

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود. 19

1-7 مارکرهای STR.. 20

1-8 کاربرد مارکرهای STR.. 20

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی.. 20

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث.. 21

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی.. 22

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه. 22

1-8-3-2 ردیابی مجرمین.. 22

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی.. 23

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR.. 25

1-9-1 جمع‌ آوری سلول‌های جنینی از خون مادر 25

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها 26

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک.. 26

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق.. 26

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو. 26

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی.. 26

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی.. 27

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی.. 27

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی.. 27

1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید‌کردن با DNA جستجوگر. 27

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت‌نگاری.. 29

1-10-2 روش پروفایلینگ… 29

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR.. 30

1-12 CODIS چیست؟. 31

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت.. 32

1-14 معرفی استان‏ها 34

1-14-1 استان کرمانشاه 34

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی.. 34

1-14-2 استان یَزد. 35

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی.. 36

1-15 هدف از تحقیق: 37

فصل دوم. 38

2-1 نمونه‌گیری.. 39

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع. 39

2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing. 40

۲-3-1 رسوب‌گذاری با اتانول. 41

2-3-2 تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop. 42

2-3-3 تهیه‌ی Working Stoke. 42

2-4 تست DNA Typing. 43

2-4-1 Multiplex PCR.. 43

 

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing. 44

2-5-1 آزمایش DNA Typing. 44

2-5-2 جداسازی قطعات.. 45

2-5-2-1 تجهیزات لازم. 45

2-5-2-2 آماده‌سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات.. 46

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات.. 46

2-6 آنالیز داده‌ها 47

3-1 نمونه‏ها 53

3-2 پروفایل ژنتیکی.. 53

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ها 55

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه 56

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‌های یزد. 60

فصل چهارم. 65

4-1 بحث.. 66

4-2 نتیجه‏گیری.. 73

4-3 پیشنهادات.. 73

منابع انگلیسی.. 74

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………….75

 

 

 

فهرست جداول

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی ]10[ 7

جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABI 33

جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز‌کننده گلبول‌های قرمز) 39

جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز‌کننده گلبول‌های سفید) 40

جدول 2-3 ترکیبات TE. 40

جدول 2-4 شرایط PCR.. 45

جدول ۲-5 تنظیمات دستگاه ABI3130 در جداسازی قطعات STR.. 46

شکل2-4 چگونگی عملکرد دستگاه الکتروفورز موئینه‌ای[26] 47

جدول 2-6 مواد فلورسنت موجود در کیت ABI و رنگهایشان. 48

شکل2-5 مواد مختلف در طول موج‌های متفاوتی نور خود را ساطع می‌کنند[26] 48

جدول 2-7 ماده فلورسنت مورد استفاده برای هر جایگاه[25] 49

شکل3-1 پروفایل ژنتیکی یک فرد. 54

جدول3- 2 فراوانی آللی و سایر پارامترهای جمعیتی و پزشکی‌قانونی در جمعیت یزد را نشان می‏دهد. 60

جدول 4-1 مقایسه جمعیت کرمانشاه با سایر جمعیت‏ها 67

جدول 4-2 مقایسه جمعیت یزد با سایر جمعیت‏ها 68

 

 

 

فهرست شکل‌ها

شکل 1-2 کراسینگ‌آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف‌شدگی یا الحاق می‌شود]23.[. 17

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد [23]. 18

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد [62]. 21

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای  STR[26]. 23

شکل 1-6 مراحل انگشت‌نگاری ژنتیکی [38]. 28

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ  DNA[36]. 30

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم‌های انسان[25]. 32

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه [44]. 35

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد[45]. 36

شکل2-2 استفاده از Multiplex PCR در روش پروفایلینگ[36] 44

شکل 2-3 دستگاه الکتروفورز موئینه ای[51] 46

شکل 2-6ladder به‌کاررفته در کیت ABI[25] 50

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی میان سیزده جمعیت مختلف[46] 71

شکل 4-2.درخت فیلوژنتیکی میان نه جمعیت مختلف[46] 71

 

 

 

فهرست نمودار‌ها

نمودار3-1 پارامترهای ژنتیکی جمعیت استان کرمانشاه برحسب درصد. 60

نمودار3-2 پارامترهای ژنتیک جمعیت استان یزد برحسب درصد. 64

 

 

 

چکیده

بررسی تنوع ژنتیکی اقوام ایرانی با بهره گرفتن از STR   مونا داودبیگی

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با بهره گرفتن از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان‌دهنده‏ی همسان‌بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان‌بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع‌ ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر‌خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با بهره گرفتن از کیت  ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان‌دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433  در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی‌قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن‌تری بود که این مسئله می‏تواند به‌علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

کلمات کلیدی: توالیهای کوتاه تکراری، نشانگرهای مولکولی، ژنتیک جمعیت

 

 

 

Abstract

Genetic variation in two Iranian population with STR   Mona Davood Beigi

In recent years studying genetic variation among population by determination of allele frequencies and genetic parameters became a new method that it has been done in different population all around the world. By using this method lots of similarities has been founded among population around the world. These similarities represent the same genetic pool and also it may show the same population in the past as well. So it seems that different population were one at the first and  geographical situations or migrations were the reasons that caused its separation.

Studying short tandem repeats (STR) in genome is the best way to founding genetic variation in population. The aim of this study was to investigate the genetic variation of two population of Iran, Yazd and Kermanshah people.

For this purpose the genetic profile of 50 unrelated individual from each population prepared by using ABI kit. This kit contains fifteen str loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA) and also amylogenin gene for sex determination. The result showed all the loci were in Hardy Weinberg equilibrium except two loci(D19s433 , D2s820) in Kermanshah and three loci (D19s433, D21s11 and VWA) in Yazd population. More over forensic parameters including PIC, PD, PE and MP have been calculated. After all the results have been compared with other population in neighbor countries.

This study revealed that these loci were the suitable loci for identification people and studying genetic population variation. Also the comparison showed that both of Yazd and Kermanshah people were similar to Turkish genetically, but were different from other countries. In addition Yazd has more homogeneous population than Kermanshah, that it could be due to pristine gene pool of this population in the past centuries.

Keywords: Short tandem repeats; Microsatellite markers; Population genetic

مقدمه

درگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای[1] ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری[2] موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین

چکیده

پیش زمینه: با مطالعات بر روی دوقلوها می توان به نقش عوامل ژنتیکی در اسکیزوفرنی پی برد. اسکیزوفرنی را می توان یکی از مخرب ترین اختلالات روانی برشمرد. افراد مبتلا، رفتارهایی خشن بروز می دهند. اکسی توسین نقش بسزایی در بروز رفتارهای اجتماعی_احساسی دارد. در مطالعه حاضر، هدف ما یافتن رابطه ای بین پلی مورفیسم ژن گیرنده اکسی توسین و خطر ابتلا به اسکیزوفرنی بود.

روش ها: در این مطالعه، DNA از نمونه های خون 200 فرد بیمار و سالم جداسازی شده و دو پلی مورفیسم rs2254298 و rs53576 از ژن گیرنده اکسی توسین را با بهره گرفتن از تکنیک PCR-RFLP مورد بررسی قرار دادیم.

نتایج: در این پژوهش اختلاف معناداری بین دو جایگاه پلی مورفیسم ژن گیرنده اکسی توسین(OXTR) و خطر ابتلا به اسکیزوفرنی مشاهده نشد.

نتیجه گیری: در این پژوهش، نتایج ما نشان می دهد که رابطه ی معناداری بین این دو SNP و خطر ابتلا به اسکیزوفرنی وجود ندارد و بنابراین پیشنهاد می گردد که جایگاه های بیشتر این گیرنده مورد بررسی قرار گیرد.

کلمات کلیدی: اسکیزوفرنی، پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی(SNP)، ژن گیرنده اکسی توسین(OXTR).

 

 

فهرست مطالب

 

عنوان                                                                                                                                       صفحه

فصل اول: مقدمه………………………………………………………………………………………………                              1

1ـ1ـ مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………….                            2

فصل دوم: بر منابع………………………………………………………………………………….                             4

2ـ1ـ تعریف اسکیزوفرنی………………………………………………………………………………………………………..                            5

2ـ2ـ تاریخچه………………………………………………………………………………………………………………………….                            5

2ـ3ـ اپیدمیولوژی…………………………………………………………………………………………………………………..                            5

2ـ4ـ علائم………………………………………………………………………………………………………………………………                            5

2ـ4ـ1ـ علائم مثبت………………………………………………………………………………………………………………..                            6

2ـ4ـ2ـ علائم منفی…………………………………………………………………………………………………………………                           6

2ـ4ـ3ـ نقائص شناختی…………………………………………………………………………………………………………..                           6

2ـ5ـ انواع اسکیزوفرنی……………………………………………………………………………………………………………..                           6

2ـ6ـ اتیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………………                          7

2ـ7ـ وراثت پذیری و اثرات محیطی…………………………………………………………………………………………                          7

2ـ8ـ هیپوکامپ در اسکیزوفرنی……………………………………………………………………………………………….                          7

2ـ9ـ اکسی توسین و گابا در اختلال اسکیزوفرنی……………………………………………………………………                          7

2ـ10ـ اکسی توسین و متابولیک ایمنی اسکیزوفرنی……………………………………………………………….                          8

2ـ11ـ  هورمون…………………………………………………………………………………………………………………………                          9

2ـ11ـ1ـ انواع هورمون…………………………………………………………………………………………………………….                           9

2ـ11ـ2ـ نحوه انتقال هورمون در خون…………………………………………………………………………………..                           9

2ـ11ـ3ـ نحوه تاثیر هورمون ها………………………………………………………………………………………………                           9

2ـ11ـ4ـ غده هیپوفیز……………………………………………………………………………………………………………..                         10

2ـ12ـ ویژگی های عمومی اکسی توسین……………………………………………………………………………….                         10

2ـ13ـ نقش اکسی توسین……………………………………………………………………………………………………….                         11

2ـ14ـ کنترل ترشح اکسی توسین………………………………………………………………………………………….                         11

2ـ15ـ توزیع و نقش گیرنده های اکسی توسین……………………………………………………………………..                         12

2ـ16ـ فعال سازی سیگنالینگ PKC از طریق Gـ پروتئین……………………………………………………                        13

فصل سوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………..                          15

3ـ1ـ جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………..                         16

3ـ2ـ نمونه

 گیری………………………………………………………………………………………………………………………                        16

3ـ3ـ مواد و محلول های مورد نیاز برای انجام استخراج………………………………………………………….                        16

3ـ4ـ مراحل استخراج……………………………………………………………………………………………………………….                        17

3ـ5ـ واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)………………………………………………………………………………..                        18

3ـ6ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 ژن OXTR……………………………………………………………                         19

3ـ7ـ فرایند انجام واکنش PCR……………………………………………………………………………………………….                        19

3ـ7ـ1ـ  مواد و وسایل مورد نیاز برای انجام PCR…………………………………………………………………….                      19

3ـ7ـ2ـ محلول های مورد نیاز برای واکنش PCR……………………………………………………………………                       20

3ـ7ـ3ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….                        20

3ـ7ـ4ـ مراحل انجام PCR……………………………………………………………………………………………………….                       21

3ـ8ـ RFLPـPCR…………………………………………………………………………………………………………………….                       22

3ـ8ـ1ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام RFLP………………………………………………………………….                       23

3ـ8ـ2ـ آنزیم BsrӀ……………………………………………………………………………………………………………………                        23

3ـ8ـ3ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….                        23

3ـ9ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز…………………………………………………………………                       24

3ـ9ـ1ـ مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………….                        24

3ـ9ـ2ـ تهیه ژل آگارز 3 درصد…………………………………………………………………………………………………                       24

3ـ10ـ بررسی پلی مورفیسم rs53576…………………………………………………………………………………..                         25

3ـ10ـ1ـ آنزیم BamHӀ……………………………………………………………………………………………………………                       25

3ـ10ـ2ـ روش کار……………………………………………………………………………………………………………………..                       26

3ـ11ـ آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………..                       26

فصل چهارم: نتایج……………………………………………………………………………………………….                        27

4ـ1ـ اطلاعات بیماران و افراد سالم……………………………………………………………………………………………                       28

4ـ2ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 در ژن گیرنده اکسی توسین…………………………………..                        29

آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………                      30

4ـ3ـ بررسی پلی مورفیسم برای (A/G) ژن OXTR…………………………………………………………………                     32

4ـ3ـ1ـ آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………………………….                      33

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری و ارائه پیشنهادات………………………………………………….                      34

5ـ1ـ بحث……………………………………………………………………………………………………………………………………..                     35

5ـ2ـ پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………                     37

مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..                      38

 

 

 

 

فهرست جدول ها

عنوان جدول                                                                                                                            صفحه

جدول 3-1 مشخصات پرایمر برای جایگاه rs2254298 …………………………………………                        19

جدول 3-2 مقدار مواد مورد نیاز برای ساخت مخلوط PCR…………………………………….                        20

جدول 3-3- شرایط دمایی مورد نیاز PCR و پرایمرها……………………………………………………………..                       22

جدول 3-4-اندازه باندهای ایجاد شده توسط BsrӀ در پلی مورفیسم rs2254298……………                        23

جدول 3-5-مواد مورد نیاز برای برش مورد نظر  در جایگاه  rs2254298……………………..                        23

جدول 3-6- مشخصات پرایمر برای جایگاه rs53576……………………………………………                        25

جدول 3-7- اندازه باندهای ایجاد شده توسط BamH Ӏ در پلی مورفیسم rs53576…………                        26

جدول 3-8- مواد مورد نیاز مختص rs53576…………………………………………………….                        26

جدول 4-1- مشخصات دموگرافیک گروه های بیمار و کنترل………………………………………………….                       28

جدول 4-2- بررسی P-value ویژگی های دموگرافیک در دو گروه بیمار و کنترل…………………                      29

جدول 4-3-مقایسه فراوانی ژنوتیپی در پلی مورفیسم rs2254298…………………………….                        31

جدول 4-4-مقایسه فراوانی ژنی در پلی مورفیسم rs2254298…………………………………                        31

جدول 4-5- مقایسه فراوانی ژنوتیپی در پلی مورفیسم rs53576……………………………….                       33

جدول 4-6- مقایسه فراوانی ژنی در پلی مورفیسم rs53576…………………………………….                       33

 

 

فهرست شکل ها

عنوان شکل                                                                                                                              صفحه

شکل 2ـ1ـ جایگاه ژنومی OXTR………………………………………………………………………..                                      11

شکل 2ـ2ـ مسیر سیگنالینگ PKC……………………………………………………………………                                     14

شکل 3ـ1ـ DNA استخراج شده از نمونه های خون بر روی ژل آگارز 1%………………………                              18

شکل 4ـ1ـ تصویر ژل آگارز %3 برای پلی مورفیسم rs2254298………………………..                                30

شکل 4ـ2ـ تصویر ژل آگارز %3 برای پلی مورفیسم rs53576……………………………………….                               32

 

 

 

فهرست علائم

 

علامت                        نشانه

SZ                           اسکیزوفرنی

nm                          نانومتر

ml                          میکرولیتر

M                          مولار

g/ml                        میکرولیتر بر گرم

nM                         نانومولار

w/v                         حجمی ـ وزنی

v/                           حجمی ـ حجمی

bp                         جفت باز

Min                         دقیقه

های صفراوی در بیمارستان الزهرا (س) اصفهان

چکیده

یکی از علت های شکست و عدم موفقیت در تکنیک های کمک باروری(ART) قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی است، که ممکن است با انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد به وجود آید. لذا در این مطالعه میزان قطعه قطعه شدن و آپوپتوز DNA اسپرم انسانی بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوباسیون به وسیله تست SCD و تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

در این مطالعه آینده نگر، بیست ویک نمونه ی اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. برای بررسی مورفولوژی اسپرم از رنگ آمیزی  Papanicolaou و قابلیت حیات اسپرم از رنگ آمیزی Eosin-Nigrosin  استفاده شد. نمونه ها در دمای 37 درجه سانتی گراد بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوبه شدند. قطعه قطعه شدن DNA در فواصل زمانی مختلف (3،2،1،0 ساعت) با بهره گرفتن از تست SCD مورد بررسی قرار گرفت. اسپرم های دارای هاله بزرگ و متوسط، DNA سالم داشتند و اسپرم هایی که دارای هاله کوچک و بدون هاله بودند DNA قطعه قطعه شده داشتند. میزان آپوپتوز نیز به وسیله تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

میانگین مورفولوژی نرمال و حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up  53/2±33/72 و 02/1±10/90 بوده است. میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به میزان معنی داری افزایش یافت بعد از دو ساعت (935/0±81/8، 004/0 P=) و بعد از سه ساعت (894/0±76/10، 0001/0 P=) انکوباسیون نسبت به زمان صفر (809/0±38/4) بوده است. همچنین میزان آپوپتوز DNA اسپرم در زمان دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر  (864/0±19/9، 008/0 P=) و نیز زمان سه ساعت نسبت به زمان یک ساعت ( 7/0±97/10، 002/0 P=) انکوباسیون معنی دار شده است.

در نهایت نتیجه ای که ما به آن دست یافته ایم نشان می دهد که انکوباسیون اسپرم نرمال در دمای 37 درجه سانتی گراد که به روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک های کمک باروری (ART) باید زمانی کمتر از دو ساعت باشد.

واژه های کلیدی:

اسپرم نرمال، قطعه قطعه شدن DNA، انکوباسیون، تست SCD، تکنیک TUNEL.

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          صفحه

فصل اول- مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………….1

1-1- روش های كمك باروری………………………………………………………………………………………………………………….2

1-2- ناباروری……………………………………………………………………………………………………………………………………………5

1-3- تولید اسپرم …………………………………………………………………………………………………………………………………….5

1-4- مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………………………..6

1-4-1- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………….7

1-5- پارامترهای اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………….10

1-5-1- مورفولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………10

1-5-2- تحرک اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………………….12

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم ……………………………………………………………………………………………………….14

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….14

1-5-5- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………………….15

1-5-6- غلظت………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن………………………………………………………………………………………………………18

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………………………………………………………………………18

1-6-2- آپوپتوز سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………..18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ……………………………………………………………………………………………………………………….19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز………………………………………………………………………………………….21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………………………………………………………………..23

1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………………………………………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول……………………………………………………24

1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی ………………………………………………………………………………………………24

1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی …………………………………………………………………………………………..25

1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………………………………………………………25

1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25

1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26

1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی كروماتین……………………………………………………………………………………………27

1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28

1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28

1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29

1-10-  استرس اكسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30

1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روش های کمک باروری…………………..31

1-11-1-  مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31

1-11-2-  مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32

1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33

1-11-4-  سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

1-12-  تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین……………………………………………………………………………………….33

1-12-1-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34

1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35

1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36

 

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36

1-12-1-5- تكنیک SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-6- تست  SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40

فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46

2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47

2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48

2-3-2-1-1-  ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-1-3-  حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48

2-3-2-1-4-  چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55

2-3-3-  Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58

2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم………………………………64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90

منابع

چکیده انگلیسی

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                          صحنه

1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: .. . A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

1-3- تست  SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74

3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                   صفحه

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17

2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77

3-4- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78

3-5- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………………………………………………….79

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                  صفحه