چکیده فارسی…………………………………………………ذ

چکیده انگلیسی……………………………………..ر

1-1 مقدمه…………………………………………… 2

1-2 نشان‌گر چیست؟…………………………………………… 2

1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی……………………………………………. 3

1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک…………………………………………….. 3

1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی……………………………………………. 4

1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA  وRNA…………………………………….

1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR……………………………………..

1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLP………

1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS) …………………………..8

1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها………………………………………….. 9

1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCR…………………………………………….

1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)……………………. 11

1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی (RAPD)…………………… 13

1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)………………………………………. 13

1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشان‌مند از ردیف (STS)…………. 14

1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)………………………. 15

1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌ها………………………………………….. 15

1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنوم……………… 16

1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری……………………………. 16

1-5-1 کراسینگ‌اور نابرابر…………………………………………… 17

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA  در طول رشته (خطاهای همانند‌سازی)…….17

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده………………………………………….. 19

1-6-1 مدل جهش گام به گام…………………………………………… 19

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود…………………………………………… 19

1-7 مارکرهای STR…………………………………………….

1-8 کاربرد مارکرهای STR…………………………………………….

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی……………………………………………. 20

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث……………………………………………. 21

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی……………………………………………. 22

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه…………………………………………… 22

1-8-3-2 ردیابی مجرمین……………………………………………. 22

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی……………………………………. 23

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR…………………………………………….

1-9-1 جمع‌ آوری سلول‌های جنینی از خون مادر……………………………… 25

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها………………………………………….. 26

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک………………………. 26

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق……………………………………………. 26

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو…………………………………………… 26

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی……………………………………………. 26

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی……………………………………………. 27

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی……………………………………………. 27

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی……………………. 27

1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید‌کردن با DNA جستجوگر………. 27

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت‌نگاری……………………………………………. 29

1-10-2 روش پروفایلینگ…………………………………………….. 29

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR…………………………………………….

1-12 CODIS چیست؟…………………………………………… 31

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت……………………………………………. 32

1-14 معرفی استان‏ها………………………………………….. 34

 

 

1-14-1 استان کرمانشاه………………………………………….. 34

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 34

1-14-2 استان یَزد…………………………………………… 35

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 36

1-15 هدف از تحقیق………………………………………….. 37

فصل دوم…………………………………………… 38

2-1 نمونه‌گیری……………………………………………. 39

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع…………………………………………… 39

2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing…………………………..

۲-3-1 رسوب‌گذاری با اتانول…………………………………………… 41

2-3-2 تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop……………………

2-3-3 تهیه‌ی Working Stoke……………………………………………

2-4 تست DNA Typing……………………………………………

2-4-1 Multiplex PCR…………………………………………….

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing…………………………………..

2-5-1 آزمایش DNA Typing……………………………………………

2-5-2 جداسازی قطعات……………………………………………. 45

2-5-2-1 تجهیزات لازم…………………………………………… 45

2-5-2-2 آماده‌سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات………………….. 46

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات……………………………………………. 46

2-6 آنالیز داده‌ها………………………………………….. 47

3-1 نمونه ‏ها………………………………………….. 53

3-2 پروفایل ژنتیکی……………………………………………. 53

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ ها …………………………………………..55

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه…………………………………. 56

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‌های یزد…………………………………………… 60

فصل چهارم…………………………………………… 65

4-1 بحث……………………………………………. 66

4-2 نتیجه ‏گیری……………………………………………. 73

4-3 پیشنهادات……………………………………………. 73

منابع انگلیسی……………………………………………. 74

منابع فارسی……………………………………………75

چکیده:

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با بهره گرفتن از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان‌دهنده‏ی همسان‌بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان‌بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع‌ ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر‌خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با بهره گرفتن از کیت  ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان‌دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433  در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی‌قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن‌تری بود که این مسئله می‏تواند به‌علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه

درگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای[1] ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری[2] موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].

علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به‌کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ،  TPOXو TH01 می‏باشند [1].

هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).

2-1- نشانگر چیست؟

صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:

 1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)

 2-به توارث برسد (2).

3-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی

نشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:

1-نشان‌گرهای مورفولوژیک

2-نشان‌گرهای پروتئینی

3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA

1-3-1- نشان‌گرهای مورفولوژیک

کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).

معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک

– اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.

– تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.

– فراوانی و تنوع کمی دارند.

– گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.

– اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).

2-3-1- نشان‌گرهای پروتئینی 

در دهه 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA  بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم[1]/آلوزایم[2] اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:

– محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛

– تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛

– محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛

– پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).

اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).

[1] Ayzozyme

[2] Allozyme

فهرست مطالب:

فصل اول: کلیات تحقیق………………………….. 1

1-1-1) جنس هلیکوباکتر…………………………. 3

1-1-2) عوامل حدت هلیکوباکتر پیلوری…………………………. 5

1-1-3) پروتیین های شوک حرارتی هلیکوباکتر پیلوری………… 7

1-1-4) هلیکوباکتر هپاتیکوس………………………….. 8

1-1-5) هلیکوباکتر بیلیس…………………………… 10

1-1-6) هلیکوباکتر پولوروم………………………… 11

1-2)کیسه صفرا و مجاری صفراوی…………………………. 12

1-2-1) فیزیولوژی تشکیل و جریان صفرا …………………………12

1-2-2) ترشح صفرا و ترکیب آن…………………………. 13

1-2-3) اسیدهای صفراوی…………………………. 14

1-2-5) کیسه صفرا و اعمال اسفتکتری…………………………. 16

1-3) بیماری‌های کیسه صفرا………………………… 17

1-3-1) سنگ‌های کیسه صفرا………………………… 17

1-3-3) سنگهای کلسترولی و لجن صفراوی………………………….19

1-3-4) ریسک فاکتور ها………………………… 23

1-3-4-1) سن و جنسیت………………………….. 23

1-3-4-2) نژادی و جغرافیایی…………………………. 23

1-3-4-3) محیط………………………….. 23

1-3-4-4) اختلالات اکتسابی…………………………. 24

1-3-4-5) ارث………………………….. 24

1-3-5) لجن صفراوی…………………………. 24

1-3-6)سنگ کلسترولی…………………………. 26

1-3-6-1) سنگ‌های پیگمانی…………………………. 26

تشخیص…………………………… 27

1-3-7) علائم بیماری سنگ کیسه صفرا…………………………. 28

1-3-7-1) سیر طبیعی…………………………. 29

درمان…………………………. 30

1-3-7-2) درمان جراحی…………………………. 30

1-3-7-3) درمان طبی- حل کردن سنگ کیسه صفرا …………………………31

1-3-8) کله سیستیت حاد …………………………32

1-3-8-1) مورفولوژی…………………………. 35

1-3-8-2) خصوصیات بالینی کوله سیستیت حاد …………………………36

1-3-8-3) کله سیستیت بدون سنگ…………………………… 36

1-3-9) کله سیستوپاتی بدون سنگ…………………………… 37

1-3-10) کله سیستیت آمفیزماتو…………………………. 38

1-3-11-1) کله سیستیت مزمن…………………………. 38

1-3-11-2) مرفولوژی…………………………. 40

1-3-11-3) خصوصیات بالینی کوله سیستیت مزمن………………………… 40

1-3-11-4) خصوصیات بالینی تشخیص کوله سیستیت حاد و مزمن………. 40

1-4) اختلالات مجاری صفراوی خارج کبدی………………………….41

1-4-1) کوله دوکولیتاز و کلانژیت صعودی…………………………. 41

1-4-2) آترزی صفراوی خارج کبدی…………………………. 42

1-4-2-1) سیر بالینی…………………………. 43

1-4-3) تومورها………………………… 43

1-4-3-1-1) سرطان کیسه صفرا………………………… 43

1-4-3-1-2)مورفولوژی………………………… 44

1-4-3-1-3) خصوصیات بالینی…………………………. 44

1-4-3-2) کارسینوم مجاری صفراوی خارج کبدی، از جمله آمپول واتر……45

1-4-3-2-1) مورفولوژی…………………………. 45

1-4-3-2-2) خصوصیات بالینی…………………………. 46

فصل دوم: سوابق مربوط………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روشها………………………… 65

3-1) چکیده روش تحقیق………………………… 66

3-1-2) جامعه مورد مطالعه………………………… 67

3-1-3) منطقه مورد پژوهش…………………………… 68

3-1-4) روش نمونه گیری…………………………. 72

3-2-1) آماده سازی  سنگ صفرا برای استخراج  DNA………………

3-2-2) آماده سازی  لایه مخاطی کیسه صفرا برای استخراج  DNA……..

3-2-3) آماده سازی مایع صفراوی برای استخراج  DNA………………….

3-3) روش استخراج DNA  به روش کیت سینا ژن…………………….. 75

3-4) واکنش زنجیره ای پلیمرازی…………………………. 76

3-4-1)مواد………………………… 77

3-4-1-1) میكروتیوب ها و نوك سمپلرها………………………… 77

3-4-1-2) محلول بافری PCR  با غلظت 5X…………………………..

3-4-1-3) Mgcl 2…………………………

 

 

3-4-1-4) Kcl …………………………

3-4-1-5) Tris Hcl…………………………

3-4-1-6) مخلوط نوكلئوزیدها (dNTPs) …………………………78

3-4-1-7) Taq DNA polymerase………………………….

3-4-1-7-1) DNA polymerase Smart…………………………

3-4-1-8) پرایمرها …………………………79

3-4-1-9) سایز ماركر…………………………. 80

3-4-1-10) اتیدیوم بروماید…………………………. 81

3-4-1-11) Loading Buffer…………………………

3-4-1-12) ژل آگاروز …………………………81

3-4-2) مواد لازم برای تهیه  TBE 1X…………………………..

3-4-2-1) طرز تهیه بافر TBE 1X…………………………..

3-4-3) نرم افزارهای مورد استفاده………………………… 82

3-9) ژل الكتروفورز محصولات PCR…………………………..

3-10) کشت هلیکوباکتر…………………………. 91

3-11-1) بررسی میزان IgG هلیکوباکتر پیلوری در سرم خون……….. 92

3-11-2) شیکر الیزا………………………… 95

3-11-3) شوینده الیزا………………………… 96

3-11-4) خواننده الیزا………………………… 97

3-11-5) مراحل انجام آزمون الیزا که تقریبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از…98

3-11-6) روش کار با کیت Monobind Anti-H. Pylori IgG…………………………..

3-11-7) مراحل انجام آزمایش H. Pylori IgG…………………………..

فصل چهارم: نتایج………………………….. 102

4-1 ) نتایج مربوط به افراد مورد مطالعه در این پژوهش………………. 103

4-2) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت مزمن……. 114

4-3) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در بیماران کله سیستیت حاد………. 116

4-4) نتایج مربوط به حضور ژن hsp60 در مایع صفرا گروه شاهد………………. 118

4-5) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی تست IgG هلیکوباکتر……………. 121

4-6) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی BMI…………………………

4-7) نتایج مربوط به ژن 16s rRNA هلیکوباکتر بیلیس………………………… 131

4-8)  نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر هپاتیکوس…………… 133

4-9) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پولوروم…………… 133

4-10) نتایج مربوط به میزان فراوانی نسبی هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم در سنگ کیسه صفرا در بیماران کله سیستیت مزمن………………………… 133

4-11) نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر…………………………. 133

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………………………….. 134

پیشنهادات………………………….. 148

منابع…………………………. 149

چکیده:

زمینه و هدف: سنگ کیسه صفرا یکی از علت های عمده جراحی دستگاه گوارش بوده، علاوه بر این، میزان بیماری های صفراوی و سنگ کیسه صفرا به تدریج رو به افزایش است. اخیرا، نویسندگان متعددی، گزارشاتی مبنی بر حضورDNA  هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر های مقاوم به صفرا در درخت صفراوی انسان و کلونیزاسیون در دستگاه صفراوی حیوانات داشته اند. در حال حاضر هدف از این بررسی، طراحی مطالعه مورد-شاهدی برای برسسی حضور گونه های هلیکوباکتر، به خصوص هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم، در سنگ، مایع و بافت بیماران مبتلا به بیماری های صفراوی و مایع صفرای بیماران غیر مبتلا به بیماری های صفراوی در بیمارستان الزهرا(س) بوده است.

مواد و روش ها: سرم خون و مایع صفرای 25 بیمار غیر مبتلا به بیماری های صفراوی تحت کلانژیوپانکرانوگراف برگشتی، به عنوان گروه شاهد جمع آوری گردید. سرم خون، مایع، سنگ و بافت کیسه صفرای 52 بیمار تحت کله سیستکتومی لاپراسکوپی، به عنوان گروه مورد جمع آوری گردید؛ از این بین 24 مورد کله سیتیت حاد و 28 مورد کله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هر سه گروه از لحاض ترکیب سن و جنس قابل مقایسه می باشند. در این نمونه ها، حضور هلیکوباکتر پیلوری بوسیله پرایمر اختصاصی ژن hsp60 ، و پرایمر اختصاصی 16s rRNA برای DNA هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکو باکتر پولوروم بوسیله واکنش های زنجیره ای پلیمرازی مورد ارزیابی قرار گرفت. مایع صفرا در محیط کشت مایع وجامد R (توصیف شده توسط ریچارد و همکاران) کشت داده شد. سرم های خون برای بررسی کمی ایمونوگلوبولین G هلیکوباکتر پیلوری بوسیله تست الیزا مورد ارزیابی گرفت.

نتایج:

21 از 24 (87.5 ٪) بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت حاد و 25 از28 مورد (89.2 ٪) در بیماران مبتلا به بیماری های کوله سیستیت مزمن ، و 20 از 25 (80 ٪) نفر در گروه شاهد، نشان دهنده افزایش سطح ایمونوگلوبولین G خاص هلیکوباکتر پیلوری بوده اند.

به ترتیب DNA هلیکوباکتر پیلوری در 6 از 24 (25 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت حاد و 2 از 28(7%) مایع صفرا کوله سیستیت و 1 از 24 (4.2 ٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت حاد و 1 از 28 (3.5٪) مخاط کیسه صفرا کوله سیستیت مزمن مزمن تشخیص داده شد. DNA هلیکوباکتر bilis در 1از 24(4.2%)مایع صفرا کوله سیستیت حاد، و 1 از 28 (3.5 ٪) مایع صفرا کوله سیستیت مزمن تشخیص داده شد. هیچ گونه هلیکوباکتر از کشت صفرا بدست نیامد. تمامی نمونه های استخراج شده DNA از لحاظ هلیکوباکتر هپاتیکوس و هلیکوباکتر پولوروم منفی می باشد. تمامی DNA های استخراج شده از مایع صفرای گروه کنترل از لحاظ هلیکوباکتر پیلوری، هلیکوباکتر هپاتیکوس، هلیکوباکتر بیلیس و هلیکوباکتر پولوروم منفی بوده اند. تمامی DNA استخراج شده از سنگ صفرا از لحاظ حضور ِDNA هلیکوباکتر منفی بوده ند.

نتیجه گیری:

نتایج این مطالعه نشان دهنده حضور DNA هلیکوباکتر پیلوری و هلیکوباکتر بیلیس در کیسه صفرا بیماران مبتلا به کله سیستیت حاد و مزمن بوده، و ارتباط احتمالی بین DNA هلیکوباکتر یافت شده با بیماری های صفراوی وجود دارد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1-1- جنس هلیکوباکتر

جنس هلیکوباکتر جزء باکتری های گرم منفی با سرعت رشد بالا در بین میکروارگانیزم های گرم منفی است که توانایی مهاجرت مداوم در بین میزبانان متنوع در PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران را دارا می باشد و در برخی موارد ممکن است باعث بیماری سخت بالینی همچون سرطان شود، در این بین بیشترین مطالعه  تا کنون بر روی هلیکوباکتر پیلوری[1] صورت گرفته است که عامل ایجاد زخم معده و سرطان معده در انسان می باشد[1]، اهمیت بالینی جنس هلیکوباکتر با توجه به در معرض آلودگی قرار داشتن بیش از نیمی از جمعیت بشری جهان در برابر گونه هلیکوباکتر پیلوری امروزه بسیار روشن بوده،امروزه این جنس به طور رسمی حداقل شامل32  نام گونه می باشد[2]، این جنس را تقریبا می توان به دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و هلیکوباکترهای انتروهپاتیک[2] تقسیم کرد[3, 4].  برخی از  گونه های هلیکوباکتر معده ای  بیشتر از هر میکرو ارگانیسم شناخته شده دیگری دارای فعالیت قوی اوره آزی بوده و از آن برای زنده ماندن و مدیریت فشار وارد شده توسط اسید معده استفاده می کنند[1, 5, 6]. هلیکوباکتر های انتروهپاتیک به طور معمول در مخاط معده کلونیزه نمی شوند ،اما دارای ویژگی های مشابه فراساختاری و فیزیولوژی مشابه ی با گونه های معده ای می باشند، تا به امروز این عوامل باکتریایی در دستگاه گوارشی و کبد انسان ،PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و پرندگان جدا و شناسایی شده اند[4, 7, 8]. در مجموع اطلاعات بدست آمده از مطالعات انجام شده در بیماری های صفراوی ، نشان می دهد که صفرا حاوی گونه هلیکوباکتر، ممکن است عفونت مزمن با دگرگونی بدخیم القاء کنند. این که آیا آنها واقعا در پیدایش بیماری صفراوی شرکت دارند نیاز به مطالعات بیشتر را می طلبد ، با این حال در برخی بررسی ها شواهدی مبنی بر حضور هر دو گروه هلیکوباکتر های معده ای و روده ای در صفرای بیماران صفراوی می باشد[9, 10].

هلیکوباکتر پیلوری، باکتری  باسیل گرم منفی مارپیچی[3]، دارای فرم خمیده و میکروائروفیلیک بوده که به عنوان مهمترین پاتوژن معده انسان شناخته شده، وارن و مارشال[4] برای اولین بار این باکتری را در سال 1983 جداسازی و خالص سازی نمودند،[11]، دو فرم مرفولوژیک باسیل مارپیچی و کوکوئید[5] برای این باکتری شناخته شده است، فرم باسیل مارپیچی این باکتری، فرم فعال و قابل کلونیزاسیون این باکتری بوده، فرم کوکوئید در واقع فرم  موجود  اما غیر قابل کشت این باکتری بوده، و بیشتر به فرم در حال استراحت هلیکوباکتر پیلوری مشهور است[12, 13]، علی رغم اثبات حضور فرم کوکوئید هلیکو باکتر پیلوری، تلاش های بسیار برای کشت آن تا کنون نتیجه مطلوب نداشته است، از این رو این موضوع خود به تنهایی بسیار مورد بحث پژوهشگران بوده ، اعتقاد برخی محققان بر این استوار می باشد که فرم کوکوئید این باکتری فرم مرده بوده،[14, 15]؛ و در مقابل برخی از محققان دیگر اعتقاد داشته که این فرم از باکتری زنده بوده و در حال حاضر امکان کشت آن با تکنیک ها و روش های موجود وجود ندارد[13, 16, 17]. تغییر فرم مورفولوژیک از باسیل مارپیچی به کوکوئید را می توان بوسیله کشت مجدد در محیط کشت با شرایط غذایی ضعیف، کشت همراه با استرس همچون آنتی بیوتیک و اکسیژن، و یا استرس کاهش pH و یا افزایش دما مشاهده کرد[18] . فرم باسیل مارپیچی باکتری هلیکوباکتر پیلوری به نسبت فرم کوکوئید آن مقدار بسیار زیادی از پروتیین های مختلف را بیان می کند، که به عنوان مثال می توان به پروتیین های موثر در تکثیر سلولی و ساختمان سلولی، پروتیین های موثر در اتصال یا چسبنده ها[6]  و پروتیین های موثر در کلونیزاسیون باکتری اشاره کرد، اما در فرم کوکوئید، بیان پروتیین ها به طور معنا داری کاهش پیدا کرده و بیشتر به حفاظت از  فعالیت های متابولیک باکتری همچون تنفس سلولی، حفظ ساختار کلی سلول و سنتز DNA محدود میگردد[14, 19, 20].   بنابراین به طور گسترده این اعتقاد وجود داشته که فرم کوکوئید این باکتری نقش به سزایی در انتقال و گسترش عفونت با هلیکو باکتر پیلوری یا پاسخ های متفاوت و ناکارامد سلول در برابر عفونت با این باکتری بوده[16, 21-23] و از آن سو نقش عمده فرم باسیل مارپیچی این باکتری در بیماری زایی و بیان عوامل حدت[7] می باشد .

Chunhong Shao  و همکارانش برای اولین بار پاسخ هلیکوباکتر پیلوری را به شرایط اسیدی متفاوت  مایع صفرای انسان را بررسی نمودند، توانایی تحمل این شرایط  برای کلونیزاسیون این باکتری در دستگاه گوارش انسان بسیار با اهمیت است؛ نتایج حاصل از این تحقیق نشان دهنده مسیر های پیچیده پیام دهی برای تحمل این شرایط بوده، نتایج این تحقیق نشان دهنده تغییر در بیان و فرم برخی از پروتیین ها از قبیل چاپرون ها، پروتیین های موثر در جابجایی آهن، آنزیم های موثر در چرخه تولید انرژی، متابولیسم و پروتیین های فلاژلا بوده است.[24]

2-1-1- عوامل حدت هلیکوباکتر پیلوری

اوره آز خودش به تنهایی کموتاکسی فاگوسیت ها را باعث می شود و سلول های ایمنی را فعال می کند و محصولات سیتوتوکسین را افزایش می دهد. اتصال هلیكوباكتر پیلوری به اپتیلیوم معده و ترشح اینترلوكینها یک مرحله مهم در القاء التهاب فعال لایه مخاطی می باشد كه می تواند به تولید زخم منجر شود. سیتوتوكسین واكوئله كنندهA[1]  (vac A) به کلنیزه شدن هلیکوباکتر پیلوری در مخاط  كمك می كند كه به نظر می رسد نتیجه آن تعدیل سیستم ایمنی میزبان باشد [25]. پلی مرفیسمهای موجود در ژن سایتوكاینها ی میزبان نیز ممكن است كه عامل مهمی در مقدار سایتوكاینها ی تولیدی و در نتیجه تفاوت در الگو و شدت پاسخهای التهابی باشند[26].براساس تنوع ژنتیكی ممكن است كه این پلی مرفیسمها از یک نا حیه جغرافیایی به ناحیه دیگر متفاوت باشند كه می تواند احتمال حضور ژنوتیپهای خاص در جمعیت های مناطق خاص جغرافیایی كه آنها را نسبت به عفونت با سوش هلیكوباكترپیلوری دارای ژن  vacA مستعد می سازد را توضیح دهد. در میان عوامل بیماریزای هلیکو باکتر پیلوری،عامل اتصال به سلول های پوششی برای شروع پاسخ التهاب ضروری است.[27, 28] برخی از سویه های هلیکوباکتر پیلوری ،دارای یک ناحیه پاتوژنیسیته 40k bp به نام جزیره بیماریزایی[2] cag هستند که حاوی 31 ژن بوده و تولید و تجمع سیستم ترشحی تیپ IV را هدایت می کند.در مدل های حیوانی سویه هایی که جزیره پاتوژنیسیتی cag  را دارند، از سویه های فاقد این جزیره بیماریزا تر می باشند.[29]   برخی بررسی ها نشان داده است که سویه های دارای ژن cagA از قدرت بیماریزایی بیشتری برخوردار می باشند[30] ، سویه های cagA مثبت باعث القای سیتوتوکسیتی بیشتری  نسبت به سویه های فاقد این ژن می باشند[31] ، سویه های cagA مثبت می توانند باعث تولید IL-8[3] شوند[32] ،همچنین پروتیین CagA یک مولکول ایمونولوژیک می باشد که به عنوان یکی از کاندید های ساخت واکسن علیه باکتری هلیکوباکتر پیلوری مطرح است[33] ، همچنین پروتیین CagA پس از ورود به سلول میزبان باعث تغیرات ساختار اکتین و اختلال در سیکل سلولی ،القای بیان انکوژن های c-fos  و  c-jun و در نهایت آسیب سلولی می شود و خطر ایجاد سرطان را افزایش می دهد[34]. یكی از مهمترین ملكولهای چسبان در هلیكوباكتر پیلوری پروتئین است كه توسط ژن babA2 کد می شود و Blood group bindin antigen نام دارد، تحقیقات متعددی نشان داده است که این مولکول چسبان، عامل اتصال هلیکوباکتر پیلوری به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b می باشد.این آنتی ژن های فوکوزیله شده روی سطح سلول های پوششی معده قرار دارند، پروتیین Bab A یکی از پروتیین های غشا خارجی هلیکوباکتر پیلوری است،  توانائی اتصال این پروتئین به آنتی ژنهای گروه خونی لوئیس b استقرار باكتری را در معده تسهیل ، و ممكن است مستقیمًا در بیماریزائی نقش داشته باشد[35, 36] ؛ پروتیین Bab A 75 کیلو دالتون وزن دارد،دو آلل ژن bab A شناسایی شده اند که عبارتند از: bab A1 و bab A2 ، از این بین تنها آلل bab A2 فعال بوده و پروتیین Bab A را رمز دهی می نماید. [37] طبق تحقیقات صورت گرفته، مشخص شده است كه بین وجود این ژن و بعضی بیماریهای دستگاه گوارش از جمله زخم اثنی عشر ارتباط وجود دارد. [38-41]

3-1-1- پروتیین های شوک حرارتی هلیکوباکتر پیلوری

در بررسی های صورت گرفته پیرامون پروتیین های شوک حرارتی در هلیکوباکتر پیلوری ، پروتیین های مختلفی از قبیل 58.2 kDa – Hsp60  [42]،13 kDa – HspA ، [43]، 70 kDa – Hsp70 [44]، شناسایی شده اند که در این بین بیشتر Hsp60 بیشتر مورد توجه اندیشمندان این حوزه بوده است و تحقیقات بیشتری مبنی بر نقش آن در هلیکوباکتر پیلوری صورت گرفته است.

نقش Hsp60 هلیکوباکتر پیلوری در فولدینگ پروتیین ها و جابجایی چاپرون ها نشان داده شده است؛ همچنین به عنوان یکی از عوامل موثر در ایجاد عفوت و محرک سیستم ایمنی مطرح می باشد.  Barton و همکارانش در سال 1998 آنتی بادی ضد Hsp60 را در جریان خون بیماران مبتلا به بیماری های مختلف معده و دوازده شناسایی کرده اند . همچنین موارد مثبت به Hsp60 هلیکوباکتر پیلوری به شدت با میزان درجه التهاب در بیماران ارتباط مثبت دارد[45, 46]. برخی بررسی های انجام شده  نشان دهنده نقش Hsp60 در افزایش میزان سایتوکان های مختلف همچون اینترلوکین 6 ،اینترلوکین 8؛ همچنین افزایش سلول های T و گیرنده های  Toll-like همچون TLR-2و TLR-4 می باشد[47, 48] .  برخی بررسی ها نشان دهنده آن است که Hsp60 ممکن است در تحریک پروسه های التهاب زایی در مخاط معده نقش بازی کند.[49]. برخی از محققان بر این باور هستند که Hsp60 هلیکوباکتر پیلوری مسئول پاسخ خود ایمنی میزبان می باشد[50] ؛ همچنین برخی از تحقیقات نشان دهنده دهنده انتقال Hsp60  از سیتوپلاسم به سطح سلول باکتری و نقش موثر آن در اتصال به سلول های اپیتلیال انسان می باشد و Hsp60 سطح باکتری نقش موثری در رشد باکتری دارد. [51, 52]. برخی از گزارشات بر نقش Hsp60 در سازماندهی ساختار خارج سلولی باکتری و یا محافظت پروتیین های دیگر از شرایط بد محیط معده انسان تاکید دارد.[53]

[1] vacuolating toxin A

[2] Pathogenicity island

[3] Interleukin 8

[1] Helicobacter Pylori

[2] Enterohepatic Helicobacter

چکیده:

جنگل­های شمال ایران میراثی به­جا مانده از دوران سوم زمین شناسی است که به علت تخریب و تداخلات شدید، امروزه قسمت عظیمی از مناطق پست آن نابود شده و تنها لکه­هایی از این جنگل­ها باقی مانده است. این لکه­های باقی­مانده به­ویژه در قسمت ­های کم ارتفاع و پست جنگلی در جنوب دریای خزر دارای اهمیت فوق العاده بوده و از ارزش بالای حفاظتی و مدیریتی برخوردار است. نور و سیسنگان دو تکه­ی بزرگ از این جنگل­های پست هستند که مورد تحقیق فلوریستیکی و جامعه ­شناسی قرار گرفتند. گونه­ های گیاهی جمع­آوری شده از این مناطق نشان­دهنده وجود 225 گونه­ گیاهی متعلق به 178 جنس و 76 تیره­ی گیاهی است. Poaceae با 28 گونه، Asteraceae با 18 گونه و Rosaceae با 9 گونه، به ترتیب بیشترین غنای گونه­ای را نشان می­دهند. جنس­های دارای بیشترین تعداد گونه به ترتیب Carex (با 6 گونه)، Veronica (با 5 گونه) و Euphorbia و  Solanum (هر کدام با 4 گونه) می­باشند. به لحاظ طیف شکل زیستی، تروفیت­ها با 2/30%، اشکال­زیستی غالب را تشکیل می­ دهند و به دنبال آن، ژئوفیت­ها (1/27%) و همی­کریپتوفیت­ها (9/20%) قرار دارند. فلور این مناطق، عمدتاً از عناصر چندناحیه­ای با 60 تاکسون (3/27%) و سپس عناصر اروپا-سیبری/ایرانو-تورانی/مدیترانه­ای با 43 تاکسون (5/19%) تشکیل شده است. بر اساس شاخص تشابه سورنسن، برخی شباهت­های فلوریستیکی بین دو جنگل وجود دارد. با جمع­آوری داده ­های جامعه ­شناسی از 55 قطعه نمونه و آنالیز داده ­ها با بهره گرفتن از تکنیک­های TWINSPAN وDCA  در نرم­افزار JUICE، چهار واحد پوششی در این دو منطقه تشخیص داده شد که عبارتند از: Celtis australis–Buxus hyrcana، Fraxinus excelsior subsp. coriariifolia-Cardamine tenera، Populus caspica–Alnus subcordata و Parrotia persica–Carpinus betulus. جنگل­های پست نور و سیسنگان، به­علت فشار فعالیت­های انسانی و چرای دام، در معرض خطر حذف گونه­ های گیاهی و یا تغییر جوامع طبیعی می­باشند.

مقدمه:

گیاهان نقش پایه­ای در شکل­ گیری اکوسیستم­های طبیعی دارند. از این­رو شناخت دقیق گونه­ های گیاهی و اطلاع از تنوع زیستی گیاهی و جوامع گیاهی ما را برای  مدیریت منابع طبیعی كشور یاری خواهد داد.

جنگل­های شمال ایران که به جنگل­های هیرکانی یا خزری معروف­اند، با طول تقریبی 800 کیلومتر، عرض 110 کیلومتر و مساحت کلی 84/1 میلیون هکتار، از منطقه­ تالش در جمهوری آذربایجان در غرب تا پارک ملی گلستان در شرق کشیده شده و پوشش سبزی را در شیب­های شمالی کوه­های البرز ایجاد می­ کند [1، 2]. این جنگل­ها از  سواحل جلگه­ای تا ارتفاع 2700 متر در شیب­های شمالی البرز گسترش یافته­اند و به اقلیم واحد با بارندگی سالیانه (از 600 تا 2000 میلی متر) وابسته­اند و به­نظر می­رسد که با ساختار جنگل­های اروپا-سیبری بسیار سازگار باشند [3، 4].

این ناحیه­ی رویشی یکی از اکوسیستم­های متنوع و جالب از اقلیم­های حیاتی معتدله­ی نیمکره­ی شمالی است. شرایط طبیعی و جغرافیایی این ناحیه، از جمله برخورداری از بارش­های فراوان و منظم و حرارت مناسب، نزدیکی به دریا، وجود کوه­ها، دامنه­های پرشیب و کم­شیب و اختلاف ارتفاع شدید در فواصل کوتاه، منجر به توسعه و آشیان­گزینی اکولوژیک بسیاری از عناصر گیاهی در آن شده است که اجتماعات گیاهی مختلفی را تشکیل می­دهد. در این خصوص تنها بخش کوچکی از ویژگی­های زیستی رویشگاه­ها، جوامع گیاهی و در نتیجه ترکیب فلوریستیکی هریک از آن­ها مطالعه شده و هنوز هم حضور تعدادی از گونه­ ها در اجتماعات جنگلی و محدوده­ انتشار جغرافیایی آن­ها ناشناخته مانده است [5].

در بین سه زون ارتفاعی تعریف شده از جنگل­های هیرکانی (پست، کوهپایه­ای و کوهستانی) [6، 4، 7، 8، 9]، جنگل­های مناطق پست از ارزش بالای حفاظتی و مدیریتی برخوردار بوده و به­نظر می­رسد که برای مطالعات اکولوژیکی و پوشش گیاهی در اولویت باشند چرا که در این مناطق انسان با حذف عناصر طبیعی و جایگزینی عناصر دیگر جوامع آن را تا حد زیادی تغییر داده و یا در معرض نابودی قرار داده است [8]. به علت این تغییر، بسیاری از گونه­ های گیاهی به بقایایی از زیستگاه­های مناطق پست، محدود شده ­اند [10].

پارك­های جنگلی نور و سیسنگان كه به ترتیب در شهرستان­های نور و نوشهر واقع می­باشند،‏ اگرچه در سال­های اخیر مورد تخریب و آسیب شدید توسط دام و انسان قرار گرفته­اند، با این وجود، جزء تنها بقایای جنگل­های پست خزری هستند [11، 8]. با توجه به اهمیت این مناطق، شناخت و بررسی رویش­های طبیعی آن حائز اهمیت است.

تنوع زیستی تنها به مجموعه ­ای از گونه­ ها اشاره ندارد، بلکه به عنوان تغییرات میان ارگانیسم­های زنده در تمام منابع خشکی، دریایی و دیگر اکوسیستم­های آبی تعریف می­ شود. براساس تعریف دبیرخانه­ی کنوانسیون تنوع­زیستی، تنوع­زیستی به معنای قابلیت تمایز بین ارگانیسم­های زنده از هر منبع شامل اکوسیستم­های زمینی، دریایی و اکوسیستم­های آبزی، همچنین شامل ترکیبات اکولوژی که بخشی از اکوسیستم­ها را تشکیل می­دهند، می­باشد [12].

بحث تنوع زیستی از موضوعات بسیار مهم فعلی دنیا است. با تخریب منابع طبیعی و محیط زیست و کاهش مساحت آن­ها شاهد انقراض گونه­ های گیاهی و جانوری و در نتیجه کاهش تنوع زیستی در دنیا هستیم. هریک از گونه­ ها آن­چنان در اکوسیستم­های جنگلی نقش حیاتی و اساسی را در زنجیره­های غذایی بازی می­ کنند که نابودی یک گونه، تعادل حیات را در طبیعت برهم می­زند. برنامه ­های زیست محیطی برای هر منطقه بدون شناخت وضعیت پوشش گیاهی آن منطقه و تنوع گونه­ای آن ممکن نیست [3].

شناسایی پوشش گیاهی و بررسی فرم زیستی و جغرافیای گیاهی منطقه، ضمن اینکه اساس بررسی­ها و تحقیقات بوم­شناختی در منطقه بوده و راهکاری مناسب برای تعیین ظرفیت بوم­شناختی منطقه از جنبه­ های مختلف است، در عین حال، عامل مؤثری در سنجش و ارزیابی وضعیت کنونی و پیش ­بینی وضعیت آینده­ی منطقه به شمار می­رود که برای اعمال مدیریت صحیح، نقش بسزایی دارد [13].

تنوع زیستی جنگل منبع بسیار مهم و با ارزشی است، زیرا گونه­ های موجود در جنگل و ذخایر ژنتیکی تشکیل­دهنده آن برای سلامتی و تأمین نیازهای بشر و سایر موجودات، حائز اهمیت بوده و قطعاً فقدان تنوع زیستی تهدید خطرناکی برای بقای انسان و سایر موجودات محسوب می­ شود [14].

تنوع زیستی در جنگل­های شمال ایران بالا است. در بین کشورهای هم­عرض ایران، جنگل­های شمال ایران و شمال ترکیه که از عصر یخبندان به سلامت گذشته­اند، دارای بهترین تنوع می­باشند. پس از پایان عصر یخبندان، پیشروی جنگل به سمت اروپا از جنگل­های شمال ایران و ترکیه آغاز شد و همین قدمت بیشتر سبب شده است که تنوع ژنتیکی گونه­ های چوبی شمال ایران بیشتر از اروپا باشد [15].

گیاهان نقش پایه­ای در شکل­ گیری اکوسیستم­های طبیعی دارند. از این­رو شناخت دقیق گونه­ های گیاهی و اطلاع از تنوع زیستی گیاهی و جوامع گیاهی ما را برای  مدیریت منابع طبیعی كشور یاری خواهد داد.

جنگل­های شمال ایران که به جنگل­های هیرکانی یا خزری معروف­اند، با طول تقریبی 800 کیلومتر، عرض 110 کیلومتر و مساحت کلی 84/1 میلیون هکتار، از منطقه­ تالش در جمهوری آذربایجان در غرب تا پارک ملی گلستان در شرق کشیده شده و پوشش سبزی را در شیب­های شمالی کوه­های البرز ایجاد می­ کند [1، 2]. این جنگل­ها از  سواحل جلگه­ای تا ارتفاع 2700 متر در شیب­های شمالی البرز گسترش یافته­اند و به اقلیم واحد با بارندگی سالیانه (از 600 تا 2000 میلی متر) وابسته­اند و به­نظر می­رسد که با ساختار جنگل­های اروپا-سیبری بسیار سازگار باشند [3، 4].

این ناحیه­ی رویشی یکی از اکوسیستم­های متنوع و جالب از اقلیم­های حیاتی معتدله­ی نیمکره­ی شمالی است. شرایط طبیعی و جغرافیایی این ناحیه، از جمله برخورداری از بارش­های فراوان و منظم و حرارت مناسب، نزدیکی به دریا، وجود کوه­ها، دامنه­های پرشیب و کم­شیب و اختلاف ارتفاع شدید در فواصل کوتاه، منجر به توسعه و آشیان­گزینی اکولوژیک بسیاری از عناصر گیاهی در آن شده است که اجتماعات گیاهی مختلفی را تشکیل می­دهد. در این خصوص تنها بخش کوچکی از ویژگی­های زیستی رویشگاه­ها، جوامع گیاهی و در نتیجه ترکیب فلوریستیکی هریک از آن­ها مطالعه شده و هنوز هم حضور تعدادی از گونه­ ها در اجتماعات جنگلی و محدوده­ انتشار جغرافیایی آن­ها ناشناخته مانده است [5].

در بین سه زون ارتفاعی تعریف شده از جنگل­های هیرکانی (پست، کوهپایه­ای و کوهستانی) [6، 4، 7، 8، 9]، جنگل­های مناطق پست از ارزش بالای حفاظتی و مدیریتی برخوردار بوده و به­نظر می­رسد که برای مطالعات اکولوژیکی و پوشش گیاهی در اولویت باشند چرا که در این مناطق انسان با حذف عناصر طبیعی و جایگزینی عناصر دیگر جوامع آن را تا حد زیادی تغییر داده و یا در معرض نابودی قرار داده است [8]. به علت این تغییر، بسیاری از گونه­ های گیاهی به بقایایی از زیستگاه­های مناطق پست، محدود شده ­اند [10].

پارك­های جنگلی نور و سیسنگان كه به ترتیب در شهرستان­های نور و نوشهر واقع می­باشند،‏ اگرچه در سال­های اخیر مورد تخریب و آسیب شدید توسط دام و انسان قرار گرفته­اند، با این وجود، جزء تنها بقایای جنگل­های پست خزری هستند [11، 8]. با توجه به اهمیت این مناطق، شناخت و

 بررسی رویش­های طبیعی آن حائز اهمیت است.

تنوع زیستی تنها به مجموعه ­ای از گونه­ ها اشاره ندارد، بلکه به عنوان تغییرات میان ارگانیسم­های زنده در تمام منابع خشکی، دریایی و دیگر اکوسیستم­های آبی تعریف می­ شود. براساس تعریف دبیرخانه­ی کنوانسیون تنوع­زیستی، تنوع­زیستی به معنای قابلیت تمایز بین ارگانیسم­های زنده از هر منبع شامل اکوسیستم­های زمینی، دریایی و اکوسیستم­های آبزی، همچنین شامل ترکیبات اکولوژی که بخشی از اکوسیستم­ها را تشکیل می­دهند، می­باشد [12].

بحث تنوع زیستی از موضوعات بسیار مهم فعلی دنیا است. با تخریب منابع طبیعی و محیط زیست و کاهش مساحت آن­ها شاهد انقراض گونه­ های گیاهی و جانوری و در نتیجه کاهش تنوع زیستی در دنیا هستیم. هریک از گونه­ ها آن­چنان در اکوسیستم­های جنگلی نقش حیاتی و اساسی را در زنجیره­های غذایی بازی می­ کنند که نابودی یک گونه، تعادل حیات را در طبیعت برهم می­زند. برنامه ­های زیست محیطی برای هر منطقه بدون شناخت وضعیت پوشش گیاهی آن منطقه و تنوع گونه­ای آن ممکن نیست [3].

شناسایی پوشش گیاهی و بررسی فرم زیستی و جغرافیای گیاهی منطقه، ضمن اینکه اساس بررسی­ها و تحقیقات بوم­شناختی در منطقه بوده و راهکاری مناسب برای تعیین ظرفیت بوم­شناختی منطقه از جنبه­ های مختلف است، در عین حال، عامل مؤثری در سنجش و ارزیابی وضعیت کنونی و پیش ­بینی وضعیت آینده­ی منطقه به شمار می­رود که برای اعمال مدیریت صحیح، نقش بسزایی دارد [13].

تنوع زیستی جنگل منبع بسیار مهم و با ارزشی است، زیرا گونه­ های موجود در جنگل و ذخایر ژنتیکی تشکیل­دهنده آن برای سلامتی و تأمین نیازهای بشر و سایر موجودات، حائز اهمیت بوده و قطعاً فقدان تنوع زیستی تهدید خطرناکی برای بقای انسان و سایر موجودات محسوب می­ شود [14].

تنوع زیستی در جنگل­های شمال ایران بالا است. در بین کشورهای هم­عرض ایران، جنگل­های شمال ایران و شمال ترکیه که از عصر یخبندان به سلامت گذشته­اند، دارای بهترین تنوع می­باشند. پس از پایان عصر یخبندان، پیشروی جنگل به سمت اروپا از جنگل­های شمال ایران و ترکیه آغاز شد و همین قدمت بیشتر سبب شده است که تنوع ژنتیکی گونه ­های چوبی شمال ایران بیشتر از اروپا باشد [15].

فصل اول: مروری بر منابع علمی

1-1- تعریف جامعه­ شناسی گیاهی و مروری بر تحقیقات جامعه­ شناسی در جهان

جامعه ­شناسی گیاهی معروف به فیتوسوسیولوژی[1] شاخه­ای از علم اکولوژی است که اجتماعات گیاهی را از نظر ترکیب گونه­ای[2]، اکولوژی، پراکنش جغرافیایی[3] و دینامیک مورد مطالعه قرار می­دهد [16]. جامعه­ گیاهی[4] که برای اولین بار در ابتدای قرن نوزدهم توسط همبولت[5] تشریح شد [17]، اشاره به گونه­ های معینی می­نماید که باهم در محل­های معین رشد کرده و وقوع آنها باهم چیزی بیش از شانس و تصادف است [18]. کلمنتز[6] در سال 1916 با توسعه­ نظریه­ی ارگانیسمی[7]، هر جامعه­ گیاهی را به مثابه یک واحد زیستی (موجود زنده) معرفی کرده است که هر قسمتی از آن عضو یک پیکر بوده و با سایر قسمت ­ها در ارتباط می­باشد. هر جامعه­ گیاهی به عنوان واحدی منسجم با سیمای ظاهری[8] یکنواخت و ترکیب گونه­ای نسبتاً ثابت هر رویشگاه بوده [19]، مطالعه­ آن می ­تواند مبنای مناسبی برای مدیریت، احیاء[9] و توسعه­ آن رویشگاه باشد. به دلیل تغییرات شدید در نوع پوشش­گیاهی، شرایط اقلیمی و چگونگی تأثیر انسان در پوشش گیاهی مناطق مختلف، مکاتب و روش­های مختلفی در دانش جامعه ­شناسی گیاهی مرسوم گردید [20]. از میان مکاتب موجود، مکتب زوریخ-مونپلیه که توسط براون-بلانکه در سال 1928 پیشنهاد شده است [21]، از اهمیت خاصی برخوردار می­باشد [17]. ویژگی بارز این مکتب، انعطاف کافی آن جهت بررسی پوشش گیاهی از دیدگاه ­های مختلف بوده و علاوه بر این با قرار دادن جامعه[10] به­عنوان واحد پایه، یک سلسله­ی رده­بندی را ارائه می­ کند که دیگر واحدهای آن، اتحادیه[11]، رده[12] و طبقه[13] می­باشد [22].

مطالعه­ فیتوسوسیولوژی به روش براون-بلانکه توسط محققینی چون پور[14] [23]، پاولوسکی[15] [24]، بکینگ[16] [25]، شیمول[17] [26]، مولر-دومبویس[18] و النبرگ[19] [27]، واندرمارل[20] [28] تشریح شده و روش­های اجرایی آن مورد بررسی قرار گرفت [17].

2-1- مروری بر بررسی­های فلوریستیکی و جامعه­ شناسی پوشش ­گیاهی در جنگل­های هیرکانی

بررسی­های جامعه‌شناسی گیاهی در ایران به صورت كلی با مطالعات زوهری [29] آغاز شده است. جزیره‌ای [30] عناصر فیتوژئوگرافیكی جنگل­های خزری را تشریح نموده است. تره‌گوبو [31]، مصدق [32] و درستكار [33] جامعه‌های گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی نموده‌اند. ثابتی [34]، جامعه‌های گیاهی متعددی برای مناطق مختلف ایران ذكر كرده است. راستین [35]  جامعه‌های جنگلی پست حوزه­ هیركانی و اسداللهی [36] جامعه‌های گیاهی راشستان­های اسالم را مورد مطالعه قرار داده‌اند و البرز مركزی توسط کلن [37] مطالعه شده است.

حجازی و ثابتی[1] در سال 1961 چندین جامعه­ جنگلی از شمال ایران معرفی نمودند [38]. جزیره­ای[2] در سال­های 1964 و 1965 عناصر فیتوژئوگرافی جنگل­های هیرکانی را تشریح و جوامعی از این جنگل­ها را مورد مطالعه قرار داد [30، 39]. ثابتی در سال 1344 جوامع مختلف گیاهی جنگل­های شمال ایران را مطالعه کرده ­است[40]. خاوری­نژاد در سال 1345 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود جوامع­گیاهی جنگل­های جنوب شرق چالوس را مورد مطالعه قرار داد[41]. ترگوبو[3] در سال 1967 جوامع گیاهی منطقه­ هیرکانی را معرفی کرد [31]. ترگوبو و مبین[4] در سال 1970 نقشه­ی پوشش گیاهی ایران را با مقیاس 1:2500000 تهیه کردند [42]. زوهری[5] در سال­های 1963 و 1973 پوشش گیاهی ایران، به ویژه جنگل­های هیرکانی را از جنبه­ های جغرافیایی و جامعه ­شناسی گیاهی بررسی کرده است [6، 29]. درستکار[6] در سال 1974 در تز دکترای خود [43] و درستکار و نویرفالیس[7] در سال 1976 [33] جنگل­های شرق دریای خزر را مورد مطالعه قرار داده­اند. ثابتی در سال 1355 درختان و درختچه­های ایران را بررسی کرده است [34]. اسداللهی[8] در سال 1980 در رساله­ی دکترای خود، جوامع­گیاهی راشستان­های حوزه­ اسالم [44] و در سال 1366 جغرافیای گیاهی و جوامع­گیاهی جنگل­های شمال غربی هیرکانی را در سمینار جنگل و جنگل­داری گرگان ارائه نموده است [36]. در سال 1982 اسداللهی و همکاران، اکوسیستم­های جنگلی ایران را از دیدگاه جامعه ­شناسی مورد مطالعه قرار داده­اند [45]. مصدق[9] در سال 1981 جوامع­گیاهی جنگل­های شمال ایران را بررسی کرده است [46]. راستین[10] در سال­های 1980 و 1983 جوامع جنگلی پست منطقه­ هیرکانی را مورد مطالعه قرار داده است [35، 47]. فرای[11] و همکاران در سال 1985 نقشه­ی پوشش گیاهی بخش مرکزی کوه­های البرز را با مقیاس 1:500000 تهیه کردند [48]. فرای و پرابست[12] در سال 1986 طرح طبقه ­بندی پوشش گیاهی ایران بر اساس معیارهای فیزیونومی-اکولوژی را ارائه کردند [4]. اسدی در سال 1364 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود، جوامع گیاهی سری پاتم خیرود­کنار را بررسی نموده است [49]. طبری در سال 1371 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود، شرایط زیست و مختصات جنگل­شناسی و جوامع­گیاهی درخت زبان­گنجشک را در جنگل­های شمال تشریح نموده است [50]. حمزۀ در سال 1373، جوامع گیاهی و عناصر تشکیل­دهنده جنگل­های لساکوتی در جنوب شرقی تنکابن را مورد بررسی قرار داده است [51]. سعیدی­مهرورز در سال 1373 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود، فلور و پوشش­گیاهی مناطق ایسپیلی-دیلمان و نواحی اطراف آن را بررسی نموده است [52]. یزدیان در سال 1374 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود، مهم­ترین شرایط اکولوژیکی و تیپ­های رویشی درخت آزاد را در جنگل­های شمال بررسی کرده است [53]. حسینی در سال 1375 در پایان نامه ­ی کارشناسی­ارشد خود، با عنوان تهیه­ نقشه­ی فیزیونومیک – فلورستیک پوشش­گیاهی بخش نم‌خانه­ی جنگل خیرودكنار، جوامع جنگلی این بخش را با معرفی گونه­ های معرف هر جامعه، مشخص نموده است [54]. آخانی[13] در سال 1998، تنوع زیستی پارک ملی گلستان [55] و آخانی و زیگلر[14] در سال 2002 پوشش گیاهی صخره­ای و جوامع علفی پارک ملی گلستان را بررسی کردند [56]. کلن[15] در سال 1982 [57] و 1984 [58] و در سال 1991 [37] در تز دکترای خود جوامع گیاهی البرز مرکزی را مورد مطالعه قرار داده است. نظریان[16] و همکاران در سال 2004 به معرفی جوامع جنگلی بخشی از شمال ایران پرداختند [59]. قهرمان[17] و همکاران در سال 2006 به بررسی فلوریستیک جنگل­های توسکای قشلاقی در مناطق پست خزری پرداخته­اند[60]. دانشور[18] و همکاران در سال 2007 تنوع ساختاری در راشستان آمیخته (مطالعه موردی جنگل شصت­کلاته، گرگان) را مورد بررسی قرار دادند [61]. حمزۀ[19] و همکاران در سال 2008 به بررسی جوامع توسکای قشلاقی در شمال ایران پرداخته­اند [8]. جعفری و آخانی[20] در سال 2008 گیاهان منطقه حفاظت شده جهان­نما در استان گلستان را مورد مطالعه قرار دادند [62]. نقی­نژاد[21] و همکاران در سال 2008 ارتباط محیط و پوشش­گیاهی را در اجتماعات توسکای قشلاقی مناطق پست جنگل­های شمال بررسی نمودند [7]. رمضانی[22] و همکاران در سال 2008، تاریخچه­ی پوشش گیاهی جنگل­های هیرکانی مرکزی را مورد بررسی قرار داده­اند [63]. سیادتی و مرادی در سال 1389 [64، 3] در پایان نامه ­ی کارشناسی ارشد خود و همچنین سیادتی[23] و همکاران در سال 2010 [9]، تغییرات فلوریستیکی را در طول شیب ارتفاعی در منطقه جنگلی خیرود بررسی کردند.

[1] Sabeti & Hejazi

[2] Djazirei

[3] Tregubov

[4] Tregubov & Mobayen

[5] Zohary

[6] Dorostkar

[7] Dorostkar & Noirfalise

[8] Assadollahi

[9] Mossadegh

[10] Rastin

[11] Frey

[12] Frey & Probst

[13] Akhani

[14] Akhani & Ziegler

[15] Klein

[16] Nazarian

[17] Ghahreman

[18] Daneshvar

[19] Hamzehꞌee

[20] Jafari & Akhani

[21] Naqinezhad

[22] Ramezani

[23] Siadati

Phytosociology

Floristic

Chorology

Plant association

Homboldt

Clements

Organismic Concept

[8] Physiognomic

[9] Reclamation

[10] Association

[11] Alliance

[12] Order

[13] Class

[14] Poore

[15] Pawlowski

فهرست مطالب:

فصل اول: کلیات

1-1 مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………… 2

2-1 پیدایش نفت …………………………………………………………………………………………………… 4

1-2-1 نظریه منشأ معدنی ……………………………………………………………………………………….. 4

1-2-1 نظریه منشأ آلی …………………………………………………………………………………………… 4

 1-3 نفت خام ……………………………………………………………………………………………………….. 5

1-4 انواع نفت خام ………………………………………………………………………………………………… 5

1-5  خام برنت ………………………………………………………………………………………………………. 6

1-6 نفت خام مارس ……………………………………………………………………………………………….. 6

1-7 نفت خام میناس ………………………………………………………………………………………………. 6

1-8 نفت خام موربان ……………………………………………………………………………………………… 7

1-9 نفت خام تاپیس ……………………………………………………………………………………………… 7

1-10 اجزای نفت خام …………………………………………………………………………………………… 7

1-11 خواص نفت خام ………………………………………………………………………………………….. 9

1-11 -1 خواص فیزیکی نفت خام …………………………………………………………………………. 9

1-11-2  شیمیایی نفت خام …………………………………………………………………………………… 10

1-12 باکتری های بی هوازی ………………………………………………………………………………… 10

1-13 دسته بندی باکتری های بی هوازی ………………………………………………………………… 11

1-13-1 باکتری های بی هوازی احیاکننده نیترات ………………………………………………….. 11

1-14 اندامگان بی هوازی ……………………………………………………………………………………… 11

1-15 متابولیسم بی هوازی …………………………………………………………………………………….. 12

1-16 بیوسورفکتانت …………………………………………………………………………………………….. 13

1-17 تعریف بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………….. 13

1-18 بیوسورفکتانت ها از نظر وزن مولکولی …………………………………………………………. 13

1-18-1 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی پایین …………………………………………………. 13

1-18-2 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی بالا ……………………………………………………. 14

1-19 تولید بیوسورفکتانت ها ………………………………………………………………………………… 14

1-20 اثر فاکتورهای مختلف بر تولید بیوسورفکتانت ………………………………………………..14

1-20-1 اثر منبع کربن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………………15

1-20-2 اثر منبع نیتروژن بر تولید بیوسورفکتانت …………………………………………………….. 15

1-20-3 اثر فاکتورهای محیطی بر تولید بیوسورفکتانت ……………………………………………. 15

 1-21 تقسیم بندی بیوسورفکتانت ها ………………………………………………………………………  16

1-22 انواع بیوسورفکتانت ……………………………………………………………………………………… 16

1-23 مزیت های استفاده از بیوسورفکتانت ………………………………………………………………. 17

1-24 مزیت بیوسورفکتانت ها به سورفکتانت های شیمیایی ………………………………………. 18

1-25 کاربردهای بیوسورفکتانت ها …………………………………………………………………………. 19

1-25-1 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنعت نفت ………………………………………………. 19

1-25-2 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنایع غذایی ……………………………………………. 20

1-26 نقش های طبیعی و فیزیولوژیکی بیوسورفکتانت ها ………………………………………….. 20

1-27 افزایش سطح تماس ناحیه هیدروفوبی سوبستراها …………………………………………….. 20

1-28 هالوفیل ها …………………………………………………………………………………………………….. 20

1-29 اهداف تحقیق ………………………………………………………………………………………………. 21

1-30 سوالات تحقیق …………………………………………………………………………………………….. 22

 

 

1-31 فرضیه های تحقیق ………………………………………………………………………………………… 22

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت ………………………………………………………… 24

2-2 بیوتکنولوژی در خدمت صنعت و نفت …………………………………………………………….. 24

2-3 استخراج نفت ………………………………………………………………………………………………… 26

2-4 حفر چاه ………………………………………………………………………………………………………… 27

2-5 روش های استخراج نفت ……………………………………………………………………………….. 27

2-6 مزایای بیوسورفکتانت ها در استخراج نفت ثالثیه ……………………………………………… 31

2-7 پیشینه تحقیق …………………………………………………………………………………………………. 32

فصل سوم

روش کار

3-1 دستگاه های مورد استفاده ………………………………………………………………………………..  39

3-2 وسایل مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………..  39

3-3 مواد مورد استفاده …………………………………………………………………………………………..  40

3-4 مراحل انجام آزمایش ……………………………………………………………………………………..  40

3-4-1 نمونه برداری ……………………………………………………………………………………………..  41

3-4-2 غربالگری و غنی سازی بی هوازی باکتری های نفتی ……………………………………  41

3-4-3روش تهیه لام …………………………………………………………………………………………….. 43

3-4-4 رنگ آمیزی گرم ………………………………………………………………………………………. 43

3-4-5 رنگ آمیزی منفی ……………………………………………………………………………………… 44

3-4-6 شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………………………. 44

 3-4-7 تست احیای نیترات ………………………………………………………………………………….. 46

3-4-8 تست CHNS……………………………………………………………………………………………

3-4-9 آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده ……………………. 48

فصل چهارم: نتایج

4-1 مشاهده میکروسکوپی ………………………………………………………………………………………. 54

4-2 نتایج مرحله شناسایی و تخلیص ……………………………………………………………………….. 54

4-3 نتایج تست احیای نیترات …………………………………………………………………………………. 54

4-4 نتایج تست CHNS ………………………………………………………………………………………..  55

4-5 نتایج آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده …………………….57

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………. 59

5-2 بحث ……………………………………………………………………………………………………………. 61

5-3 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………… 63

5-4 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………… 64

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………….. 65

منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………… 66

منابع لاتین …………………………………………………………………………………………………………….. 66

چکیده:

 

مبحث حضور باكتریها در اعماق زمین در اوایل قرن 21 مطرح شد. یكی از اولین تحقیقاتی كه در مورد میكروبیولوژی اعماق زمین انجام شد منتج به جداسازی باكتریهای احیا كنندة سولفات از چاه نفت شد. باکتری های احیا کننده سولفات، اصلی ترین باکتریهایی هستند که باعث ترش و اسیدی شدن نفت شده و در نتیجه افت کیفیت نفت خام را به بار خواهند آورد. رقابت بین SRB ها و باکتریهای بیهوازی احیا کننده نیترات برای کسب سوبسترای هیدروکربنی امروزه به عنوان یکی از راه­حلهای بالقوه بیوتکنولوژیک در جهت ارتقا کیفیت API نفت خام مطرح می­ شود. لذا تحقیق در مورد یافتن NRBهای بومی نفت خام هر منطقه جغرافیایی تبدیل به یکی از موضوعات مورد توجه دانشمندان صنعت نفت در دهه اخیر شده است. از مهمترین ویژگیهای یک باکتری مفید در بیوتکنولوژی نفت توانایی تحمل شرایط فیزیکو شیمیایی دشوار مخزنی و تولید بیو سورفکتانت جهت افزایش دسترسی میکروبی می­باشد. لذا در این تحقیق باکتریهای بی­هوازی هالوفیل، احیاکننده نیترات  و مولد بیوسورفکتانت بومی نفت خام ایران بررسی شدند. نمونه نفتهایی از برخی مخازن ایران با هدف بررسی حضور باکتریهای احیاکننده نیترات بومی مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی کشتها به روش Hungate در ویالهای crimped seal شده و تنظیم اتمسفر بی هوازی، تحت شرایط کاملا بی هوازی در دمای  40درجه سانتیگرادصورت گرفت. در تمامی مراحل هالوفیل بودن باکتریهای جدا شده با افزودن NaCl به محیطهای کشت لحاظ شد. از محیط نوترینت براث و BSM فاقد منبع گوگرد که حاوی نفت خام استریل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود، به منظور حذف SRB رقیب و غنی سازی اولیه استفاده شد. در مرحله بعد، نیترات براث برای جداسازی و خالص سازی باکتریهای هدف مورد استفاده قرار گرفت، سپس در محیط MSM تجدید کشت شد. جهت بررسی توانایی NRB های بومی جداشده در تولید بیوسورفکتانت از محیط کشت Blood Agar  ، BHI و تکنیک پخش شدن نفت  بکار برده شد.  در نهایت برای حصول اطمینان از اینکه باکتریهای بی هوازی جدا شده از نفت خام قطعا از ازت نفت خام برای تامین نیاز خود استفاده میکنند، تست احیای نیترات و تست NCH که جهت بررسی کاهش ازت بود، انجام گرفت.نتایج حاصل نشان داد که نفت خام ایران دارای NRB های به شدت بی هوازی هستند که علاوه بر احیا نیترات و رقابت با SRBها، می­توانند از آن به عنوان تنها منبع کربن استفاده نمایند. این باکتریها با توانایی تحمل شوری، دما و نیز تولید بیو سورفکتانت میتوانند از کاربردی ترین باکتریها در صنعت نفت در فرایندهایی مثل ارتقائ کیفیت نفت به روش بیولوژیک، کاهش آلودگیهای محیطی و یا ازدیاد برداشت میکروبی نفت (MEOR) در شرایط بیهوازی باشند، که پیشنهاد می شود کاربرد آنها در کاهش ترشی و اسیدیته نفت خام نیز بررسی شود.

فصل اول: کلیات

1-1- مقدمه

 نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده میشود، از دو کلمهPetra   و  Oleumکه در زبان یونانی به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن میباشد، تشکیل شده است که در زبان فارسی معادل مناسبی ندارد. نفت و سایر مواد سوختنی هیدروکربنی به صورتی که ما امروزه آن را میشناسیم، در مخازنی در اعماق زمین وجود دارند. نفت به عنوان یک منبع انرژی در جهان محسوب می شود و با وجود منابع انرژی دیگر هنوز هم منبع انرژی غالب و در دسترس و قابل اطمینان جایگزین آن نشده است(9).  

پترولیوم می تواند به صورت فازهای مختلف، از جمله فاز گازی نظیر گاز طبیعی (Natural Gas )، فاز مایع نظیر نفت خام ( Crude Oil ) و فاز جامد مثل قیر ( Asphaltene ) در خلل و فرج و شکستگی های سنگ تجمع می یابد. مهمترین منبع هیدروکربن ها، نفت خام است. نفت خام شامل مقدار کمی ترکیبات آلی اکسیژن دار،  نیتروژن دار و گوگردی و نیز فلزاتی است که به طور شیمیایی به مولکول های آلی متصلند.  انباشته شدن مواد هیدروکربنی در زیر سطح زمین در سنگ هایی صورت می گیرد که توانایی نگه داری و انتقال سیالات را داشته باشند. معمولا نفت خام زیر پوششی از سنگ های غیر قابل نفوذ در محفظه های سنگ های متخلخل به نام مخازن یا (rReservoi) که منحصرا در حوضچه های رسوبی قرار دارند،  محبوس است (10).

تجمع مواد هیدروکربنی به صورت اقتصادی در سنگ مخزن منوط به وجود عوامل متعددی است. به طور کلی وجود پنج عامل برای تجمع اقتصادی نفت و گاز لازم و ضروری است، این پنج عامل عبارتند از :

1-سنگ منشأ بالغ (Mature Source Rock) که تولید هیدروکربن کرده باشد.

2-سنگ مخزن ( Resevoir Rock) که بتواند هیدروکربن را در داخل خود جای دهد.  

3-مهاجرت هیدروکربن بین سنگ منشأ و سنگ مخزن ( Migration Pathway) عملی باشد.  

4-پوش سنگ (Cap Rock ) از خروج نفت از داخل سنگ مخزن جلوگیری می کند.  

5-تله نفتی ( Oil Trap) که در آن نفت به صورت تراوش های سطحی شناخته شده و مورد استفاده بوده اند(9).

اکتشافات نفت یک دانش بسیار قدیمی و کاربردی است که با جمع آوری قیر از تراوش های طبیعی سطحی به قلمرو علم وارد شد. در آن زمان ها از نفت برای مقاصد پزشکی، گرمایی و همچنین مصارف عایق کاری استفاده می شد.

این مواد در ابتدای کشف به صورت منبع بسیار مهم انرژی تلقی شدند، لیکن با پیشرفت علم و تکنولوژی مدرن، خواص دیگر آنها نیز مورد توجه قرار گرفت و شاید امروز بتوان گفت که ارزش مشتقات پتروشیمی بسیار حایز اهمیت میباشند، زیرا منابع سوختی دیگری وجود دارند که از آنها به عنوان منبع انرژی می توان استفاده نمود، حال آنکه نفت میزان محدودی داشته و چنانچه به اتمام برسد، تهیه مشتقات مهم آن نیز منتفی خواهد شد. لذا تولید صحیح و برنامه ریزی های دقیق در صنعت، نقش بسیار مهمی را ایفا می کنند و با مرور زمان به صورت رکن اساسی این صنعت تلقی می گردند (9).  

2-1- پیدایش نفت

در مورد منشأ و پیدایش نفت نظریه های مختلفی وجود دارد که عبارتند از:

1-2-1- نظریه منشأ معدنی

نظریه معدنی نفت که در ابتدای قرن بیستم به وسیله اکثر شیمی دان ها و زمین شناسان مورد قبول واقع شده بود در حال حاضر فقط جنبه تاریخی دارد.  

در 1901، Sanderens, Sabatier, استیلن را دمای 200-300 درجه سانتی گراد در حضور کاتالیزورهای نیکل و آهن احیاء شده، هیدروژن دار کردند و میزان زیادی از هیدروکربن های موجود  در نفت خام  به دست آوردند. با آنکه نظریه

فهرست مطالب:

چکیده …………………………………………………………………………………………… 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات ……………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ………………………………… 8

1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ………………………………………………… 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو …………………………………………. 12

1-4-1  اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………. 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی …………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ……………………………………………………………………… 16

1-5- فارماکوکنتیک …………………………………………………………………………… 19

1-5-1- مقاومت دارویی …………………………………………………………………….. 23

1-5-2-  تأثیر دارویی …………………………………………………………………………. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………….. 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………. 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری …………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ……………………………………………………. 35

2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ……… 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها….. 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها…. 38

2-5- استخراج  DNA………………………………………………………………………….

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA…………………………………………..

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ………………………………………………….. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………… 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………. 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………….

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  ………….

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………….. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی ……………………………. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………… 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …….

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll………………………………….

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l ………..

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE……….

 2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……….. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……………………………. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ………………………… 62

2-19- کشت سلول انسانی  …………………………………………………………….. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640 …………………………………………….. 

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی…… 63

2-20-1- MTT Assay ………………………………………………………………

 

 

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………

فصل سوم نتایج ………………………………………………………… 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها …………………………………….. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490……

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش یافته…………. 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ……………………………………

3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  …………………………………..

3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن …. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ……. 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد.. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد……. 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد…… 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی HeLa …………….

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی LCL…………….

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………..

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ……………………………………………….. 98 

منابع …………………………………………………………………………………….. 108

چکیده:

ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافته E. coli  . 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتری E. coli در معرض نور UV . 2- تخلیص  DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید  pET23a(+)  و انتقال به E. coli. 4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5-  تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنی ال-آسپاراژیناز II  از باکتری E. coli KIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1  به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)   کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول های E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU)  و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL  ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg  178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr  77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت  نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی  HeLa و LCL  تاثیر می گذارد.

مقدمه:

با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.

آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive  داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).

ال-آسپاراژینازll  یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL[1] بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL  اطفال به مدت تقریباً 30  سال استفاده می شود (6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL  بالغین قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود (11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است (13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU  E. coli ، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll  در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول: کلیات

1-1- پیشینه تاریخی

نظریه اولیه که به منظور گسترش ال-آسپاراژیناز به عنوان یک عامل بالقوه آنتی نئوپلاستیک ثابت شد بسیار با اهمیت بوده و توسط Clementi  در سال 1922 طرح شد(20). وی آشکار ساخت که  فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز در سرم خوکچه هندی دیده می شود. فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز فقط در سرم خوکچه هندی مشاهده می شد، درحالیکه در سایر PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران این آنزیم یافت نمی شد. در سال 1953، Kidd عود لنفوماهای پیوندی در موش ها و رت ها را با خوکچه هندی مقایسه کرد و شرح داد(39). این فعالیت سایتوتوکسیک در سرم اسب یا خرگوش وجود نداشت. Neuman و McCoy  در سال 1956 این نظریه ها را گسترش دادند(45). آنها ثابت کردند که رشد لاین سلولی که از کارسینوسارکومای Walker مشتق شده مستلزم ال-آسپاراژین است. Haley در سال 1961 با بهره گرفتن از لاین سلولی مربوط به لوکمی موش نتایج مشابهی بدست آورد (29). و بالاخره Broome بود که در سال 1961 درحالیکه در آزمایشگاه Kidd کار می کرد ، یافته های Kidd مربوط به مهار رشد را با اولین نظریه که توسط Clementi ارائه شد مقایسه کرد و با موفقیت نتیجه گرفت که فعالیت آنتی لنفوما در سرم های خوکچه های هندی ناشی از ال-آسپاراژیناز موجود در سرم این حیوان می باشد (12).  تحقیقات بیشتر این شخص خصوصیت نهفته درمانی این آنزیم را تایید کرد (12،11). Yellin   وWriston   در سال 1966، موفق به خالص سازی جزئی دو ایزوفرم ال-آسپاراژیناز از سرم خوکچه هندی شدند (63). بطور قابل توجه ، فقط یک ایزوفرم در شرایط in vivo  فعالیت آنتی لنفوما را آشکار می ساخت (64،63) .

از آنجاییکه استخراج این آنزیم به مقادیر کافی از سرم خوکچه هندی مشکل بود ، سایر منابع نظیر میکروبها بررسی شدند. Mashburn و Wriston ، در سال 1964  و Campbell و Mashburn در سال 1969 از خالص سازی ال-آسپاراژیناز E. coli  خبر دادند، و ثابت کردند که فعالیت تومورکشی آن شبیه به نوع سرمی خوکچه هندی می باشد(64،15).  این یافته ها پایه عملی تولید آنزیم با مقادیر زیاد را برای تحقیقات بالینی و پیش بالینی فراهم کرد(17،16،15) . Oettgen در سال 1967 اولین کسی بود که تأثیر ال-آسپاراژیناز در انسان های مبتلا به لوکمی را نشان داد (46). بطور همزمان بررسی مهم دیگری توسط Old  انجام شد که فعالیت آنتی توموری این آنزیم را در شرایط in vivo در یک مدل سگی مبتلا به لنفوسارکوما  اثبات می کرد(47).

درمان  با بهره گرفتن از پروتئین ها در انسان ها محدودیت دارد زیرا منجر به ایمنی زایی دارو می شود که مشکلی اساسی می باشد. واکنش های حساسیت شدید نسبت به ال-آسپاراژیناز E. coli  بطور متوسط عمومیت دارد. یک بررسی هم زمان بر روی ال-آسپاراژیناز E. coli و Erwinia carotovora  فقدان واکنش تقاطعی را نشان می دهد (24). هرچند هردو آنزیم به میزان زیادی  سبب تحریک سیستم  ایمنی می گردند. تلاش ها در این زمینه موجب کاهش ایمنی زایی این دارو ها شده است و این در حالیست که فعالیت آنزیمی آن حفظ شده است. مشخص شده است اتصال این آنزیم به  پلی اتیلن گلایکل یا PEG[1] به عنوان یک پردازش، واکنش های ایمنی زایی این دارو را از بین می برد بدون آنکه در ویژگی آنتی نئوپلاستیک آن تغییر ایجاد کند(27). این ترکیب اصلاح شده دارو در مدل های حیوانی باعث کاهش تشکیل آنتی بادی در مقایسه با ترکیب بومی آن می شود، و بطور محسوس مدت اثرش را طولانی می کند(57،27). در سال های اخیر، استفاده از ال-آسپاراژیناز در درمان لوکمی و سایر اختلالات لنفوپرولیفراتیو بطور وسیع افزایش یافته است. در اوایل از آن تنها برای  بهبود  بیماران مبتلا به ALL استفاده می شد (36،35،34،33،32،31،30،2،1)؛ اما پس از  تحقیقات اخیر به منظور تقویت درمان بدخیمی های لنفوئید، عملکرد این آنزیم را به مدت 30-20 هفته تجویز می گردد(57) . به این دلایل است که ال-آسپاراژیناز به عنوان یک جزء ضروری در روش های نوین شیمی درمانی چند دارویی قرار گرفته است.

2-1- آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان

تحقیقات اولیه با نتایج مثبت با بهره گرفتن از ال-آسپاراژیناز خوکچه هندی انجام شد، اما ثابت شد که آماده سازی حجم انبوه از این آنزیم میسر نمی باشد. اگرچه ال-آسپاراژیناز در گونه های مختلف گیاهی و حیوانی یافت شده است، اما به دلیل روش سخت استخراج این آنزیم، سایر منابع نظیر میکروارگانیزم ها نیز بررسی شدند. میکروارگانیزم ها ثابت کردند که برای تولید این آنزیم منابعی مؤثرتر و ارزان تر هستند. سهولت کشت آنها به تولید فراوان  این آنزیم کمک می کند. دامنه وسیعی از میکروب ها شامل باکتری ها ، قارچ ها ، مخمرها ، اکتینومایست ها و جلبک ها از نظر تولید این آنزیم مؤثرترند، اما خصوصیات آنزیمی از ارگانیسمی به ارگانیسم دیگر تغییر می کند ( جدول 1 ). برای تولید مقادیر بالای این آنزیم فقط از دو گونه باکتری استفاده می شود 1-. E. coli  و2- Erwinia caratovora . مشخص شده که در بین تنوع وسیع آنزیم های مشابه با فعالیت آنتی توموری شناخته شده، آنزیم این دو منبع سمیت کمتری دارد (24،8،7،6،5،4،3،2،1) .

امروزه، ال-آسپاراژیناز مورد استفاده در بیمارستان با سه نوع ترکیب در دسترس می باشد: دو فرم تغییر نیافته  یا فرم های طبیعی، خالص شده از منابع باکتریایی، و یک فرم اصلاح شده از یکی از ترکیبات طبیعی. ترکیبات طبیعی E. coli (از نظر تجاری توسط Merck & Co به عنوان  Elsperعرضه می شود)، و Erwinia caratovora  (قابل استفاده به عنوان ال-آسپاراژیناز Erwinia از Ogden Bioservices Pharmaceutical Repository  در ایالات متحده) می باشند. محصول Erwinia از نظر تجاری در کانادا و اروپا به عنوان ارویناز[1] در دسترس است، که توسط Porton عرضه می شود.  

هردو ترکیب طبیعی از نظر استفاده برای درمان بیماران ردیف اول و دچار عود بیماری، تأیید شدند. در اروپا، دو ترکیب از ال-آسپاراژیناز E. coli با تفاوت مختصر در خصوصیات فارماکوکنتیک، بنام های     کراسنیتین و ال-آسپاراژینازMedac  در دسترس می باشد (11) . این آنزیم ها به عنوان یک دارو از دو منبع، مکانیزم عمل و سمیت یکسانی دارند، اگرچه خصوصیات فارماکوکنتیک آن دو متفاوت است، و بیمارانی که دارای حساسیت شدید به یکی از دو ترکیب هستند اغلب می توانند ال-آسپاراژیناز دیگر را استفاده کنند بدون اینکه با عامل دوم آلرژی ایجاد شود.

سومین ترکیب، پگ-ال-آسپاراژیناز[1] ( نام غیر اختصاصیpegasparaginase )، یک ترکیب از آنزیم می باشد که بطور شیمیایی تغییر داده شده است. درواقع ال-آسپاراژیناز بومی E. coli به صورت کووالانسی به PEG متصل می شود. پگ-ال-آسپاراژیناز، که اکنون به عنوان pegasparaginase یا  pegasparagase ارجاء داده می شود، در سال های 1970 و 1980 گسترش یافته و در 1980 تحت کنترل آزمایشات بالینی قرار گرفته بود. Pegasparaginase ( در دسترس