فهرست مطالب

فصل اول

1- مقدمه. 1

1-2 پنیر. 3

1-3 نقش میکروارگانیسم ها در مراحل رسیدن پنیر. 11

1-4 پروتئولیز. 12

1-5 گلیكولیز. 13

1-6 لیپولیز بر روی پنیر. 15

1-7  فلور میكروبی روده 19

1-8 پروبیوتیك‌ها 20

1-8-1 مکانیسم اثر پروبیوتیک ها 24

1-8-2 اثرات مفید پروبیوتیك‌ها بر سلامت انسان. 24

1-9 پری بیوتیك‌ها 29

1-10  لاکتوباسیلوس… 32

1-11 بیفیدوباکتریوم. 33

1-12 اسید لاکتیک… 35

1-12-1 عملکرد اسید لاکتیک… 36

1-12-1 ساختار ژنتیکی باکتریسین ها 43

1-13 اسید استیک… 44

فصل دوم

2- پیشینه پژوهش… 46

فصل سوم

3- مواد و روش ها 50

3-1 تهیه نمونه های پنیر. 52

3-2 بررسی باکتری شناسی نمونه های پنیر. 53

3-3 بررسی خواص ضد میکروبی جدایه ها 53

3-4 تست تعیین حساسیت میکروبی جدایه ها 54

3-5 تست تعیین حساسیت در برابر اسید و صفرا 55

 

3-6 تجزیه و تحلیل آماری داده ها 56

فصل چهارم

4- نتایج.. 57

4-1 نتایج آزمون تعیین حساسیت میکروبی جدایه ها 63

4-2 نتایج آزمون تحمل صفرا 65

4-3 نتایج مربوط به تحمل اسید. 67

فصل پنجم

5- بحث… 70

5-1 نتیجه گیری.. 78

5-2 پیشنهادات… 79

منابع. 80

فهرست جداول

جدول 1-1: نمونه‌ای از سوشهای پروبیوتیک… 31

جدول 1-2: باکتریوسین های تولید شده توسط  برخی گونه های لاکتوباسیلوس ها 42

جدول 4-1. بررسی میکروبیولوژیک 100 گرم از نمونه پنیرهای مختلف پس از کشت بر روی محیط MRS آگار. 58

جداسازی شده از 15 نمونه پنیر لورک. 58

جداسازی شده از 15 نمونه پنیر کوزه. 59

جداسازی شده از نمونه های پنیر لورک، کوزه و چدار. 59

جدول 4-5: نتایج بدست آمده از خاصیت ضد میکروبی باکتری های جده شده از نمونه پنیرهای مختلف. 61

جدول 4-6. نتایج آزمون تعیین حساسیت ضد میکروبی باکتری های جدا شده از پنیر لورک. 63

جدول 4-7. نتایج آزمون تعیین حساسیت ضد میکروبی باکتری های جدا شده از پنیر کوزه. 64

های جدا شده از پنیر لورک در برابر محلول 3/0 درصد اکسگال. 65

های جدا شده از پنیر کوزه در برابر محلول 3/0 درصد اکسگال. 66

جدول 4-10 نتایج حاصل از آزمون تعیین حساسیت در برابر اسید باکتری های جدا شده از نمونه های پنیر لورک. 67

جدول 4-11 نتایج حاصل از آزمون تعیین حساسیت در برابر اسید باکتری های جدا شده از نمونه های پنیر کوزه. 67

فهرست اشکال

شکل 1-1: فرایند تشکیل اسید لاکتیک… 38

تصویر 4-1. منطقه مهار رشد لاکتوباسیلوس روتری جدا شده از پنیر لورک (الف)، منطقه مهار رشد لاکتوباسیلوس کازئی جدا شده از پنیر کوزه (ب) علیه لیستریا منوسیتوژنز. 63

چکیده

پروبیوتیک­ها مکمل غذایی از میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که وقتی در مقادیر مناسب در دستگاه گوارشی وجود داشته باشند، تأثیرات سودمندی بر میزبان برجای می‌گذارند.  از میان باکتری‌ها، باکتری‌های اسیدلاکتیک، متداول‌ترین نوع باکتری‌هایی هستند که به‌عنوان پروبیوتیک معرفی شده‌اند. هدف از این پروژه، جداسازی و شناسایی باکتری‌های با پتانسیل پروبیوتیکی از انواع مختلف پنیر سنتی شامل لورک، کوزه و چدار و ارزیابی خواص مهاری آن‌ ها بر رشد اشریشیا کلی و لیستریا منوسیتوژنز بود. برای رسیدن به این هدف، باکتری‌های اسیدلاکتیک توسط روش‌های فنوتیپی (رنگ‌آمیزی گرم، تست‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژی) جداسازی شدند و شاخص‌های اولیه پروبیوتیکی آن‌ ها (مقاومت به اسید، نمک‌های صفراوی) مورد ارزیابی قرار گرفت. در پایان تحقیق، 5 سویه لاکتوباسیلوس و یک سویه بیفیدوباکتریوم به‌عنوان فلور میکروبی طبیعی از نمونه‌های لورک، 4 سویه لاکتوباسیلوس از نمونه‌های پنیر کوزه و یک سویه لاکتوباسیلوس از پنیر چدار مورد شناسایی قرار گرفتند. نتایج حاصل از بررسی‌های گزینشی شامل تست آنتی بیوگرام، مقاومت در برابر صفرا  و اسید و آزمون مهاری نشان داد که لاکتوباسیلوس روتری و لاکتوباسیلوس کازئی پتانسیل کاربرد به‌ عنوان پروبیوتیک را در محصولات لبنی دارند.

لغات کلیدی: لاکتوباسیل، اشریشیا کلی، لیستریا منوسیتوژنز، پنیر سنتی، لورک، کوزه، چدار

                                                   فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                   صفحه

فصل اول: (مقدمه و اهداف تحقیق)

چکیده فارسی                                                                                                 1

1-1-مقدمه……………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2-اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………. 3

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)

2-1-گیاه­شناسی گندم و اهمیت آن…………………………………………………………………………….. 4

2-1-1- بیماری زنگ  …………………………………………………………………………………………… 5

2-1-2- بیماری سیاهک…………………………………………………………………………………………..   6

2-1-3- بیماری پاخوره یا پوسیدگی­ریشه یا از­پای­افتادن………………………………………………….. 7

2-1-4- بیماری سوختگی­زرد یا لک­خرمایی…………………………………………………………………. 8

2-1-5- بیماری لکه­چشمی………………………………………………………………………………………. 9

2-1-6- بیماری ارگوت                                                                                     9

2-1-7- بیماری­های فوزاریومی…………………………………………………………………………………. 10

2-1-7-1- قارچFusarium graminarum…………………………………………………………………………………………..   12

2-1-7-2- قارچ Fusarium culmurum ……………………………………………………………………………………………. 13

2-1-7-3- قارچ Fusarium avenaceum……………………………………………………………………………………………   13

2-1-7-4- قارچFusarium equiseta      ……………………………………………………………………………………………. 14

2-1-7-5- قارچFusarium nivale                                                                                          15

2-2- میکروارگانیسم­های ریزوسفر                                                                         15

2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون   ………………………………………………………………………………… 18

2-4- باکتری­ های اندوفتیک و کاربرد آن­ها…………………………………………………………………….   21

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی…………………………………………………………………….   21

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن………………………………………………………………………………   25

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن…………………………………………………………………………………………..   28

2-4-4- انحلال فسفات……………………………………………………………………………………………   39

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

2-5- باکتری­ های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

فصل سوم (مواد و روش­ها)

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

3-1-2-1- نمونه و نمونه گیری …………………………………………………………………………………….. 59

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

3-2-8- تستMR/VP…………………………………………………………………………………………………. 63

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

3-3- شناسایی باکتری­ های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA………………………………………………… 64

3-3-2- روش استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………………………… 65

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

فصل چهارم (نتایج و بحث)

 

 

4-1- جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک                                                               68

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­ های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
 گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- بررسی فعالیت آنزیم β-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

4-4-3- ترکیبات محیط CMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ ها……………………………………………………………… 77

4-5-1- آنالیز کیفی محصولات PCR…………………………………………………………………………… 78

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

فهرست جداول

عنوان جدول                                                                                                          صفحه

جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ…………………………………………………………………………………………5

جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک……………………………………………………………………………………..6

جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی……………………………………………………………………………………….12

جدول2-4. انواع ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………………18

جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن………………………………………………………………………………..28

جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی………………………………………………………………………………….32

جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت………………………………………………………………………..33

جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین………………………………………………………………………….34

جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده…………………………………………………………………..35

جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن……………………………………………………………….39

جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور…………………………………………………………………………….43

جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها……………………………………………………………..50

جدول3-1. شرایطPCR……………………………………………………………………………………………………………….66

جدول3-2. چرخهPCR………………………………………………………………………………………………………………..66

جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA………………………………………………………………………66

جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………68

جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون………………………………………………………………………………………..71

جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium moniliforme………………………………………………………..72

جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium graminearum……………………………………………………..72

جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum…………………………………………………………..72

جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium culmorum…………………………………………………………..72

جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma virida………………………………………………………………73

جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma harizanum……………………………………………………….73

جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum………………………………………………………73

جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Macrophomina phaseolina………………………………………………73

جدول4-11. ترکیبات محیط CMCآگار1%……………………………………………………………………………………..76

جدول4-12. نتایج Blast……………………………………………………………………………………………………………..79

 

فهرست شکل­ها

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل2-1. انواع زنگ­ها…………………………………………………………………………………………………………………6

شکل2-2. انواع سیاهک­ها……………………………………………………………………………………………………………..7

شکل2-3. بیماری پاخوره………………………………………………………………………………………………………………8

شکل2-4. بیماری سوختگی­زرد­برگ……………………………………………………………………………………………….8

شکل2-5. بیماری لکه­چشمی…………………………………………………………………………………………………………9

شکل2-6. بیماری ارگوت……………………………………………………………………………………………………………10

شکل2-7. بیماری جرب و پوسیدگی فوزاریومی…………………………………………………………………………….11

شکل2-8. ماکروکنیدی فوزاریوم­گرامیناروم…………………………………………………………………………………….13

شکل2-9. ماکروکنیدی فوزاریوم­کلموروم………………………………………………………………………………………13

شکل2-10. ماکروکنیدی فوزاریوم­اوناسئوم…………………………………………………………………………………….14

شکل2-11. ماکروکنیدی فوزاریوم­اکوئیست……………………………………………………………………………………14

شکل2-12. عملکرد PGPR………………………………………………………………………………………………………..17

شکل2-13. عملکردPGPB………………………………………………………………………………………………………….24

شکل2-14. متانوتروف­های اندوفتیک……………………………………………………………………………………………38

شکل2-15. متابولیت­های ثانویه اکتینوباکتر­ها…………………………………………………………………………………44

شکل2-16. کلونیزاسیون اندوفیت­ها……………………………………………………………………………………………..54

شکل3-1. کیت استخراج DNA شرکت سیناژن………………………………………………………………………………64

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل4-1. رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………………………..67

شکل4-2. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 2g51 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-3. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 1g61 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-4. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G13 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….75

شکل4-5. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G14 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….76

شکل4-6. محصول PCR…………………………………………………………………………………………………………….78

شکل4-7. هم­تراز­سازی توالی نمونه 2g51………………………………………………………………………………….. 80

شکل4-8. سکانس­ژنی16srRNA نمونه 2g51……………………………………………………………………………….81

شکل4-9. هم­تراز­سازی توالی نمونه 1g61……………………………………………………………………………………83

شکل4-10. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه 1g61……………………………………………………………………………84

شکل4-11. هم­تراز­سازی توالی نمونه G13…………………………………………………………………………………..86

شکل4-12. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G13……………………………………………………………………………..87

شکل4-13. هم­تراز­سازی توالی نمونه G14.…………………………………………………………………………………..89

شکل4-14. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G14……………………………………………………………………………..90

 

چکیده:

باکتری­ های اندوفتیک به باکتری­ های اطلاق می­ شود که در درون بافت گیاهی بدون ایجاد آسیب ظاهر­ی زندگی می­ کنند. امروزه بسیاری از محققین گیاهان را برای جداسازی و شناسایی اندوفیت­ها مورد ارزیابی قرار می­ دهند زیرا برخی از آن­ها قادر به تولید ترکیبات ضد­قارچی و ضد­باکتریایی می­باشند و برخی به عنوان بارور­کننده به رشد گیاهان کمک می­ کنند و ممکن است منفعت­هایی نیز برای گیاه به همراه داشته باشند که از آن جمله می­توان به داشتن اثر ضد­باکتری و ضد­قارچی آن ها اشاره کرد و اخیرا توجه بسیاری را به خود معطوف کردند زیرا استفاده و به کارگیری اندوفتیک­ها به جای استفاده از بارورکننده­ها و مواد میکروب­کش شیمیایی کمک به سزایی را به حفظ سلامت و محیط­زیست می­نماید بر همین اساس در تحقیق حاظر ابتدا جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از ریشه و ساقه گیاه گندم بر روی محیط کشت NA صورت گردید و سپس نمونه­ها از نظر توانایی تولید اثر آنتاگونیسمی علیه 5 پاتوژن قارچی :

Fusarium moniliforme، Fusarium graminearum، Fusarium oxysporum، Macrophomina phaseolina، Fusarium culmorom (LM 2091) و 3 قارچ بیوکنترلی: Tricoderma virida (222-35) Tricoderma harizanum (115)، Tricoderma asperellum (Fyt222.2) در شرایط آزمایشگاهی با روش کشت­متقابل مورد مطالعه قرار گرفتند. در مجموع 69 باکتری از ریشه و ساقه گیاه گندم جداسازی گردید که از بین تمامی باکتری­ های جداشده تنها 5 باکتری اثر آنتاگونیسمی نشان دادند بعضی از سویه­ها پس از تعیین توالی16srRNA تحت عنوان باسیلوس­سوبتلیسM.CH.V، باسیلوس­سوبتلیس IRI، باسیلوس­سوبتلیس Khazar و لیزنی­باسیلوس­ماکروئیدس Tethys شناسایی شدند. بنابراین مطالعه حاظر نشان داد که گیاه گندم حاوی باکتری­ های اندوفیتیکی می­باشد که اثر ممانعتی علیه پاتوژن­های گیاه داشته است.

کلمات کلیدی : اندوفتیک، گندم، آنتاگونیست، بیوکنترل، 16srRNA

 فصل اول

 

مقدمه واهداف تحقیق

1-1. مقدمه

تازه ترین تعریف اندوفیت­ها « باکتری یا قارچی» است که برای تمام یا بخشی از زندگی خود به بافت­های گیاهان زنده حمله می­ کنند. درمعنای تجربی، اندوفتیک­ها باکتری­ های جدا شده از درون گیاه هستند که هیچ مشخصه یا نشانه­ای از بیماری ایجاد نمی­ کنند .(Wilson; 1995)باکتری­ های اندوفیتیک در یک جایگاه اکولوژیکی شبیه به پاتوژن­ها کلونیزه می­شوند اما با میکروارگانیسم­های پاتوژن گیاه تفاوت دارند، چون در گیاه بیماری ایجاد نمی­ کنند و با میکروارگانیسم­های

فهرست مطالب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: کلیات
چکیده فارسی	1
مقدمه	2
1-1 آنزیم ال-آسپاراژیناز	4
1-2   میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌	6
1-3   مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز	10
1-4  کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز	11
1-5  روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز	12
1-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز	12
1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز	12
1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز	14
1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز	15
1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز	17
1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی	18
1-7-1-آنزیم‌های بومی	18
1-7-1-1  ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی	18
1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا	19
1-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG)  -آسپاراژیناز)	20
1-8  کاربرد ال – آسپاراژینازها	22
1-8- 1  مکانیسم عمل به‌عنوان یک کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی	23
1-8-2  مکانیسم عمل به‌عنوان یک دارو	25
1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو	26
1-10 نیمه‌عمر دارو	26
1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز	27
1-11-1 عوارض ایمونولوژیک	27
1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز	27
1-11-3 سمیت دارو	28
1-12 فارموکینیتیک	29
فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام‌شده
2_1 تحقیقات انجام‌شده در ایران و خارج از ایران	32
2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز	32
2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی	34
2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با بهره گرفتن از محیط کشت اختصاصی M9	37
2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با بهره گرفتن از روش نسلریزاسیون	38
2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات	39
2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش  SDS-PAGE	39
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1 غربالگری سویه‌های مولد آنزیم از خاک	42
3-2   جداسازی و کشت باکتری	42
3-2-1   مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک	42
3-2-2   کشت	43
3-3   فعالیت آنزیم	45
3-4 روش‌های اندازه‌گیری آمونیاك	45
3-5    مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم	45
3-6    معرف آزمایش	46
3-7 خواندن جذب لوله‌های Test و Blank	46
3-8 مراحل کلونینگ	47
3-9  شرح مراحل کلونینگ	48
فصل چهارم: نتایج
4-1   نتایج مربوط به جداسازی	60
4-1-1   نتایج کشت	60
4-1-2   نتایج رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های بیوشیمیایی	61
4-1-3   نتایج بررسی فعالیت آنزیمی	63
4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته	66
4-1-5  نتایج مربوط به مستعد سازی	66
4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس	66
4-1-7 نتایج تست Quick- check	67
4-1-8 نتایج استخراج پلازمید	68
4-1-9 نتایج PCR تاییدی	69
4-1-10  نتایج تعیین توالی نمونه   : Bacillus cereus strain	69
4-1-11  نتایج تعیین توالی نمونه  : Bacillus thuringiensis strain	74
4-1-12  نتایج تعیین توالی نمونه  : Oerskovia turbata	79
فصل 5  نتایج
5-1 نتیجه	83
5-2 جمع بندی	83
5-3 محدودیت ها	83
5-4 پیشنهادها	84
منابع	85

 

فهرست جداول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز	7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن	8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز	19
جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده	20
جدول1-5 مقایسه‌ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی و PEG	29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی	31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت	42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکس PCR با در نظر گرفتن + n	51
جدول 3-3   شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها	51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ 0/2 cc	54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله ی Quick-check	57
جدول4-1  قطر هاله تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط  برحسب میلی‌متر	61
جدول4-2 رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های آنزیم مثبت	62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن‌های بیوشیمیایی نمونه‌های آنزیم مثبت	63
جدول4-4 جذب  نمونه های مولد آنزیم در طول‌موج 600 نانومتر	64
جدول4-5  جذب نمونه‌های مولد آنزیم در طول‌موج 480 نانومتر	72
جدول4-6  نتایج در سطح جنس و گونه	80

 

فهرست نمودار ها

 

 

 

نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز	11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر	64
نمودار 4- 2  میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر	65

 

فهرست شکل‌ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1  ساختار ال- آسپاراژیناز	3
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )	6
شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی	11
شکل 1-4  هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز	13
شکل1-5 توپولوژی از ال-آسپاراژیناز	14
شکل1-6  تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم	14
شکل1-7  این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C	15
شکل1-8 باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند)	15
شکل1-9  اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر	16
شکل1-10  ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز	17
شکل1-11 شکل نواری از آنزیم	17
شکل ‏1-12 واکنش میلارد. شاخه Z در اسیدآمینه آسپاراژین، CH2CONH2	25
شکل ‏1-13نقش کاتالیزوری آنزیم آسپاراژیناز در شکستن آسپاراژین	25
شکل1-14  مکانیسم عمل ال-آسپاراژیناز(نارتا و همکاران 2007)	26
شکل3-1 محیط  MMYبراث	44
شکل3-2 لوله‌های آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتری	46
شکل4-1 تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم	61
شکل4-2مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها	62
شکل4-3 محصول PCR مورد تائید برای کلونینگ	66
شکل4- 4 رشد باکتری حاوی پلازمید نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار	66
شکل4-5 گسترش باکتری نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار جدید	67
شکل4 -6 کشت باکتری نوترکیب در LB برای PEX	67
شکل4 – 7 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% –    8 R	67
شکل4 – 8 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 5 R	68
شکل4-9  پلازمید نوترکیب استخراج شده برروی ژل 1%	68
شکل4-10 تکثیر قطعه هدف از روی پلازمید نوترکیب استخراجی	69
شکل 4-11  هم تراز سازی توالی نمونه  5 R	71
شکل 4-12 هم تراز سازی توالی نمونه ی  8 R	77

 

 

چکیده فارسی

آنزیم آسپاراژیناز به‌طور عمده در پزشکی برای درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد[1]  و در صنایع غذایی برای کاهش تولید اکریل‌آمید در مواد غذایی نشاسته داری که سرخ یا برشته می‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژیناز[2]  جداشده از باکتری‌های مختلف دارای اثرات ضد سرطانی متفاوتی بوده است، جستجو برای یافتن میکروارگانیسم‌های تولیدکننده این آنزیم، یکی از راه‌های اصلی جهت دستیابی به آنزیمی با خصوصیات درمانی ایده آل می‌باشد. هدف این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکننده ال-آسپاراژیناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌های خاک از منابع مختلف نظیر جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهیه سوسپانسیون روی محیط کشت کشت داده شدند. کلنی‌های تولیدکننده‌ی آنزیم ال-آسپاراژیناز ، بر اساس تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی متمایز گردیدند. میزان فعالیت آن بر اساس روش نسلر موردبررسی قرار گرفت. باکتری‌های‌ تولیدکننده آنزیم دارای فعالیت مطلوب، پس از شناسایی بیوشیمیایی با روش مولکولی PCR مورد شناسایی قرار گرفتند و ‌توالی rRNA S 16نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده ،  بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتری های باسیلوس تورنجسیس و باسیلوس سرئوس و Oerskovia turbata  می باشد. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد نمونه های خاک حاوی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز می باشد.

کلمات کلیدی: آسپاراژیناز ،لوسمی،باکتری‌های مولد، نمونه‌های خاک

فصل اول

 

کلیات

 

مقدمه

آنزیم‌ها به‌عنوان تسریع‌کننده‌های واکنش‌های شیمیایی نقش مهمی در شکل‌گیری حیات سلولی  به‌نحوی‌که امروزه می‌شناسیم  ایفا می‌کنند. به‌کارگیری هدفمند آنزیم‌ها به‌منظور مداخله در سیر واکنش‌های شیمیایی و بیوشیمیایی همواره یکی از موضوعات موردتوجه در صنعت و پزشکی بوده است( رائو، 1999)

باکتری‌ها از اصلی‌ترین منابع تولید آنزیم به شمار می‌رود.. در این تحقیق باکتری‌های جداشده از خاک‌های مناطق  مختلف استان گلستان (مزرعه، جنگل، باغ) ازنظر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز خارج سلولی موردبررسی قرار گرفتند.

خاک یکی از مکان‌های عمده میکروارگانیسم‌ها محسوب می‌شود. فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌ها در خاک، باکتری‌ها هستند. خاک باغچه در هر گرم محتوی میلیون‌ها باکتری است. درجاهای عمیق تعداد آن‌ ها کاهش می‌یابد. قارچ‌ها به تعداد کمتر از باکتری‌ها در خاک یافت می‌شوند.( رائو، 1999)

فهرست مطالب                                                                                                        صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1

فصل اول (مقدمه و هدف) …………………………………………………………………………………………………………………..3

1-1-بیماری سل…………………………………………………………………………………………………………………………………..5

1-2- مایکو باکتریوم ها ………………………………………………………………………………………………………………………..7

1-2-1-نامگذاری…………………………………………………………………………………………………………………………………7

1-2-2- طبقه بندی مایکو باکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….9

1_2_3_ مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ………………………………………………………………………………. 11

1-2-4- خصوصیات رشد مایکوباکتریها ……………………………………………………………………………………………….12

1-2-5- فاکتورهای ویورلانس مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………..13

1-2-6- آنتی ژنهای مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………………………14

1-3- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………..15

1-4- اشکال بیماری سل …………………………………………………………………………………………………………………….17

1-5- عوامل مساعد کننده ……………………………………………………………………………………………………………………17

1-6- عارضه های بیماری…………………………………………………………………………………………………………………….18

1-7- پیدایش بیماری ………………………………………………………………………………………………………………………….18

1-8- روش های تشخیص ……………………………………………………………………………………………………………………..20

1-9- درمان ………………………………………………………………………………………………………………………………………21

1-10- عوارض داروهای ضد سل ……………………………………………………………………………………………………….22

1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23

1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23

1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23

1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26

1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو …………………………………………………………………………………………………27

1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27

1_14_ راه های ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29

1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30

1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30

1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35

1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36

1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39

1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39

1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39

1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39

1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40

1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40

1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42

1 _16_1_تكنیك‌های ژنومی كه اساس آنها PCR نمی‌باشد …………………………………………………………………..42

1_16_1_2_انگشت‌نگاری DNA  به روش RFLP …………………………………………………………………………….43

1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50

1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP………………………………………………………………………..  50

1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55

2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56

2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58

2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65

فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

 

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون  ………………………………………………………………………80

3_4_4_  رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی  جهت  ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA  کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS  به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

 

فهرست جدول ها

عنوان جدول                                                                                                              صفحه

جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….  8

جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­ های مختلف کندرشد مایکوباکتریای …………….  33

جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­ های مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی …..……………  35

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقده­های لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ………………………………..  71

جدول 3-2: لیست مواد مصرفی ……………………………………………………………………………………………………………  72

جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون …………………………………………………………………  79

جدول 3-4:  تست­های تعیین هویت مایکوباکتریوم­ها ………………………………………………………………………………. 81

جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر …………………………………………………………………………………..  91

جدول 4-1- نمونه­های مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونه­ها …………………………..  113

 

فهرست شکل ها

عنوان شکل                                                                                                                   صفحه

تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010……………………………………………………………………………………….. 6

تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها  …………………………………………………………………………………………….  11

تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………  11

تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ………………………………….. 13

تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ………………………………………………………………………………………  14

تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………  16

تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس ………………………………………….  20

تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ……………………………………………………………. 21

تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه…………………………………………………………………….  24

تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس …………………………………………………………………………………  29

تصویر1-13:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………….  41

تصویر1-14:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………….  41

تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………..  42

تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با بهره گرفتن از روش REA ……………………..  46

تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم  بویس  با بهره گرفتن از روش RFLP …………………… 46

تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV ……………………….. 51

تصویر1-19 : لوکوس DR و یک توالی فاصله انداز را DVR   میگویند …………………………………………………  51

شکل 1-20 : حذف توالی های فاصله انداز، که ممکن است در یک یا چند توالی فاصله انداز باشد ………….  52

تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر …………………………………………………………………………………….  57

تصویر 3-1: نمونه ­ای از عقده­های لنفاوی ………………………………………………………………………………………….  71

تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگ­آمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون……………….  75

تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگ­آمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی ……………..  76

تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگ­آمیزی فلوئوروکروم …………………………………………………………………… 81

تصویر 3-5: لوله­های تست نیاسین مثبت و منفی ………………………………………………………………………………..  82

تصویر 3-6- نمائی از لوله­های کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ………………………………………………………..  83

تصویر3-7: دستگاه نانودراپ …………………………………………………………………………………………………………..  88

تصویر 3- 8:  صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ………………………………………………………………………..  88

تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر …………………………………………………………………..  89

تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ……………………….  90

تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی …………………..  92

تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینه­ای ……………………….  97

تصویر 3-13: دات بلات PGRS  و DR ……………………………………………………………………………………………………………….  102

تصویر4-1- لوله های لونشتاین– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ………………………………..  106

تصویر4-2- الكتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 …………………………………….  107

تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه ……………………………………………………………………………………  108

شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP ……………………………………………………………………………  109

تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ………………………………………..  110

تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS ………………………………………………….  111

تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ……………………………………………………….  112

چکیده:

بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا بهره گرفتن از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.

در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت،  تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها  تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR  با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.

این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماری سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروی مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه های مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها برای ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماری سل درانسان ضروری است.

کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس– تعیین هویت مولکولی – RFLP   PGRS­DR,

فصل اول

در اوایل قرن بیستم پیشرفت علم شیمی منجر به توسعه صنعت داروسازی و تهیه داروهای شیمیایی گشت  و از آن زمان به بعد هر روزه داروهای شیمیایی به نسبت داروهای گیاهی، بیماریها را سریع تر درمان کرده و اثر قوی‌تر دارند امّا پیامدهای سوء ناشی از مصرف آنان نیز بیشتر از داروهای گیاهی است.

مصرف طولانی و برخی موارد منطقی داروهای شیمیایی عوارض خاصی در بدن بر جای می گذارد که عوارض جانبی نامیده می شوند و ممکن است ناراحتی های تازه ای برای بیمار ایجاد کنند.

به همین جهت امروزه بسیاری از متخصصان پزشکی و داروسازی معتقدند باید بیماران را به سوی مصرف گیاهان دارویی سوق داد و در راستای همین هدف در دهه اخیر، داروسازان از عصاره های گیاهی، داروهای متنوعی را ساخته و به بازار عرضه کرده اند که اثرات مثبت آنها مورد تأیید همه قرار گرفته است (قاسمی، 1382).

گیاه درمانی در بیماری ها و به ویژه بیماری های عفونی در سال های اخیر روند روبه فزونی پیدا کرده است. میکروبیولوژیست های بالینی تمایل زیادی به استفاده از داروها جهت درمان عفونت ها دارند، زیرا عوارض این داروها در مقایسه با داروهای شیمیایی به طور قابل ملاحظه ای پایین است(.(Cown, 1999

از زمان های باستان عصاره های گیاهان معطر برای هدف های گوناگون مثل غذا، دارو و عطر مورد استفاده قرار می گرفته اند(Longaray, 2005 ).

به دلیل مقاومتی که بعضی از میکروارگانیسمها نسبت به آنتی بیوتیکها کسب نموده اند، استفاده از فرآورده های گیاهی ضد میکروبی در دهه های اخیر توسعه بیشتر یافته است(Essawi, 2000 ). در سالهای اخیر اسانسها و عصاره گیاهی بخاطر توانایی بالقوه اشان در درمان بیماریهای عفونی و

 حفاظت از غذاها از اثرات سمی ترکیبات اکسیدان مورد توجه قرار گرفته اند(Tepe, 2004). بعلاوه آنها عامل مؤثری در جلوگیری از تشکیل ترکیبات مضر ناشی از اکسیداسیون لیپیدها در غذاها محسوب می شوند(Wang, 1998). کنترل بیماریهای میکروبی و غیرمیکروبی به وسیله فرآورده های گیاهی و استفاده از آنتی اکسیدان های طبیعی برای افزایش عمر محصولات غذایی از دیر باز مورد توجه محققین بوده است(Avato, 2000).از طرف دیگر فرآورده های گیاهی ضدباکتری، ضد قارچ، ضد ویروس، ضد پاتوژنهای گیاهی و ضد سرطان متعددی به وسیله محققین از گیاهان مختلف گزارش شده است(Eyup, 1996).

1-2- اهمیت و ضرورت تحقیق

گیاهان دارویی از ارزش واهمیت خاصی در تامین بهداشت و سلامت جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیشگیری از بیماری ها برخوردار بوده و هستن د. این بخش از منابع طبیعی قدمتی هم پایه بشر داشته و یکی از مهم ترین منابع تامین غذایی و داروی بشر در طول نسل ها بوده اند. از نقطه نظر تاریخی گیاهان اهمیت فراوانی در توسعه جوامع داشته اند و تحقیقات وسیعی برای یافتن فرآورده های و مواد طبیعی دارویی گیاهی در طول تاریخ انجام شده، اما نکته حائز اهمیت این جاست که تنها کم تر از 10 درصد تا 35 هزار گونه گیاهان دارویی (who) شناسایی و مورد استفاده قرار گرفته اند.

فلات وسیع ایران در این حال که یک واحد خاص جغرافیایی در روی کره زمین شمرده ولی از اقلیم ها و محیطهای گوناگونی در قسمت های مختلف بر خوردار است. ایران از 111 اکوسیستم طبیعی شناخته شده در جهان دارای 109 نوع از آن می باشد.کشور ایران با داشتن حدود 8500 گونه گیاهی از لحاض تنوع گیاهان دارویی از جمله کشورهای مهم جهان است.(کریمی، 1374).به همین دلیل گونه های گیاهی متنوعی در ان انتشار دارد . به طوریکه جوامع گیاهی منتشر شده در این فلات هر یک دارای ترکیب معینی از انبوه مختلف گونه ها می باشند .(امید بیگی، 1376).

با وجود این تعداد گونه گیاهی به جرأت می توان ایران را جهانی کوچک در چهارچوب یک مرز دانست و بجاست که فلور طبیعی ایران را طلایی سبز بنامیم.(Majrouhi, majd, 2001).

افزایش جمعیت و نیاز مبرم صنایع داروسازی به گیاهان دارویی به عنوان مواد اولیه تولید دارو ، ناتوانی در تولید مصنوعی پاره ای از داروهای حیاتی توسط صنایع داروسازی و همچنین اهمیت مواد موثر گیاهان دارویی در صنایع غذایی ، آریشی و بهداشتی باعث شده که توجه و تحقیق پیرامون این دسته گیاهان  از نقطه نظر کشت ، تولید و مصرف از اهمیت خاصی برخوردار باشد (باقری و همکاران 1387).

شیوع بالای بیماریهای عفونی مقاوم به درمان به علت افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک ها و مشکلات موجود در کاربردهای داروهای سنستیک، از جمله هزینه بالای دستیابی به داروهای جدید و عوارض جانبی داروهای موجود، توجه بسیاری از محققین را به طب سنتی معطوف کرده است.(Robert,2001  )

1-3- تاریخچه گیاهان دارویی

استفاده از گیاهان دارویی به منظور درمان با تاریخ زندگی انسان هم زمان بوده است. انسان در تمام دوران تاریخی چاره ای جزء توسل به گیاهان نداشت. اگرچه در نیم قرن گذشته، استفاده از داروهای شیمیایی و سنتزی به شدت رواج یافت ولی به سرعت آثار زیان بار آنها بر زندگی سبب گرایش مجدد به گیاهان دارویی گردید و این نکته که توسل به گیاهان دارویی همواره در طول تاریخ یکی از روش‌های مؤثر در درمان بوده است به خوبی روشن است. گیاهان دارویی به واسطه داشتن ترکیب های متفاوت از زمان های قدیم در درمان بیماری های مختلف مورد استفاده قرار می گیرند(سلطانی پور،1381).