چکیده

ویروس موزاییک هندوانه (WMV) یکی از ویروس­های مهم جالیز است که گسترش جهانی دارد و از بسیاری از مناطق دنیا گزارش شده است. به دلیل اهمیت کشت جالیز در استان گلستان و آلودگی گسترده ویروس در این گیاهان شناخت دقیق وضعیت ویروس در منطقه مهم می­باشد. یه منظور شناسایی این ویروس، 100 نمونه از گیاهان هندوانه، خربزه، کدو و خیار با علایم مشکوک به بیماری از مزارع استان گلستان جمع‌ آوری و با آنتی سرم اختصاصی WMV در آزمون الایزای غیر مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. از گیاهان آلوده، RNA ویروس با بهره گرفتن از کیت (Roche) mRNA capture استخراج و cDNA تهیه گردید. جهت تکثیر ناحیه پروتئین پوششی ویروس از آغازگرهای اختصاصی در واکنش RT-PCR استفاده گردید. محصول PCR به طور مستقیم ترادف یابی شد و ترادف به دست آمده شامل 964 نوکلئوتید همراه با 31 ترادف انتخاب شده از GenBank مقایسه شدند. همردیف­سازی­های چندگانه و آنالیزهای فیلوژنتیک و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرم‌افزارهای DNASTAR، DNAMAN، Clustal X وMEGA5  انجام و درخت فیلوژنتیک به روش neighbor-joining ترسیم گردید. برای آنالیز نوترکیبی بین جدایه­ها از نرم افزار RDP3 با بهره گرفتن از متد BootScan استفاده شد. در این بررسی تعداد 18 نمونه در واکنش الایزای مثبت و بقیه منفی بودند. نتایج بدست آمده از درخت فیلوژنتیکی این جدایه­ها را در 4 گروه قرار داد که همه جدایه­های استان گلستان در یک گروه و در کنار جدایه­هایی از اصفهان، شیروان، مشهد، کرمان، یزد و تعدای از کشورهای اروپایی قرار گرفتند و بیشترین شباهت را به جدایه­ای از اصفهان داشت و در میان سایر کشورها به جدایه ترکیه (6/96%) در سطح نوکلئوتیدی شبیه تر بود و در سطح آمینواسیدی بیشترین درصد تشابه را با جدایه اسپانیا (3/97%) داشت. محاسبه تنوع ژنتیکی (π) نشان داد که برای تمامی گروه­ها این میزان 061/0 می باشد. نسبت dN/dS در گروه­های فیلوژنتیک کمتر از 1 بدست آمد که نشان دهنده نقش موثر انتخاب منفی در تنوع و تکامل این ویروس می­باشد. همچنین نتایج نشان داد که در میان جدایه­های ایرانی تنها یک مورد نوترکیبی وجود دارد که مربوط به جدایه یزد بوده که در ناحیه ابتدای ژن پرتئین پوششی خود ترکیبی از ترادف نوکلئوتیدی جدایه اصفهان را دارا می­باشد. اما در بین جدایه­های سایر کشورها اکثر موارد نوترکیبی در ناحیه CP ژنوم ویروس مشاهده می­ شود. با این وجود می­­توان با انجام آنالیزهای اجدادی بررسی کرد که جد اصلی این ویروس مربوط به کدام منطقه جغرافیایی است و به ترادف نوکلئوتیدی کدام کشور نزدیکتر است.

کلمات کلیدی: ویروس موزاییک هندوانه، تنوع ژنتیکی، نوترکیبی، الایزای غیر مستقیم، RT-PCR

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه

فصل اول:

1-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی.. 2

1-2- اهمیت محصولات جالیزی.. 3

1-3- سطح زیر کشت.. 4

1-4- بیماری‌های ویروسی جالیز. 4

2-1- ویژگی­های گروه پوتی­ویروس…………………………………………………………………………………….. 8

2-2- ویروس موزاییک هندوانه……………………………………………………………………………………………. 9

2-2-1- دامنه­ میزبان……………………………………………………………………………………………………… 10

2-2-2- اپیدمولوژی ویروس……………………………………………………………………………………………… 11

2-2-3- نشانه­ های بیماری ویروس موزاییک هندوانه……………………………………………………………… 12

2-3- تمایز سرولوژیکی جدایه­های ویروس…………………………………………………………………………… 13

2-4- نوترکیبی و تنوع ژنتیکی ویروس­های گیاهی…………………………………………………………………. 14

2-5- تنوع ژنتیکی ویروس موزائیک هندوانه. 16

2-6- بررسی­های صورت گرفته در مورد ویروس موزاییک هندوانه در دنیا…………………………………… 17

2-6-1- ویروس موزاییک هندوانه درایران……………………………………………………………………………. 17

2-6-2- ویروس موزاییک هندوانه در خارج از کشور……………………………………………………………. 22

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- زمان و مکان تحقیق………………………………………………………………………………………………….. 34

3-2- جمع آوری نمونه­ها و داد­ه………………………………………………………………………………………… 34

3-3- آزمون الایزا…………………………………………………………………………………………………………….. 35

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه

3-3-1- آزمون الیزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………. 35

3-4- آزمون PCR. 36

3-4-1- استخراج RNA و ساخت cDNA.. 36

3-4-2- مرحله PCR. 37

3-4-2-1- آغازگرهای اختصاصی.. 38

3-5- روش تهیه­ ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR…………………………………. 39

3-6- ترادف‌یابی محصول PCR. 40

3-7- تجزیه و تحلیل داده ­ها 40

4-1- نتایج آزمون الایزا 42

4-2- نتایج آزمون RT-PCR. 43

4-3- تنوع ژنتیکی بین جدایه­های WMV……………………………………………………………………………… 46

4-4- نوترکیبی بین جدایه­هایWMV…………………………………………………………………………………… 47

4-5- مقایسه شباهت­ها و تفاوت­های ناحیه CP جدایه­های WMV در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی 52

6- موتیف­های موجود در جدایه WMV ………………………………………………………………………………. 55

فصل پنجم:

بحث……………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

پیشنهادات اجرایی و پژوهشی…………………………………………………………………………………………………. 62

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………… 63

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                                 صفحه

جدول 1-1- برآورد سطح، تولید و عملکرد در هکتار محصولات زراعی استان گلستان…………………… 4

جدول 3-1- تعداد نمونه و مزارع نمونه برداری شده در استان گلستان……………………………………….. 35

جدول 3-2- مواد لازم در واکنش PCR………………………………………………………………………………… 38

جدول 3-3- شرایط و سیکل‌های حرارتی برنامه ریزی شده برای انجام PCR ……………………………… 38

جدول 3-4- دو جفت آغازگر اختصاصی WMV از ناحیه CP-UTR ………………………………………… 39

جدول 4-1- تنوع ژنتیکی و نسبت جانشینی آمینواسیدی در جدایه­های مختلف WMV در جمعیت­ها و گروه‌های فیلوژنتیک   47

فهرست شكل‌ها

عنوان                                                                                                                 صفحه

شکل 4-1- علایم بیماری ویروسی WMV روی برگ و میوه هندوانه…………………………………………. 42

شکل 4-2- نتایج آزمون PCR در ژل آگارز………………………………………………………………………….. 43

شکل 4-3- درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده به روش neighbor joinig………………………………………. 45

شکل 4-4- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرم‌افزار RDP3 در جدایه یزد که قطعه نوترکیب از   جدایه اصفهان است 48

شکل 4-5- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرم‌افزار RDP3 در جدایه چین که قطعه نوترکیب از جدایه شیلی است     49

شکل 4-6- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرم‌افزار RDP3 در جدایه ژاپن که قطعه نوترکیب یکی   از جدایه­های فرانسه است  50

شکل 4-7- گراف نوترکیبی ترسیم شده با بهره گرفتن از نرم‌افزار RDP3 در جدایه فرانسه که قطعه نوترکیب یکی دیگر از جدایه­های فرانسه است        51

شکل 4-8- درصد شباهت و تفاوت جدایه WMV گلستان با سایر جدایه­های این ویروس در دنیا بر اساس هم­ردیف سازی ترادف­های نوکلئوتیدی ژن CP    53

شکل 4-9- درصد شباهت و تفاوت جدایه WMV گلستان با سایر جدایه­های این ویروس در دنیا بر اساس   هم ردیف سازی ترادف­های آمینواسیدی ژن CP  54

-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی (کدو، خیار، خربزه، هندوانه)

به طورکلی سیستم ریشه‌ای گیاهان صیفی زراعی، گسترده اما کم عمق است و بیشتر ریشه­ها در یک متری فوقانی خاک قرار دارد. ساقه اصلی از محور گیاهچه رشد می­ کند و ممکن است شاخه‌های جانبی کم یا زیاد (8 یا بیشتر) داشته باشد که از گره‌های نزدیک قاعده ساقه بیرون می­آیند. در هیچ یک از گیاهان صیفی عوامل خود ناسازگاری شناخته شده وجود ندارد (امیر اصلانی، 1384).

تیره كدوئیان شامل 100 جنس و حدود 1000 گونه است. برگ­های این گیاهان، ساده، متناوب، دارای دمبرگ دراز و پهنك كامل یا لوب­دار و در هرحال فاقد استیپول است. گل­های آنها منظم، یكپایه، مركب از قطعات 5 تایی، منفرد یا مجتمع به صورت گرزن است (بیتس و همکاران، 1990). نباتات خانواده کدوئیان تمام خزنده و ساکن نواحی گرم و بنابراین حساس به سرما می‌باشند. هرچند که قسمت مورد استفاده گیاهان خانواده کدوئیان میوه آن می‌باشد معهذا این گیاهان را جزو سبزی­ها قرار داده‌اند (شیبانی، 1364).

در جنس Cucumis دو نوع گیاه قرار می­گیرد یکی انواع خربزه و طالبی (C.melo) و دیگری خیار (C.sativus). در جنس Cucumis مانند سایر افراد خانواده کدوئیان بوته‌ها بیشتر یک پایه هستند ولی گاهی گیاه دوپایه و ندرتاً گل دوجنسی در بوته‌های خربزه و خیار دیده می‌شود. از نظر گیاهشناسی بوته خربزه و خیار بسیار شبیه به یکدیگر می‌باشند یعنی در هر دو گیاه برگ­ها گرد قلبی شکل بوده و دارای رنگ سبز روشن می‌باشد ولی رشد بوته خربزه خیلی زیادتر از رشد بوته خیار است، گل­های نر و ماده از هم جدا و در بغل برگ­ها قرار دارند (شیبانی، 1346).

بوته هندوانه  (citrullus lanatus)گیاهی است یکساله از خانواده کدوئیان که دارای شاخه‌های خزنده می‌باشد. برگ بوته هندوانه تقریباً قلبی شکل و دارای بریدگی­های عمیق است و اغلب این بریدگی اصلی دارای بریدگی­های فرعی یا ثانوی می­باشد. گل­های نر و ماده همیشه از هم جدا هستند ولی روی یک پایه قرار دارند (شیبانی، 1346).

انواع کدوها از جنس Cucurbita و از خانواده Cucurbitaceae می‌باشند. این گیاهان مانند سایر جنس­های این خانواده یک پایه و گرمسیری و اغلب یکساله هستند و انواع کدوهای اهلی که میوه آنها مورد استفاده انسان قرار می‌گیرد از