چکیده
ویروس موزاییک هندوانه (WMV) یکی از ویروسهای مهم جالیز است که گسترش جهانی دارد و از بسیاری از مناطق دنیا گزارش شده است. به دلیل اهمیت کشت جالیز در استان گلستان و آلودگی گسترده ویروس در این گیاهان شناخت دقیق وضعیت ویروس در منطقه مهم میباشد. یه منظور شناسایی این ویروس، 100 نمونه از گیاهان هندوانه، خربزه، کدو و خیار با علایم مشکوک به بیماری از مزارع استان گلستان جمع آوری و با آنتی سرم اختصاصی WMV در آزمون الایزای غیر مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. از گیاهان آلوده، RNA ویروس با بهره گرفتن از کیت (Roche) mRNA capture استخراج و cDNA تهیه گردید. جهت تکثیر ناحیه پروتئین پوششی ویروس از آغازگرهای اختصاصی در واکنش RT-PCR استفاده گردید. محصول PCR به طور مستقیم ترادف یابی شد و ترادف به دست آمده شامل 964 نوکلئوتید همراه با 31 ترادف انتخاب شده از GenBank مقایسه شدند. همردیفسازیهای چندگانه و آنالیزهای فیلوژنتیک و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرمافزارهای DNASTAR، DNAMAN، Clustal X وMEGA5 انجام و درخت فیلوژنتیک به روش neighbor-joining ترسیم گردید. برای آنالیز نوترکیبی بین جدایهها از نرم افزار RDP3 با بهره گرفتن از متد BootScan استفاده شد. در این بررسی تعداد 18 نمونه در واکنش الایزای مثبت و بقیه منفی بودند. نتایج بدست آمده از درخت فیلوژنتیکی این جدایهها را در 4 گروه قرار داد که همه جدایههای استان گلستان در یک گروه و در کنار جدایههایی از اصفهان، شیروان، مشهد، کرمان، یزد و تعدای از کشورهای اروپایی قرار گرفتند و بیشترین شباهت را به جدایهای از اصفهان داشت و در میان سایر کشورها به جدایه ترکیه (6/96%) در سطح نوکلئوتیدی شبیه تر بود و در سطح آمینواسیدی بیشترین درصد تشابه را با جدایه اسپانیا (3/97%) داشت. محاسبه تنوع ژنتیکی (π) نشان داد که برای تمامی گروهها این میزان 061/0 می باشد. نسبت dN/dS در گروههای فیلوژنتیک کمتر از 1 بدست آمد که نشان دهنده نقش موثر انتخاب منفی در تنوع و تکامل این ویروس میباشد. همچنین نتایج نشان داد که در میان جدایههای ایرانی تنها یک مورد نوترکیبی وجود دارد که مربوط به جدایه یزد بوده که در ناحیه ابتدای ژن پرتئین پوششی خود ترکیبی از ترادف نوکلئوتیدی جدایه اصفهان را دارا میباشد. اما در بین جدایههای سایر کشورها اکثر موارد نوترکیبی در ناحیه CP ژنوم ویروس مشاهده می شود. با این وجود میتوان با انجام آنالیزهای اجدادی بررسی کرد که جد اصلی این ویروس مربوط به کدام منطقه جغرافیایی است و به ترادف نوکلئوتیدی کدام کشور نزدیکتر است.
کلمات کلیدی: ویروس موزاییک هندوانه، تنوع ژنتیکی، نوترکیبی، الایزای غیر مستقیم، RT-PCR
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول:
1-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی.. 2
1-2- اهمیت محصولات جالیزی.. 3
1-3- سطح زیر کشت.. 4
1-4- بیماریهای ویروسی جالیز. 4
2-1- ویژگیهای گروه پوتیویروس…………………………………………………………………………………….. 8
2-2- ویروس موزاییک هندوانه……………………………………………………………………………………………. 9
2-2-1- دامنه میزبان……………………………………………………………………………………………………… 10
2-2-2- اپیدمولوژی ویروس……………………………………………………………………………………………… 11
2-2-3- نشانه های بیماری ویروس موزاییک هندوانه……………………………………………………………… 12
2-3- تمایز سرولوژیکی جدایههای ویروس…………………………………………………………………………… 13
2-4- نوترکیبی و تنوع ژنتیکی ویروسهای گیاهی…………………………………………………………………. 14
2-5- تنوع ژنتیکی ویروس موزائیک هندوانه. 16
2-6- بررسیهای صورت گرفته در مورد ویروس موزاییک هندوانه در دنیا…………………………………… 17
2-6-1- ویروس موزاییک هندوانه درایران……………………………………………………………………………. 17
2-6-2- ویروس موزاییک هندوانه در خارج از کشور……………………………………………………………. 22
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- زمان و مکان تحقیق………………………………………………………………………………………………….. 34
3-2- جمع آوری نمونهها و داده………………………………………………………………………………………… 34
3-3- آزمون الایزا…………………………………………………………………………………………………………….. 35
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-3-1- آزمون الیزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………. 35
3-4- آزمون PCR. 36
3-4-1- استخراج RNA و ساخت cDNA.. 36
3-4-2- مرحله PCR. 37
3-4-2-1- آغازگرهای اختصاصی.. 38
3-5- روش تهیه ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR…………………………………. 39
3-6- ترادفیابی محصول PCR. 40
3-7- تجزیه و تحلیل داده ها 40
4-1- نتایج آزمون الایزا 42
4-2- نتایج آزمون RT-PCR. 43
4-3- تنوع ژنتیکی بین جدایههای WMV……………………………………………………………………………… 46
4-4- نوترکیبی بین جدایههایWMV…………………………………………………………………………………… 47
4-5- مقایسه شباهتها و تفاوتهای ناحیه CP جدایههای WMV در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی 52
6- موتیفهای موجود در جدایه WMV ………………………………………………………………………………. 55
فصل پنجم:
بحث……………………………………………………………………………………………………………………………….. 57
پیشنهادات اجرایی و پژوهشی…………………………………………………………………………………………………. 62
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………… 63
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول 1-1- برآورد سطح، تولید و عملکرد در هکتار محصولات زراعی استان گلستان…………………… 4
جدول 3-1- تعداد نمونه و مزارع نمونه برداری شده در استان گلستان……………………………………….. 35
جدول 3-2- مواد لازم در واکنش PCR………………………………………………………………………………… 38
جدول 3-3- شرایط و سیکلهای حرارتی برنامه ریزی شده برای انجام PCR ……………………………… 38
جدول 3-4- دو جفت آغازگر اختصاصی WMV از ناحیه CP-UTR ………………………………………… 39
جدول 4-1- تنوع ژنتیکی و نسبت جانشینی آمینواسیدی در جدایههای مختلف WMV در جمعیتها و گروههای فیلوژنتیک 47
فهرست شكلها
عنوان صفحه
شکل 4-1- علایم بیماری ویروسی WMV روی برگ و میوه هندوانه…………………………………………. 42
شکل 4-2- نتایج آزمون PCR در ژل آگارز………………………………………………………………………….. 43
شکل 4-3- درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده به روش neighbor joinig………………………………………. 45
شکل 4-4- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرمافزار RDP3 در جدایه یزد که قطعه نوترکیب از جدایه اصفهان است 48
شکل 4-5- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرمافزار RDP3 در جدایه چین که قطعه نوترکیب از جدایه شیلی است 49
شکل 4-6- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرمافزار RDP3 در جدایه ژاپن که قطعه نوترکیب یکی از جدایههای فرانسه است 50
شکل 4-7- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرمافزار RDP3 در جدایه فرانسه که قطعه نوترکیب یکی دیگر از جدایههای فرانسه است 51
شکل 4-8- درصد شباهت و تفاوت جدایه WMV گلستان با سایر جدایههای این ویروس در دنیا بر اساس همردیف سازی ترادفهای نوکلئوتیدی ژن CP 53
شکل 4-9- درصد شباهت و تفاوت جدایه WMV گلستان با سایر جدایههای این ویروس در دنیا بر اساس هم ردیف سازی ترادفهای آمینواسیدی ژن CP 54
-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی (کدو، خیار، خربزه، هندوانه)
به طورکلی سیستم ریشهای گیاهان صیفی زراعی، گسترده اما کم عمق است و بیشتر ریشهها در یک متری فوقانی خاک قرار دارد. ساقه اصلی از محور گیاهچه رشد می کند و ممکن است شاخههای جانبی کم یا زیاد (8 یا بیشتر) داشته باشد که از گرههای نزدیک قاعده ساقه بیرون میآیند. در هیچ یک از گیاهان صیفی عوامل خود ناسازگاری شناخته شده وجود ندارد (امیر اصلانی، 1384).
تیره كدوئیان شامل 100 جنس و حدود 1000 گونه است. برگهای این گیاهان، ساده، متناوب، دارای دمبرگ دراز و پهنك كامل یا لوبدار و در هرحال فاقد استیپول است. گلهای آنها منظم، یكپایه، مركب از قطعات 5 تایی، منفرد یا مجتمع به صورت گرزن است (بیتس و همکاران، 1990). نباتات خانواده کدوئیان تمام خزنده و ساکن نواحی گرم و بنابراین حساس به سرما میباشند. هرچند که قسمت مورد استفاده گیاهان خانواده کدوئیان میوه آن میباشد معهذا این گیاهان را جزو سبزیها قرار دادهاند (شیبانی، 1364).
در جنس Cucumis دو نوع گیاه قرار میگیرد یکی انواع خربزه و طالبی (C.melo) و دیگری خیار (C.sativus). در جنس Cucumis مانند سایر افراد خانواده کدوئیان بوتهها بیشتر یک پایه هستند ولی گاهی گیاه دوپایه و ندرتاً گل دوجنسی در بوتههای خربزه و خیار دیده میشود. از نظر گیاهشناسی بوته خربزه و خیار بسیار شبیه به یکدیگر میباشند یعنی در هر دو گیاه برگها گرد قلبی شکل بوده و دارای رنگ سبز روشن میباشد ولی رشد بوته خربزه خیلی زیادتر از رشد بوته خیار است، گلهای نر و ماده از هم جدا و در بغل برگها قرار دارند (شیبانی، 1346).
بوته هندوانه (citrullus lanatus)گیاهی است یکساله از خانواده کدوئیان که دارای شاخههای خزنده میباشد. برگ بوته هندوانه تقریباً قلبی شکل و دارای بریدگیهای عمیق است و اغلب این بریدگی اصلی دارای بریدگیهای فرعی یا ثانوی میباشد. گلهای نر و ماده همیشه از هم جدا هستند ولی روی یک پایه قرار دارند (شیبانی، 1346).
انواع کدوها از جنس Cucurbita و از خانواده Cucurbitaceae میباشند. این گیاهان مانند سایر جنسهای این خانواده یک پایه و گرمسیری و اغلب یکساله هستند و انواع کدوهای اهلی که میوه آنها مورد استفاده انسان قرار میگیرد از
[دوشنبه 1399-10-01] [ 01:05:00 ب.ظ ]
|