چکیده

دوره پس از زایمان به دلیل اثرات آن بر کارایی تولید­مثلی و آبستنی مجدد، مرحله­ ای مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب می­ شود. Escherichia coli، Trueperella pyogenes (Arcanobacterium pyogenes)، Fusobacterium necrophorum و Prevotella melaninogenicus به عنوان
مهم­ترین باکتری­ های بیماری­زای مرتبط با آسیب­های اندومتریوم رحم شناخته شده ­اند. هدف این مطالعه تشخیص این باکتری­ های بیماری­زا با بهره گرفتن از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) به عنوان یک روش حساس و بی­نیاز از کشت باکتری بود. تعداد 172 راس گاو 25 تا 35 روز پس از زایش و 128 راس دو هفته پس از آن (39 تا 49 روز پس از زایش) معاینه شدند. ترشحات رحمی با پیپت پلاستیکی پوشش­دار جمع آوری شدند. شیوع اندومتریت در اولین معاینه از دومین معاینه بالاتر بود (%5/35 در مقابل %16). E. coli در 8 نمونه،
T. pyogenes در 13 نمونه و F. necrophorum در 11 نمونه یافت شد. هیچ نمونه مثبتی از
P. melaninogenicus شناسایی نگردید. آلودگی رحمی با باکتری­ های T. pyogenes و
F. necrophorum در اولین معاینه بالاتر از دومین معاینه بود. باکتری T. pyogenes بر گرایش به ابتلای به اندومتریت بالینی اثر گذاشته بود. گاوهای شکم اول در مقایسه با گاوهای شکم دوم 02/4 برابر خطر بیشتر برای ابتلا به اندومتریت بالینی نشان دادند. یک پروتکل multiplex PCR به عنوان یک روش ساده­تر،
ارزان­تر و سریع­تر برای شناسایی سه باکتری E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum تنظیم و معرفی گردید.

کلید واژه: اندومتریت، عوامل باکتریایی، PCR

 

 

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

فصل اول: مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………… 2

 

فصل دوم: بر تحقیقات گذشته

2-1- فیزیولوژی پس از زایش………………………………………………………………………………………………. 8

2-1-1- مکانیسم بازسازی رحمی………………………………………………………………………………….. 8

2-1-2- آلودگی و پاک شدن باکتری­ ها از رحم پس از زایش…………………………………….. 9

2-1-3- عفونت باکتری­ های بیماری­زا در رحم……………………………………………………………… 9

2-1-4- فعالیت تخمدانی پس از زایش در گاوهای شیری………………………………………… 10

2-2- تعریف بیماری­های رحمی…………………………………………………………………………………………. 11

2-2-1- متریت……………………………………………………………………………………………………………….. 11

2-2-2- پیومتر……………………………………………………………………………………………………………….. 11

2-2-3- اندومتریت…………………………………………………………………………………………………………. 12

2-2-3-1- اندومتریت بالینی…………………………………………………………………………………… 12

2-2-3-2- اندومتریت تحت بالینی…………………………………………………………………………. 12

2-3- شیوع عفونت رحمی………………………………………………………………………………………………….. 13

2-4- روش­های تشخیص اندومتریت بالینی و تحت بالینی………………………………………………. 14

2-4-1- ملامسه رحم…………………………………………………………………………………………………….. 14

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

2-4-2- ارزیابی ترشحات مهبل و گردن رحم……………………………………………………………… 14

2-4-3- اولتراسونوگرافی……………………………………………………………………………………………….. 15

2-4-4- سلول شناسی اندومتریوم………………………………………………………………………………… 16

2-4-5- بیوپسی رحمی و باکتری شناسی…………………………………………………………………… 17

2-5- درمان اندومتریت در گاوهای شیری…………………………………………………………………………. 18

2-5-1- استفاده از پروستاگلاندین­ها……………………………………………………………………………. 18

2-5-2- درمان آنتی بیوتیکی داخل رحمی…………………………………………………………………. 19

2-6- واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)…………………………………………………………………………….. 21

 

فصل سوم:  روش کار

3-1- انتخاب حیوانات………………………………………………………………………………………………………….. 24

3-2- معاینات بالینی……………………………………………………………………………………………………………. 25

3-3- تهیه نمونه­های سلول شناسی…………………………………………………………………………………… 26

3-4- جمع­آوری نمونه­های ترشحات رحمی……………………………………………………………………… 26

3-5- استخراج DNA از مایعات رحمی…………………………………………………………………………….. 27

3-6- تشخیص حضور E. coli، T. pyogenes،  F. necrophorum

و P. melaninogenicus با PCR………………………………………………………………………………………….. 27

3-7- واکنش زنجیره­ای پلیمراز چندتایی (multiplex PCR) برای

باکتری­ های E. coli، T. pyogenes و  F. necrophorum………………………………………………… 29

3-8- بررسی شاخص ­های تولیدمثلی………………………………………………………………………………….. 30

3-9- آزمون­ها و تحلیل­های آماری……………………………………………………………………………………… 30

 

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

فصل چهارم:  نتایج

4-1- معاینه اول…………………………………………………………………………………………………………………… 33

4-1-1- ابتلای به اندومتریت بالینی …………………………………………………………………………… 33

4-1-2- باکتری شناسی………………………………………………………………………………………………… 34

4-1-3- شاخص ­ها و عوامل تولیدمثلی…………………………………………………………………………. 35

4-2- معاینه دوم…………………………………………………………………………………………………………………… 36

4-2-1- ابتلای به اندومتریت بالینی…………………………………………………………………………….. 36

4-2-2- باکتری شناسی………………………………………………………………………………………………… 37

4-2-3- شاخص ­ها و عوامل تولید مثلی……………………………………………………………………….. 38

4-3- مقایسه نخستین و دومین معاینه……………………………………………………………………………… 39

 

فصل پنجم: بحث

5-1- واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)…………………………………………………………………………….. 49

5-2- باکتری شناسی…………………………………………………………………………………………………………… 51

5-3- اندومتریت بالینی و دیگر شاخص ­های تولید مثلی…………………………………………………… 54

 

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………………………. 59

فهرست جداول

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

جدول 1. پرایمرهای استفاده شده در شناسایی ژن­های هدف……………………………………………….. 28

جدول 2. تعداد موارد سالم و مبتلا به اندومتریت بالینی در معاینه اول و دوم…………………….. 42

جدول 3. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحم

در ابتلا به اندومتریت بالینی در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)…………………………………….. 42

جدول 4. موارد مثبت PCR در گاوهای سالم و مبتلا به اندومتریت بالینی

در معاینه اول و دوم……………………………………………………………………………………………………………………. 42

جدول 5. ضریب همبستگی آلودگی باکتریایی با یکدیگر در معاینه اول……………………………….. 43

جدول 6. ضریب همبستگی آلودگی باکتریایی با یکدیگر در معاینه دوم………………………………. 43

جدول 7. ضریب همبستگی آلودگی به باکتری­ ها و ساختار تخمدان

در معاینه اول با شاخص ­های تولیدمثلی …………………………………………………………………………………… 43

جدول 8. ضریب همبستگی آلودگی به باکتری­ ها و ساختار تخمدان

در معاینه دوم با شاخص ­های تولیدمثلی ………………………………………………………………………………….. 43

جدول 9. مقایسه روزهای باز در آلودگی باکتریایی نمونه­های رحمی

در معاینه اول و دوم (Mean±SE)…………………………………………………………………………………………….. 44

جدول 10. مقایسه درصد نوتروفیل ترشحات گردن رحم در آلودگی باکتریایی

نمونه­های رحمی در معاینه اول و دوم (Mean±SE)………………………………………………………………. 44

جدول 11. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحم

در قطرهای متفاوت گردن رحم (سانتی­متر) در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)…………… 44

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

جدول 12. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحم

در دو شاخ رحم متقارن و نامتقارن در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)………………………….. 45

جدول 13. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحم

در رحم­های واجد و فاقد لومن در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)………………………………. 45

جدول 14. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز، درصد نوتروفیل و تعداد تلقیح

در ساختارهای غالب متفاوت تخمدانی در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)……………………. 46

جدول 15. ضریب همبستگی شاخص ­های تولیدمثلی با یکدیگر……………………………………………. 46

جدول 16. عوامل خطر همراه با احتمال وقوع اندومتریت بالینی تشخیص داده شده

در معاینه اول و دوم……………………………………………………………………………………………………………………. 47

فهرست تصاویر

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

تصویر 1. محصولات PCR استاندارد DNA ژنومی ترشحات رحمی……………………………………… 40

تصویر 2. محصولات واکنش زنجیره­ای استاندارد و چندتایی DNA ژنومی

ترشحات رحمی برای باکتری­ های E. coli، T. pyogenes، F. necrophorum

و P. melaninogenicus……………………………………………………………………………………………………………… 41

مقدمه

 

 

دوره پس از زایمان به دلیل اثراتی که بر کارایی تولید­مثلی و آبستنی مجدد دارد، به عنوان یک مرحله مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب می­ شود. آلودگی رحم به باکتری­ ها، به طور معمول در طی دو هفته ابتدایی پس از زایش رخ می­دهد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). 80 تا 100 درصد گاوها آلودگی باکتریایی رحم را در دو هفته اول پس از زایش دارند (Földi et al. 2006). در این مدت دامنه وسیعی از فلور میکروبی در رحم تکثیر می­ کنند. هر چند رحم بیشتر گاوها در فرایندهای بازسازی رحم و بازگشت آن به اندازه طبیعی، در طی پنج هفته اول پس از زایش، از این آلودگی­های باکتریایی پاک می­شوند اما در تعدادی از گاوها این آلودگی­ها توسعه پیدا کرده و عفونت­های رحمی قابل تشخیص با معاینه بالینی را ایجاد می­ کنند (Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a).

اندومتریت پس از زایش به صورت التهاب محدود به اندومتریوم (لایه داخلی رحم) که 21 روز یا بیشتر پس از زایش و بدون نشانه­ های بیماری عمومی رخ می­دهد، تعریف شده است (Sheldon et al. 2006a). تشخیص اندومتریت بالینی با قطر گردن رحم بیش از 5/7 سانتی­متر در ملامسه راست روده­ای بعد از روز 20 پس از زایش یا از حضور ترشحات مهبلی موکوسی-چرکی یا چرکی بعد از روز 26 پس از زایش تعریف شده است (LeBlanc et al. 2002a).

میزان شیوع اندومتریت در کشورهای مختلف بسیار متفاوت بوده است. این میزان از 5/4-6/2 در اسپانیا (Lopez-Gatius 2003)، 10 درصد در بریتانیا (Noakes et al. 2009)، 25 درصد در ژاپن (Gautam et al. 2009)، تا 53 درصد در ایالات متحده (Gilbert et al. 2005) متغیر بوده است که این تفاوت می ­تواند به دلیل عدم توصیف روش­های تشخیصی، معیارهای متفاوت درجه بندی عفونت­های رحمی، دوره پس از زایشی که هنگام تشخیص عفونت گاو در آن قرار داشته، تعداد زایش گاو و مدیریت متفاوت گله­ها باشد (Lewis 1997; Noakes et al. 2009). در مطالعات قبلی در گاوداری­های ایران میزان وقوع اندومتریت بالینی درجه 1 تا 3 بیش از 50 درصد بود (احمدی و همكاران، اطلاعات منتشر نشده).

اندومتریت تاثیرات نامناسب بر تولید­مثل و باروری گاو گذاشته و خسارات اقتصادی فراوانی را وارد می­آورد. حضور باکتری در رحم، التهاب و آسیب­های بافتی اندومتریوم را در پی دارد و سبب تأخیر در بازسازی رحم و همچنین به خطر افتادن حیات رویان می­ شود (Azawi 2008; Sheldon et al. 2006a). همچنین عفونت باکتریایی رحم و یا مواد تولید شده از این باکتری­ ها سبب سرکوب ترشح LH هیپوفیز و نقص در عملکرد و رشد فولیکول­های تخمدانی پس از زایمان و در نتیجه اختلال در تخمک­گذاری می­ شود (Opsomer et al. 2000; Sheldon et al. 2002b). بنابراین اندومتریت سبب کاهش احتمال باروری شده و افزایش فاصله زایش تا اولین تلقیح و افزایش نسبت تلقیح به ازای آبستنی (از 2 به 42/2) و افزایش فاصله زایش­ها (10 تا 31 روز) را در پی دارد (Azawi 2008; LeBlanc et al. 2002a; Noakes et al. 2009). گاوهای مبتلا به ترشحات مهبلی چرکی برای آبستن شدن به میانگین 30 روز زمان بیشتر نسبت به گاوهای غیر مبتلا نیاز دارند که حداقل ضرر اقتصادی طولانی شدن روزهای باز را دارد که حدود 3 دلار در روز می­باشد (Dubuc 2011). پس اندومتریت می ­تواند سبب کاهش میزان باروری و افزایش نرخ حذف به دلایل ناباروری شود. نتیجه اینکه اندومتریت می ­تواند اثر فراوانی در کاهش سودآوری گله­های گاو شیری داشته باشد. این خسارات به دلیل افزایش فاصله زایمان تا آبستنی مجدد، افزایش میزان حذف، کاهش تولید شیر و تحمیل هزینه­ های درمان می­باشد (Drillich 2006; LeBlanc et al. 2002a) به گونه­ ای که خسارات آن را برای هر گاو مبتلا 166 پوند (Noakes et al. 2009) محاسبه کرده ­اند.

عوامل بیماری­زای اندومتریت بسیار پیچیده هستند. بسیاری از مطالعات پیشنهاد کرده ­اند که باکتری­ های بیماری­زا نقش مهمی در بروز و وخیم شدن اندومتریت دارند (Sun et al. 2011).  معمول­ترین شروع کننده­ های عفونت اندومتریت باکتری­ های بیماری­زای فرصت طلب غیر اختصاصی هستند که در اطراف زمان زایمان و پس از آن رحم را آلوده می­ کنند (Sheldon et al. 2006a). به نظر می­رسد عفونت رحم به Escherichia coli در اوایل دوره پس از زایش، راه را برای عفونی شدن توسط سایر باکتری­ ها هموار می­ کند (Westermann et al. 2010; Williams et al. 2005). متعاقب آن رشد زیاد باکتری­ های بیماری­زایی چون pyogenes  Trueperella (Arcanobacterium pyogenes) (که معمولا باکتری­ هایی چونFusobacterium necrophorum  و Prevotella melaninogenicus همراه با آن هستند) به لایه ­های اندومتریوم نفوذ می­ کنند (Drillich 2006; Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a). میزان عفونت ایجاد شده و نتیجه آلودگی را گونه باکتری بیماری­زا، میزان باکتری وارد شده و توانایی گاو برای بروز پاسخ ایمنی مناسب تعیین می­ کنند که می ­تواند از عفونت رحمی شدید همراه با به خطر افتادن زندگی تا عفونت خفیف لایه داخلی رحم متغیر باشد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). گرچه در پایدار شدن و باقی ماندن عفونت در رحم عواملی چون مساعد بودن محیط رحم، فاکتورهای ژنتیکی و ایمنی ذاتی و اکتسابی حیوان دخالت دارند اما شدت اندومتریت و آسیب­های وارده به رحم ارتباط مستقیمی با جنس و گونه باکتری­ های آن دارد. Trueperella pyogenes معمول­ترین باکتری مرتبط با بیماری­های رحمی و اندومتریت است (Bicalho et al. 2010; Sheldon et al. 2004; Yavari et al. 2007). در کنار آن باکتری­ هایی چون Fusobacterium necrophorum و  melaninogenicus Prevotella و Escherichia coli  از دیگر باکتری­ های بسیار مطرح در آسیب­های رحمی و در رده اول بیماری­زایی برای رحم هستند (Sheldon and Dobson 2004; Williams et al. 2005). در ضمن این باکتری­ ها به رشد همدیگر کمک کرده و اثرات هم را تشدید می­ کنند (Sheldon and Dobson 2004; Westermann et al. 2010). به گونه­ ای که T. pyogenes کمک به ایجاد محیط بی­هوازی برای رشدF. necrophorum  وmelaninogenicus  P. می­ کند. F. necrophorum اندوتوکسین کشنده سلول­های دفاعی را تولید می­ کند که توانایی سیستم دفاعی میزبان برای پاکسازی رحم از T. pyogenes را محدود می­ کند. در همین حال  melaninogenicus  P. مواد تداخل کننده در فاگوسیتوز را تولید می­ کند (Sheldon and Dobson 2004). در نتیجه این سه باکتری معمولا در کنار هم و در ارتباط با هم جداسازی شده ­اند.

با توجه به اینکه اندومتریت اثری بر سلامت ظاهری گاو مبتلا ندارد از روش­های گوناگونی برای تشخیص آن در گاو استفاده کرده ­اند (Youngquist and Threlfall 2007) که شامل: ملامسه رحم از راه راست­روده (Drillich 2006; Lewis 1997)، بررسی حضور ترشحات چرکی در واژن و دهانه خارجی گردن رحم (LeBlanc et al. 2002a; Williams et al. 2005)، اولتراسونوگرافی (Barlund et al. 2008; Oral et al. 2009)، بیوپسی رحم و مطالعات آسیب­شناسی (Bonnett et al. 1991)، مطالعات سلول شناسی (Ahmadi et al. 2005; Oral et al. 2009; Yavari et al. 2009) و مطالعات میکروب­شناسی (Földi et al. 2006; Yavari et al. 2007) می­باشد اما این روش­ها بیشتر برای تایید اندومتریت استفاده می­شوند و کمتر برای تشخیص عامل بیماری­زا قابل استفاده هستند یا اینکه وقت­گیر، با حساسیت پایین و پیچیده هستند.

باید توجه داشت که تشخیص قطعی اندومتریت بر اساس معاینه بافت­شناسی و آسیب­شناسی از نمونه­های بیوپسی اندومتر و یا با بررسی باکتری­شناسی نمونه­های جمع­آوری شده از مجرای رحم قابل اطمینان است. با توجه به اینکه بیوپسی بر بافت رحم و گردن رحم اثرات نامطلوب گذاشته و ناباروری ایجاد می­ کند، استفاده از آن روشی قابل توصیه و مناسب نمی ­باشد (Youngquist and Threlfall 2007). اما در کشت باکتری­ ها نیز محدودیت­هایی وجود دارد که استفاده از آنها را دچار ابهام می­ کند. به عنوان مثال، برای کشت برخی باکتری­ ها مثلF. necrophorum  باید شرایط خاص (اجبار در استفاده از محیط کشت اختصاصی، ایجاد شرایط خاص بی­هوازی و همچنین مدت زمان طولانی مورد احتیاج برای کشت) فراهم شود که این روش را تبدیل به فرایندی زمان­بر، هزینه­بر و با زحمت زیاد کرده است. نکته مهم دیگر اینکه در مطالعات باكتری شناسی جدا شدن باكتری به عنوان دلیلی قاطع مبنی بر وجود عفونت در رحم تلقی می‌شود، چنانچه از آن به عنوان یک شاخص برای تعیین موارد مثبت کاذب روش واژینوسکوپی استفاده شده است (Westermann et al. 2010) ولی در صورتی كه چرك مشاهده و باكتری جدا نشود نمی‌توان نتیجه گرفت که وجود چرك، ناشی از التهاب غیر عفونی است به خصوص در مورد باکتری­ های سخت رشد و بی­هوازی چونF. necrophorum  وmelaninogenicus  .P. در بسیاری مطالعات تعداد زیادی نمونه رحمی بدون رشد هیچ گونه باکتری گزارش شده است (Ahmadi et al. 2007; Westermann et al. 2010). از جمله در مطالعه یاوری و همکاران از كشت رحم 89 راس گاو مبتلا به اندومتریت بالینی تهیه شده از گاوداری­های 5 استان، فقط از 35 مورد (3/39 درصد) باكتری جدا شد و