فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه                                 

چکیده                                                                                                                                       1

مقدمه                                                                                                                                       3       

فصل اول: کلیات

1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول……………………………………………………………………….           12

1-2-راه انتقال                                                                                                   13

1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست……………………………………………………………………………..           14

1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی……………………………………………………………………………….           15

1-2-3-انتقال از طریق جفت  …………………………………………………………………………………………………….           15

1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی………………………………………………………………………….           16

1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی…………………………………………………           18

1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل………………………………………………………………………………………………….           18

1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان………………………………………………………………………………………………           18

1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط……………………………………………………………………………………………….           19

1-4-آنتی ژنهای توكسوپلاسما گوندی…………………………………………………………………………………………           19

1-5-واکسیناسیون ……………………………………………………………………………………………………………………….   21

1-6-بیماریزایی                                                                                                  22

1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی………………………………………………………………………………………………..           24

1-8-تظاهرات بالینی …………………………………………………………………………………………………………………….           25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز……………………………………………………………………………………………………….           29

1-9-1- تشخیص مستقیم……………………………………………………………………………………………………………             29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی………………………………………………………………………….             29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی………………………………………………………………………………..             30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم………………             30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ………………………………………………………………………………………………………            31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن…………………………………………………………………………………….             34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم…………………………………………………………..             34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت……………………………………………………………….             35

1-10-الایزا (ELISA)………………………………………………………………………………………………………………….             35

1-10-1- الایزای مستقیم …………………………………………………………………………………………………………..             36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………………….             36

1-10-3- الایزای ساندویچ……………………………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم…………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم………………………………………………………………………………….             37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری……………………………………………………………………………………………….             37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ……………………………………………….             38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب……………………………………………………………………………………………………..             39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی………………………………………………             39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت………………………………………………………………………………..             40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس………………………             42

1-16-درمان                                                                                                      44

1-17-پیشگیری                                                                                                  47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن…………………………………………………………………………………………………..             48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ………………………………………………………………………………………………………             50

1-20-اهداف و فرضیا ت …………………………………………………………………………………………………………….             51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته                             

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته ……………………………………………………………………………………………………………..  53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………………………………..             59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی………………………………………………             59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ………………………………………………………………………………………………………………             60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده………………………………………………………………………..             62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE             62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات…………………………………………………..            66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده……………………………………………………………………………………………             71

 

3-4- تعیین غلظت پروتئین…………………………………………………………………………………………………………             71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) ……………………………………………………………………………………………             71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا……………………………………………………………………………………………..             72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا………………………………………………………………………………………………             72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا……………………………………………………………………………………………             74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا…………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا      …………………………………………………………………………             76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم     ……………………………………             77

3-8-تعیین Cut off  در روش الایزا …………………………………………………………………………………………..             80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun …………………………………             81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ………………………………             82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG …………………………………             82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6                                                                                                   83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از کیت تجاری EUROIMMUN  …..             83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index  با بهره گرفتن از کیت تجاری Microgen…………………             85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ………………………………             88

3-16- کنترل کیفی …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-16-1- حساسیت …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-17-طراحی تحقیق     …………………………………………………………………………………………………………….             88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری  …………………………………………………………………………………..             89

3-18-1- تعداد نمونه ………………………………………………………………………………………………………………….             89

3-18-2- روش نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………             89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6                                                                                                   92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ………………………………………..             93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun                 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… .           95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun        95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun  ……………………………………………………………………………………………………………………            96

4-4- برقراری شرایط ELISA  Avidity با پروتئین های نوترکیب  ……………………………………….           100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با بهره گرفتن از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار………………………………………………………………………………..           103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با بهره گرفتن از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران  ……………………………………………………………………..           103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با بهره گرفتن از کیت Microgen……………………………………………………………………………….           104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع                                                                                                                                       121

خلاصه انگلیسی   …………………………………………………………………………………………            127

ضمائم                                                                                                                                      129

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                   صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن………………………………………………………………..            87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon………            97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7     …………………………………………………………………………………………………………………….           106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل1-1- شكل شماتیک یک تاكی زوایت و یک برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی …………..              4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یک تاكی زوایت، سوش  VEGكه در حال

نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می باشد………………………………………………………………………………….              7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش…………………………………………………………………………………………              8

شکل1-4- یک كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد…….              9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط………………             16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی………………………………………..            25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا………………………………………………………………………………………….             38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………….             87

شکل 4-1  : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………..             92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………..             93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ………………………………………………………………………………………………..             94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA6 …………………………………………………………………………           101

شکل 4-5 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA6……………………………………….           101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA7…………………………………………………………………………..           102

شکل 4-7 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با بهره گرفتن از پروتئین GRA7………………………………………..           102

شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای……………………….           105

شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………………………… 106

شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق

عفونت حاد و مزمن و تحت حاد…………………………………………………………………………………………………..           107

 

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توكسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد تركیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند.  شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با بهره گرفتن از دو پروتئین GRA7 وGRA6  برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارایی روش avidity ELISA با بهره گرفتن از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با بهره گرفتن از تست های استاندارد سرولوژیک برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا  داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم  آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با بهره گرفتن از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.

کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه

 

تاریخچه و طبقه بندی

انگل توکسوپلاسما گوندی[1]، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو[2] در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی[3] در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور[4] در برزیل در یک خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا  است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توكسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود كه انگل از اتوپسی چشم یک كودك مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توكسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیكی تست رنگی[5] به وسیله سابین و فلدمن[6] در 1948 )5(، به طور دقیق  مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل[7] در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاكسونومیک توكسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شكل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن[8] در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.

Kingdom: Protozoa

Phylum: Apicomplexa

Class: Sporozoea

 Sub-class: Coccidia

تهران با روش مولکولی Triplex-PCR

 

فهرست مطالب                                                                     عنوان

خلاصه فارسی1. .. ..

مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

(1-1 تاریخچه پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

(2-1 تقسیم بندی پیکورنا ویورس ها ……………………………………………………………………………………………………………………………….  4

(3-1 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ………………………………………………………………………………………………………………………………… 8

(4-1 ساختمان پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

(5-1 ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………..  13.

(6-1 سیکل تکثیر پیکورنا ویورس ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 16.

(7-1 ترجمه ژنوم پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………… 23

(8-1 پردازش پلی پروتئین در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………. 23

(1-8-1 پروتئین L …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 24

(2-8-1 پروتئین 2A ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24

(3-8-1 پروتئین 3C ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24.

(9-1 تکثیر ژنوم و سنتز mRNA ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 25.

(1-9-1 RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی …………………………………………………………………………………………………………. 26

(2-9-1 پروتئین 3D  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26

(10-1 نقش پروتئین های کمکی در تکثیر ژنوم ……………………………………………………………………………………………………………. 27

(1-10-1 پروتئین 2B ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27

(2-10-1 پروتئین 2C ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27

(3-10-1 پروتئین 3AB ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 27.

(4-10-1 پروتئین فرعی سلول ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28.

(5-10-1 پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA …………………………………………………………………………………………….. 28.

(11-1 محل سنتز RNA در سلول ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 29

(12-1 چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر ……………………………………………………………………………………….. 31

(13-1 مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی …………………………………………………………………………………………………………………….. 32

(14-1 پاراکوویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

(1-14-1 جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروس ………………………………………………………………………………………………………. 33

(2-14-1 پروتئین های پاراکوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

(3-14-1 پردازش پروتئین در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………… 35

(4-14-1 توالی 5´-UTR در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………….. 36

(5-14-1 ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها با پیکورنا ویروس های دیگر …………………………………………………………………………… 38

(6-14-1 تداخلات بین HPeV1-2 با سطح سلولهای حساس  ………………………………………………………………………………………39

(7-14-1 عوارض کلینیکی و اپیدومیولوژی پاراکوویروس ها ……………………………………………………………………………………………. 41

(8-14-1 ویروس های مرتبط با پاراکوویروس ها در حیوانات …………………………………………………………………………………………. 41

جداول:

جدول 1) اعضای خانواده پیکورنا ویریده ………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس …………………………………………………………………… 19

جدول 3) میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بینHPEV-1  وHPEV-2   …………………………………………………………..43 .

جدول 4)  تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55

جدول 5) تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………….57

جدول 6) توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه5´ UTR ……………………………………………………………………….. 59

جدول 7) نتیجه مقایسه سکانس توالی های 5UTR  با بانک ژنی به روش blast…………………………………………………………………. 65

جدول 8 )نتایج blast محصول PCR ………………………………………………………………………………………. …………………………………………….73

 

جدول 9- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR……………….76

جدول10 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب جنس . …76

جدول11- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب سن.. . …76

جدول 12- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب فصل .. ….76

نمودار:

نمودار1- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR .. ….77

نمودار-2 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب جنس …77

نمودار-3 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب سن .. …..78.

نمودار4 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب فصل .. …78

 اشکال:

شکل 1) نمای شماتیک کپسید ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 9 ..

شکل 2) دیاگرام شماتیک 8 زنجیره β .. ……………………………………………………. 11

شکل 3) مدلی از پولیوویروس تیپ 1 . . ………………………… 11

شکل 4) تداخلات میریستات با پروتئین های سطح ویروس  …………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 5) تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 6) دو تیپ اصلی از IRES در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………… 15

شکل 7) چرخه تکثیر پیکورناویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………… 17

شکل 8) تصویر شماتیکی از Canyon …………………….20

شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP1 ……………………………………………………………………………………………… 20

شکل 10) مدل دخول پیکورنا ویروسها به درون سلول ………………………………………………………………………………………………………. 22

شکل 11) مکانیسم فرضی برای عبور RNA پیکورنا ویروس ها از عرض غشا ……………………………………………………………….. 22

شکل 12) تصویر سه بعدی از 3C pro ویروس هپاتیت A ، 2A pro رینو ویروس و  FMDV Lpro …………………………… 25 ..

شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتدای ژنوم پیکورنا ویروسها، محل کلیواژ vpg………………………………………………………….. 29 …

شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئین …………………………………………………………………… ………………………………………………….. 30

شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………… 31

شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD pro در این مرحله ……………………………………………….. 32

شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویرس ها ……………………………………………………………………………………………………………………… 33

شکل 18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………… 36

شکل 19) دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه ………………………………………………………………………………………………………………………… 37

شکل 20) دندروگرافی براساس پروتئین  VP3 در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………… 38

شکل 21) مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوسیلی از VP1 در بین پاراکوویروس ها و CAV ………………………. 39.

شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکوویروس انسانی تیپ 1 ……………………………………………………………………………………….. 40

شکل 23) ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروس ها و ایزوله های تازه جداشده از ویروس L jungan درحیوانات……………..42

 فصل اول

کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44

• بیان مساله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

(2-1 فرضیه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46                                                            (3-1اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

1-4)ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47                                                               

فصل دوم

مروری بر متون گذشته………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48

                                                                 فصل سوم 

مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51

(1-3آماده سازی میكروتیوب و سرسمپلرها…………………………………………………………………………………………………………………………52

(2-3  مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون ……………………………………………………………………………………………………………………………..52

(3-3 جداسازی RNA و ساخت cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………….53

(4-3سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-5) Compatent……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55

3-6) ترا نسفورم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید)……………………………………………………………………………………………………………58

PCR (8-3……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

(9-3 روش تهیه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60

(10-3 روش آماده سازی مارکر 1kb……………………………………………………………………………………………………………………………………60

11-3)تکنیک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61

(12-3تهیه بافر الكتروفورز 1x………………………………………………………………………………………………………………………………………………61

(13-3روش استخراج DNA‌از ژل …………………………………………………………………………………………………………………………………….61

فصل چهارم

نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

مقایسه blast برخی توالی های مثبت با توالی موجود در بانک ژنی…………………………………………………………………………………..66

                                                                 فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….80

نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84

توصیه ها و پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………..85

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86

خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………….100.          

خلاصه:

پار اکو ویروس انسانی که به خانواده پیکورنا ویروس ها تعلق دارد, بدون غشا بوده و دارای ژنوم   RNAتک رشته با قطبیت مثبت می باشد . اندازه ژنوم این ویروسKb 4/8 – 2 /7می باشد. این ویروس با بروز عفونت های گوارشی و تنفسی و گاهی عفونت های سیستم اعصاب مرکزی مرتبط است. از آنجا یی که هیچ اطلاعات درستی در مورد ژنوتایپ این ویروس در ایران وجود نداشته است این مطالعه  به منظور تشخیص سریع , تعیین ژنوتایپ این ویروس در نمونه های مدفوع کودکان  ایرانی زیر چهار سال مبتلا به گاستروآنتریت طراحی شده است. RNA از سوسپانسیون مدفوع استخراج شده وcDNA  تهیه  گردید و nested PCR  با پرایمرهای اختصاصی انجام شد و محصول  PCRاز ژل آگارز استخراج و تعیین توالی گردید . نتایج نشان داد که تکنیک RT-PCR برای تشخیص مستقیم HPeV  در نمونه های کلینیکی کاربردی تر, حساس تر , سریعتر از  روش کشت سلولی می باشد. این موضوع تایید میکند که روش RT-PCR روشی برتر برای تشخیص این ویروس درزمانی کوتاهتر و با هزینه کمتر می باشد. همچنین تشخیص سریع می تواند مانع مصرف بی رویه آنتی بیوتیک گردد.

کلمات کلیدی :  پیکورناویروس- پاراکوویروس انسانی- گاستروآنتریت

مقدمه

 

1-1 )تاریخچه پیکورنا ویروس:                                                                                                                                                                                                                                       

پیکورنا ویروس ها دلیل نام آنها کوچکی آنهاست که پیکو(Pico) به زبان آلمانی به معنای کوچک است یعنی  ویروسهای کوچک RNA دار, و پاراکوویروس از خانواده پیکورنا ویروس ها می باشد.

پیکورنا ویروس ها، ویروس های کروی شکلی هستند که دارای ژنوم RNA ی تک زنجیره با قطبیت مثبت  (+ssRNA)  می باشند.اندازه این ویروس ها از kb 7.2 در (ردیف ویروس انسانی) تا Kb 7.4 در (پولیوویروس، هپاتیتA) و تا kb8.4 در (آفتو ویروس ها) متغیر است (1).

پیکورنا ویروس ها نقش شگرفی در پیشرفت ویروس شناسی مدرن داشته اند، به طوریکه FMDV[1] اولین ویروس حیوانی بود که در سال 1898 توسط Frosch , Loeffler کشف گردیده. ده سال بعد در اواخر قرن بیستم، با ظهور اپیدمی پولیومیلیت شاهد ایزوله شدن عامل این عفونت (پولیوویروس) توسط popper , landsteinerk بودیم. 40سال بعد دریافتند که پولیوویروس قادر است در کشت سلولی رشد نماید. این یافته آغاز راهی برای مطالعه تکثیر ویروسها بود.

چکیده

خسارات ناشی از دما های سرد بحرانی بویژه در اکوسیستم های طبیعی و مناطق پرجمعیت شهری در حال افزایش است. ایران مرکزی سرزمینی خشک و مستعد رخداد سرما بویژه طی زمستان است و فاقد منابع تعدیل کننده تنش های دما مانند منابع آب و پوشش گیاهی انبوه است. در تحقیق حاضر برای تعیین امواج سرمای ایران مرکزی، داده های دمای بیشینه روزانه مربوط به مجموع هشت شهر شامل شاهرود، تهران، سمنان، کاشان، اصفهان، یزد، کرمان و بم تهیه و دماهای صفر و زیرصفر آنها به عنوان امواج سرما استخراج شد. بر این اساس، تعداد 47 موج سرما در بازه آماری (1980-2012) شناسایی شد و در دومین مرحله بر پایه 2 معیار زمانی و مکانی یعنی به ترتیب دو روز دوام و درگیری دو ایستگاه و بیشتر، 17 مورد سرمای بحرانی تعیین شد. گشایش پرونده های داده های ترازی هوا تهیه شده از بایگانی NCEP/NCAR، تبدیل آنها به پوشه های متنی طی تاریخ های سرماهای بحرانی و رسم نقشه های هوای روزانه و ترکیبی با بهره گرفتن از نرم افزار Surfer سه مرحله از کار بود که به طراحی الگوهای همدید برای تعیین تراز و سمت غالب فرارفت هوای سرد سیبری انجامید. نتایج نشان داد که فرارفت سرما بسوی ایران مرکزی طی 70 درصد مواقع در پایین ترین ترازها (ترازهای دریا و 1000 هکتوپاسکال) و در قالب زبانه های پرفشار سیبری رخ داده است و تنها در 12 درصد اثر پرفشار ارتفاعی تبت و 17 درصد اثر پرفشارهای سرد مهاجر (غربی) آشکار شد.

     تحلیل الگوهای های بردار باد و دما در تراز 1000 ه. پ برای آزمون سمت فرارفت هوای سرد طی روزهای رخداد سرماهای بحرانی نشان داد که بردارهای باد در 70 درصد مواقع (12 مورد از 17 مورد)، از سمت جنوب شرق به عنوان دنباله بادهای شرقی از روی افغانستان و پاکستان و گاهی هم از سمت شمال شرق و شرق بر گستره ایران مرکزی راه یافته اند.

کلیدواژه ها: ایران مرکزی، سرمای بحرانی، فرارفت شرقی.

 چکیده فارسی.. n

تشکر. n

تقدیم.. n

فهرست مطالب… ………الف

فهرست شکل ها ح

فهرست جدول ها د

1-1. بیان مسأله. 2

n توده هوای عموما گرم وخشک ناشی از پرفشاره جنب حاره 2

nتوده های هوای سرد و خشک ناشی از پرفشار سیبری.. 2

n توده های هوای اقیانوسی مدیترانه ای ناشی از ورود بادهای غربی  2

n توده هوای نسبتا گرم و مرطوب ناشی از ورود زبانه های کم فشار سودانی  3

1-1-1. اهمیت سرماهای بحرانی از نظر محققان.. 3

n به لحاظ مفهومی.. 3

n به لحاظ کمی.. 3

n به لحاظ پیامدها و زیان ها 4

1-1-2. اهداف تحقیق.. 5

1-2. پیشینه تحقیق.. 5

n تحقیقات مربوط به شرایط و چگونگی تشکیل پرفشار سیبری  6

n تحقیقات مربوط به روابط پویشی پرفشار سیبری با دیگر سامانه های دور در قالب پیوند از دور 6

n تحقیقات مربوط به قلمرو گسترش زبانه های هوای سرد پرفشار سیبری  7

n تحقیقات مربوط به شرایط زمانی و مکانی پرفشار سیبری در سرزمین ایران  8

2-1. بنیادهای پژوهش…. 10

2-1-1. هوا 10

2-1-2. آب وهوا 11

2-1-3. دما 11

2-1-4. تغییرات دمایی.. 11

2-1-5. آستانه. 12

2-1-6. حداکثر دمای روزانه. 12

2-1-7. حداقل دمای روزانه. 12

2-1-8. روز سرد. 12

2-1-9. دمای بحرانی.. 12

2-1-10. وزش هوا 12

2-1-11. فرارفت هوای سرد. 12

2-1-12. فشار 13

2-1-13. شیب تغییرات فشار 13

2-1-14. توده های هوا 13

2-1-15. مفهوم همدید. 13

2-1-16. نقشه های هوا 13

2-1-17. ایستگاه همدید. 14

2-1-18. آب و هواشناسی همدید. 14

2-1-19. ناوه (زبانه کم فشار) 14

2-1-20. پشته (زبانه پرفشار) 15

2-1-21. پرفشارها (آنتی سیکلون) 15

2-1-22. پرفشارهای گرمایی.. 15

2-1-23. پرفشار های پویشی.. 16

2-1-24. نقشه سطح متوسط دریا 16

2-1-25. نقشه های ترازهای بالای جو. 16

2-1-26. نقشه های هم ارتفاع ژئوپتانسیل.. 16

2-1-27. پرفشار سیبری.. 17

2-1-28. عامل اصلی تشکیل پرفشار سیبری.. 18

2-1-29. گسترش پرفشار سیبری روی ایران.. 19

2-1-30. پرفشار جنب حاره 19

2-1-31. بادهای غربی.. 19

2-1-32. کم فشار سودان.. 19

2-1-33. واچرخند عربستان.. 20

2-2. سرزمین پژوهش…. 20

 

 

2-2-1. سیمای طبیعی ایران مرکزی.. 20

2-2-2. پهنه های آبی اثر گذار بر ایران مرکزی.. 22

< دریای مدیترانه. 22

<دریای سرخ و خلیج عدن.. 22

<دریای سیاه 22

2-2-3. پراکنش دما 23

2-2-4. میانگین دمای ماهانه. 24

2-2-5. دمای بیشینه مطلق ماهانه. 25

2-2-6. دمای کمینه مطلق ماهانه. 26

2-2-7. بارش سالانه. 27

2-2-8. میانگین ماهانه بارش…. 28

2-2-9. پراکنش فشار 30

2-2-10. میانگین ماهانه سمت و سرعت باد غالب در هشت ایستگاه نمونه  32

3-1. پرسش‌های پژوهش…. 36

3-2. فرضیات پژوهش…. 36

3-3. گزینش سرزمین پژوهش و ایستگاه های داده سنجی.. 36

3-4. منابع داده ها 38

3-5. تعیین ویژگی های عمومی آب‌وهوایی سرزمین پژوهش…. 38

3-6. مراحل شناسایی و استخراج موج های سرما 39

3-7. معیار تعیین موج های سرما 42

3-8. معیار تعیین موج سرمای بحرانی.. 42

3-9. معیار تعیین روز اوج سرمای بحرانی.. 42

3-10. مراحل آزمون فرضیه نخست تحقیق.. 43

3-10-1. تهیه داده های ترازی.. 43

3-10-2. تبدیل داده های فشرده به متن.. 43

3-9-3. تعیین محدوده طراحی الگوهای همدید. 43

3-10-4. تبدیل داده های رقومی به نقشه. 44

3-10-5. ترسیم نقشه های ارتفاعی.. 45

3-10-6. تعیین بیرونی ترین پربند بسته برای هر سرما 46

3-10-7. تعیین پربند پشتیبان پرارتفاع سیبری.. 47

3-11. مراحل آزمون فرضیه دوم. 47

3-11-1. رسم نقشه های بردار باد. 47

3-11-2. رسم نقشه های خطوط جریان باد. 48

3-11-3. رسم نقشه های دما 48

3-11-4. کمی کردن نقشه های بردار باد. 48

3-11-5. اسکریپت نویسی میانگین بردارهای باد. 48

3-11-6. اسکریپت نویسی تعیین جهت و سمت غالب بردارهای باد 49

3-11-7. فراخوانی اسکریپت dat.gs به محیط GrADS. 50

3-11-8. کارتوگرافی و تکنیک رسم نقشه ها 52

4-1. تحلیل آماری 47 موج سرماهای بحرانی 53

4-1-1. سه ویژگی سرماهای بحرانی.. 55

<دوام. 55

<شدت… 56

<گسترش مکانی.. 56

4-1-2. نتایج آماری سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 57

4-2. نتایج همدید سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

4-2-1. نقش پرفشار سیبری در سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

<تراز دریا 65

<تراز 1000 ه.پ… 67

<ترازهای 750 و 500 ه.پ… 69

<تحلیل موقعیت پربند پشتیبان.. 73

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 1000 ه.پ… 74

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 750 ه.پ… 75

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 500 ه.پ… 76

4-2-2. نقش فرارفت های شرقی در سرماهای بحرانی ایران مرکزی  77

<سمت باد، دما و خطوط جریان در ترازهای بالا. 77

<تحلیل سرعت و سمت میانگین باد. 87

<تحلیل الگوهای بردار باد در تراز 1000 ه.پ… 88

5-1. آزمون فرض…. 90

5-2. نتیجه گیری.. 91

5-3. پیشنهادها 92

5-4. تنگناهای تحقیق.. 92

<سرچشمه ها 93

<چکیده لاتین.. 97

تغییر در بسامد بلایای آب و هوایی مانند موج های سرما یکی از مهمترین جنبه های تغییر آب و هوا است (کنکال و همکاران؛ 1999). همه ساله افراد زیادی با گسترش و وقوع موج های گرم و یا بوران های سرمایی هلاک می شوند (علیجانی،1390). در این میان دماهای بسیار سرد به عنوان خطر یا بحران برای انسان تعریف شده اند. اساسا عنصر دما از دیرباز مورد توجه آب وهواشناسان بوده (عساکره؛ 1388)، تغییرات کوتاه مدت و درازمدت آن می ­تواند ساختار آب و هوای هر محل را دگرگون سازد.

     بر اساس گزارش هیأت بین الدول آب وهوا (IPPC. 2001)دمای سطح کره زمین در فاصله زمانی 1861-2001 میلادی حدود 0.6 درجه سانتی گراد افزایش یافته است. این درحالی است که رفتار فراسنج دمای حداقل و حداکثر با یکدیگر متفاوت بوده، دمای حداقل به طور آشکاری نرخ افزایشی داشته است. با وجود افزایش دمای حداکثر، نرخ آن از نرخ دمای حداقل کمتر بوده است (کارل و همکاران،1993).

     از این رو بنا به قول شعبانی و همکاران (1392: 896)، مدلسازی متغیرهای حدی دمای هوا و پیش بینی دماهای حداکثر و حداقل به عنوان یکی از مهمترین پارامترهای آب وهوای با توجه به تغییرات آب وهوایی، گرمایش جهانی و خشکسالی­ها، قطعاً فرصت بیشتری را جهت برنامه ریزی و ارائه تمهیدات لازم به خصوص در آب و هواهای خشک و نیمه خشک در اختیار برنامه ریزان قرار می دهد.

1-1). بیان مساله

ایران به دلیل گستردگی زیاد در طول و عرض جغرافیایی، پیچیدگی در پیکربندی ناهمواری ها و یورش توده های هوا با خاستگاه های گوناگون، از نظر دمایی شرایط ویژه ای دارد. تکرار توده های هوایی که به وسیله سامانه های چرخندی و واچرخندی و یا گسترش زبانه های آنها به ایران می رسند و شرایط رطوبتی و دمایی هوای روزمره را تعیین می کنند؛ در درازمدت، شرایط آب و هوایی ایران را به وجود می آورد (علیجانی،1383: 37).

   سرزمین ما به دلیل شرایط جغرافیایی خاص، یعنی موقعیت آن در رابطه با گردش عمومی جو و قرار گرفتن آن در عرضهای جغرافیایی میانه، در فصول مختلف سال تحت تاثیر آنتی سیکلونهایی با منشاهای مختلف و خصوصیات فیزیکی گوناگون قرار می گیرد، از جمله این آنتی سیکلون ها، پرفشار سیبری است که مهم ترین مرکز کنش جوی اوراسیا طی زمستان است و اثر محسوسی بر آب وهوای ایران دارد (لشکری 1375: 4).

   از جمله سامانه های موثر بر توده هوای وارد شونده به سرزمین ایران می توان به موارد زیر اشاره کرد؛

n توده هوای عموما گرم و خشک ناشی از پرفشاره جنب حاره: پرفشاره جنب حاره، سامانه پویشی (دینامیکی) بزرگی در مقیاس سیاره ای است که کانونی روی اقیانوس اتلس شمالی دارد. در دوره گرم سال زبانه ای از پرفشار جنب حاره روی ایران است. قلمرو این زبانه از تراز 700 تا 1000 ه.پ گسترش دارد و سبب حاکمیت هوایی گرم و خشک بر بخش بزرگی از ایران (شبانکار و جلبیان، 1389: ص 48)، بویژه در سرزمین های دور از ساحل می شود. با حرکت پرفشارجنب حاره و رودباد همراه با آن به عرض های پایین تر، از ماه دسامبر و ورود بادهای غربی به ایران در دوره سرد سال (امام هادی، 1383: 36) می توان شاهد ورود توده های هوایی دیگری بود.

n توده های هوای سرد و خشک ناشی از پرفشار سیبری: پرفشار سیبری از میانه ی مهر تا میانه ی فروردین بر آسیا حاکم است. این سامانه نقش دمایی مهمی در ایران بازی می کند و چنانکه پیش از این براتی و علیجانی (1378: 55)، تحقیق کرده اند، طی فصل بهار زبانه های سرمای آن از شمال شمال شرق و گاهی شمال غرب به ایران نفوذ می کنند. مسعودیان (1386: 22) نیز به گسترش این هوای بسیار سرد و خشک بر بخش هایی از کشور اشاره دارد.

n توده های هوای اقیانوسی مدیترانه ای ناشی از ورود بادهای غربی: دریای مدیترانه در مسیر بادهای غربی قرار دارد و اثرات آن از طریق این باد ها به ایران گسترش می یابد. در دورۀ سرد سال بر اثر استقرار فرود بلند مدیترانه، سامانه های غربی فشار هوا اعم از موج های سطح بالا و چرخندهای روی زمین به طرف ایران می آیند. از این رو رطوبت بارندگی ها در دورۀ سرد سال به وسیلۀ سامانه های مهاجر دریای مدیترانه تأمین می شود (علیجانی؛1391).

n  توده هوای نسبتا گرم و مرطوب ناشی از ورود زبانه های کم فشار سودانی: کم فشار سودانی که در شمال آفریقا تشکیل می شود و در فصل تابستان به صورت یک کم فشار حرارتی عمل می کند و در زمستان رفتار پویشی دارد .هر گاه کم فشار سودانی و مدیترانه ای با هم مرتبط شوند، ناوۀ عمیق در شرق مدیترانه به وجود  می آید و موجب ورود توده های نسبتاً گرم و مرطوب و بارش های سنگین در اغلب نقاط ایران می شود (جوانمرد و همکاران،1382).

1-1-1). اهمیت سرماهای بحرانی از نظر محققان

دما از مهمترین عناصر آب وهوایی است و تغییرات ناگهانی آن به ویژه افت دما به مقادیر زیر صفر درجه، منشأ بسیاری از تحولات فیزیکی، شیمیایی و زیست محیطی است. به همین دلیل، بررسی روند دما در مقیاس های مختلف زمانی و مکانی مورد توجه محققان بوده، بخش بزرگی از ادبیات آب وهوا شناسی را به خود اختصاص داده است. در این مجال به بیان اهمیت موضوع دماهای بحرانی سرد از سه جهت می پردازیم:

<به لحاظ مفهومی : هن و همکاران (2009)، در تحقیق خود یک موج سرد را با عنوان یک کاهش دمای سریع و غیرمتعارف برای یک دوره کوتاه مدت 24 ساعته روزانه تعریف کرده اند البته نه سرد مطلق بلکه سردی نسبی معادل انکه انسان کاهش درجه حرارت را احساس کند.

مشکلاتی که هر ساله دماهای بحرانی سرد در مناطق مختلف جغرافیایی و بخصوص منطقه ایران مرکزی به وجود می آورند باعث شده که موضوع مطالعه این دماها اهمیت علمی و کاربردی پیدا کرده، اثرات مختلف این دماها بررسی شود. این اثرات از جمله شامل ترکیدن لوله های آب، دیواره استخرها و حوض ها، بروز بیماری های واگیردار زمستانی مانند سرماخوردگی آنفلوانزایی، سارس و آلودگی هوا و مصرف زیاده از حد سوخت، مرگ و میر حیوانات وحشی و هجوم آنها به مراکز زیست انسانی، وقوع اینورژن های حرارتی و تشعشعی است (قویدل رحیمی و خوشحال دستجردی، 1389: 180).

<به لحاظ کمی : گاوس و همکاران (2014)، اندازه گیری هوای سرد بحرانی را از طریق شاخص های مختلف آب و هوایی از جمله آستانه های بحرانی (دمای زیر 15- درجه)، سرمازدگی (تعداد روزهایی که دمای حداقل زیر صفر باشد)، یخبندان (تعداد روزهایی که دمای حداکثر روزانه زیر صفر درجه باشد) و شاخص مدت زمان دوام سرما (مثلاً، شش روز متوالی دمای حداکثر روزانه پایین تر از صدک دهم باشد) می داند.

<به لحاظ پیامدها و زیان ها : بسیاری از بحران های ایجاد شده به طور کلی خطر نامیده می شوند و بیشتر از شرایط آب و هوای نشأت می گیرند (علیجانی،1390). مشکلاتی که هر ساله دماهای بحرانی سرد در مناطق مختلف جغرافیایی و بخصوص منطقه ایران مرکزی به وجود می آورند باعث شده که موضوع مطالعه این دماها اهمیت علمی و کاربردی پیدا کند. اثرات مختلف این دماها، در مواقع افت قابل بحث است مانند مسایلی که برای جوامع به وجود می آورد (مثل ترکیدن لوله های آب، دیواره استخرها و حوض ها، بروز بیماری های واگیردار زمستانی مانند سرماخوردگی آنفلوانزایی، سارس، آلودگی هوا با مصرف زیاده از حد سوخت، مرگ و میر حیوانات وحشی و هجوم آنها به مراکز زیست انسانی، وقوع اینورژن های حرارتی و تشعشعی مورد بررسی قرار داده شود (قویدل رحیمی و خوشحال دستجردی، 1389: 180).

       از نمونه این خسارات می توان به وقوع موج سرمای دی ماه 1386 اشاره کرد که همه ایران را در بر گرفت و به تبع آن استان های مورد پژوهش این تحقیق نیز طی چندین روز متوالی از 15 تا 20 دی 1386 شاهد دمای شدید سرد و یخبندان بودند. از خسارات این سرما می توان به تعطیلی تمام مقاطع تحصیلی و دانشگاه های استانهای تهران، سمنان و یزد به مدت دو روز، قطع و افت فشار گاز در اغلب شهرهای تهران، شاهرود، کاشان، یزد و کرمان، لغو اکثر پروازهای مسافرتی بعلت برودت و سردی هوا اشاره کرد (سایت خبر گذاری تابناک؛ در تاریخ 16/10/1386) همچنین کاهش دما به زیر صفر درجه در تمام ایستگاه ها، از جمله در استان سمنان کاهش دما تا منفی 13 درجه، شاهرود منفی 12 (سایت خبر گذاری فارس؛ 18/10/1386). اعلام وضعیت حاد برای هشت استان كشور، سرگردانی بیش از سه هزار تن در راه های یزد اشاره کرد . این امواج سرد که با کاهش شدید دما و ریزش برف سنگین (100سانتی متر در اطراف قمصر) همراه بود، باعث مسدود شدن اکثر راه های ارتباطی شهری و روستایی کاشان، تهران به قم و دیگر شهرها شد (سایت سازمان مدیریت بحران کشور؛ در تاریخ 17/10/1386).

       مرتبط با دماهای بحرانی سرد، رزنویک (1996) و ساکاموتو (1997) اشاره می کنند که قرار گرفتن در معرض دماهای بسیار پایین در فصل سرد سال برای سلامت کودکان، سالمندان، بی خانمان ها و افرادی که بیماریهای تنفسی، قلبی

فهرست مطالب

چکیده فارسی…………………………………………………………………………………………………

فصل اول:مقدمه(اهداف تحقیق)………………………………………………………………………..

1- 1 طبقه بندی بروسلا…………………………………………………………………………………..

1-2  بیماری زایی و فاکتورهای بیماری زایی……………………………………………………..

1-2-1 ژن کد کننده آنزیم گلوکان حلقوی سنتتاز (cgs)…………………………..

1-2-2 ژن های aroc و  purE …………………………………………………………..

1-2-3 پروتئینهای شوک حرارتی…………………………………………………………….

1-2-4 ژن sod…………………………………………………………………………………….

1-3 اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………

1-4 خصوصیات بیوشیمیایی……………………………………………………………………………

1-5 علایم بیماری………………………………………………………………………………………….

    1-5-1 ناخوشى تحت بالینى (ساب كلینیكال)………………………………………….

        1-5-2 بروسلوز حاد و تحت حاد……………………………………………………………

        1-5-3 بروسلوز موضعى ( لوكالیزه):……………………………………………………….

         1-5-4 عود بروسلوز:…………………………………………………………………………..

        1-5-5 بروسلوز مزمن……………………………………………………………………………

        1-5-6 بیمارى شبه بروسلوز………………………………………………………………….

        1-5-7 بروسلوز ناشى از تلقیح واكسن حیوانى………………………………………..

1-6 انتقال بیماری………………………………………………………………………………………….

1-7 پاسخ های ایمنی میزبان به بروسلا…………………………………………………………….

1-8 روش های تشخیص…………………………………………………………………………………..

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب  Omp31…………………………………………….

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

1-10-3 استفاده از بروسلا ملیتنسیس سویه WR201……………………………………..

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24  در هر دو سویه بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس  

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

1-10-7 استفاده از LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس……………………………………

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانی بروسلا ملیتنسیس…

1-10-10 مجوز استفاده از واکسن بروسلا   ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در گاوها…

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

        1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

        1-11-2 ساختمان LPS ………………………………………………………………………

        1-11-3  عملکرد LPS………………………………………………………………………..

        1-11-4 تاثیرات LPS………………………………………………………………………….

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

       1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

       1-12-2  PorA…………………………………………………………………………………..

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

فصل سوم: (مواد و روشها)

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

3-4 رنگ آمیزی گرم …………………………………………………………………………………….

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

3-6 روش استخراج DNA پلاسمیدی …………………………………………………………..

      3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

 

      3-6-2 مراحل استخراج DNA پلاسمیدی……………………………………………….

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

      3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

      3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

3-8  بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

3-9  نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

3-11 روش تهیه بافر جداکننده ……………………………………………………………….

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

       3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

       3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

        3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

        3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیب E.coli………………………………………………..

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

        3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

        3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

3-19 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

          3-19-1 پروتکل جدا سازی LPS……………………………………………………

          3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

3-20 سنجش غلضت  LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

         3-20-1 تهیه LPS منحنی استاندارد………………………………………………….

3-21 روش کونژوگاسیون LPS با  PorA…………………………………………………..

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

فصل چهارم:(نتایج )

4-1 احیا باکتری نوترکیب PorA……………………………………………………………….

4-2 استخراج DNA پلاسمیدی ……………………………………………………………….

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیب PorA………………………………………………..

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

4-6 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

4-7 سنجش غلظت LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………

4-8 کونژوگاسیون LPS باPorA………………………………………………………………

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

 فهرست جدول ها

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

 

فهرست شکل ها

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتری بروسلا آبورتوس در میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتری بروسلا آبورتوس با ماکروفاژ……………………………………

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

شکل 4-2 DNA  پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

شکل4-3SDS-PAGE,PorA ………………………………………………………………………………………..

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شده PorA………..

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

چکیده

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنس بروسلا به وجود می آید . بروسلاها ، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند . بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس عمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند. واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولی بروسلا محسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPS بروسلا به دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است  وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد.  علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخل E.coli کلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی   انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین  بدست آمد.در مرحله ی بعد LPS بروسلا ملیتنسیس جداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPS بروسلا ملیتنسیس  با porA نیسریا کونژوگه گردید.

بیشترین بیان پروتئین porA  در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS  مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ،  97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

فصل اول

مقدمه

 1-1-طبقه بندی بروسلا:

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست  (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جمله بارتونلا و ریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

جنس بروسلا بر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابه DNA به هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار در بروسلا آبورتوس ، 3 بیووار در بروسلا ملی تنسیس و 5 بیوار در بروسلا سویس را مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)  

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا