چکیده فارسی…………………………………………………ذ

چکیده انگلیسی……………………………………..ر

1-1 مقدمه…………………………………………… 2

1-2 نشان‌گر چیست؟…………………………………………… 2

1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی……………………………………………. 3

1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک…………………………………………….. 3

1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی……………………………………………. 4

1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA  وRNA…………………………………….

1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR……………………………………..

1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLP………

1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS) …………………………..8

1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها………………………………………….. 9

1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCR…………………………………………….

1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)……………………. 11

1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی (RAPD)…………………… 13

1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)………………………………………. 13

1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشان‌مند از ردیف (STS)…………. 14

1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)………………………. 15

1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌ها………………………………………….. 15

1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنوم……………… 16

1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراری……………………………. 16

1-5-1 کراسینگ‌اور نابرابر…………………………………………… 17

1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردنDNA  در طول رشته (خطاهای همانند‌سازی)…….17

1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشونده………………………………………….. 19

1-6-1 مدل جهش گام به گام…………………………………………… 19

1-6-2 مدل آللی نا‏محدود…………………………………………… 19

1-7 مارکرهای STR…………………………………………….

1-8 کاربرد مارکرهای STR…………………………………………….

1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی……………………………………………. 20

1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادث……………………………………………. 21

1-8-3 تعیین هویت در موارد جنایی……………………………………………. 22

1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویه…………………………………………… 22

1-8-3-2 ردیابی مجرمین……………………………………………. 22

1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی……………………………………. 23

1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STR…………………………………………….

1-9-1 جمع‌ آوری سلول‌های جنینی از خون مادر……………………………… 25

1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها………………………………………….. 26

1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک………………………. 26

1-9-4 تشخیص کلون‏های موفق……………………………………………. 26

1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضو…………………………………………… 26

1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکی……………………………………………. 26

1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولی……………………………………………. 27

1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانی……………………………………………. 27

1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی……………………. 27

1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید‌کردن با DNA جستجوگر………. 27

1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت‌نگاری……………………………………………. 29

1-10-2 روش پروفایلینگ…………………………………………….. 29

1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR…………………………………………….

1-12 CODIS چیست؟…………………………………………… 31

1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت……………………………………………. 32

1-14 معرفی استان‏ها………………………………………….. 34

 

 

1-14-1 استان کرمانشاه………………………………………….. 34

1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 34

1-14-2 استان یَزد…………………………………………… 35

1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی……………………………………………. 36

1-15 هدف از تحقیق………………………………………….. 37

فصل دوم…………………………………………… 38

2-1 نمونه‌گیری……………………………………………. 39

2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع…………………………………………… 39

2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing…………………………..

۲-3-1 رسوب‌گذاری با اتانول…………………………………………… 41

2-3-2 تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop……………………

2-3-3 تهیه‌ی Working Stoke……………………………………………

2-4 تست DNA Typing……………………………………………

2-4-1 Multiplex PCR…………………………………………….

2-5 مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing…………………………………..

2-5-1 آزمایش DNA Typing……………………………………………

2-5-2 جداسازی قطعات……………………………………………. 45

2-5-2-1 تجهیزات لازم…………………………………………… 45

2-5-2-2 آماده‌سازی دستگاه جهت جداسازی قطعات………………….. 46

2-5-2-3 روش جداسازی قطعات……………………………………………. 46

2-6 آنالیز داده‌ها………………………………………….. 47

3-1 نمونه ‏ها………………………………………….. 53

3-2 پروفایل ژنتیکی……………………………………………. 53

3-2 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏ ها …………………………………………..55

3-3 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‏های کرمانشاه…………………………………. 56

3-4 نتایج حاصل از آنالیز نمونه‌های یزد…………………………………………… 60

فصل چهارم…………………………………………… 65

4-1 بحث……………………………………………. 66

4-2 نتیجه ‏گیری……………………………………………. 73

4-3 پیشنهادات……………………………………………. 73

منابع انگلیسی……………………………………………. 74

منابع فارسی……………………………………………75

چکیده:

بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با بهره گرفتن از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان‌دهنده‏ی همسان‌بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان‌بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع‌ ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر‌خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با بهره گرفتن از کیت  ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان‌دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433  در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی‌قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن‌تری بود که این مسئله می‏تواند به‌علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه

درگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای[1] ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری[2] موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].

علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به‌کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ،  TPOXو TH01 می‏باشند [1].

هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).

2-1- نشانگر چیست؟

صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:

 1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)

 2-به توارث برسد (2).

3-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی

نشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:

1-نشان‌گرهای مورفولوژیک

2-نشان‌گرهای پروتئینی

3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA

1-3-1- نشان‌گرهای مورفولوژیک

کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).

معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک

– اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.

– تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.

– فراوانی و تنوع کمی دارند.

– گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.

– اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).

2-3-1- نشان‌گرهای پروتئینی 

در دهه 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA  بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم[1]/آلوزایم[2] اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:

– محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛

– تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛

– محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛

– پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).

اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).

[1] Ayzozyme

[2] Allozyme