فهرست مطالب

فصل اول

کلیات

1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………..2

1-2 اجزاء نفت خام……………………………………………………………………………………………………..4

1-3 اهداف کلی و جزئی………………………………………………………………………………………………7

1-4 اهمیت شناسایی و بررسی منابع نفتی………………………………………………………………………….9

1-5 فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………..10

1-6 سوالات تحقیق……………………………………………………………………………………………………11

فصل دوم

پیشینه پژوهش

2-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………13

2-2 نظریه منشاء آلی نفت………………………………………………………………………………………….15

2-3 میکروبیولوژی نفت………………………………………………………………………………………………17

2-3-1 ارتقاء کیفی…………………………………………………………………………………………………….19

2-3-2 ارتقاء کمی…………………………………………………………………………………………………….20

2-4 ارتقاء زیستی یا Bio upgrading ……………………………………………………………………….21

2-5 تولید اولیه نفت…………………………………………………………………………………………………..21

2-5-1 تولید اسید آلی که منجر به انحلال سنگهای کربناتی و توسعه کانال ها می شود………….21

2-5-2 احیای گوگرد ونیترات در ترکیبات گچی و انیدریدی و مواد معدنی سولفاتی که نفت

به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22

2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای

مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22

2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23

2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23

2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23

2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24

2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم

روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26

3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27

3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27

3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28

3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29

3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31

3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32

3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33

3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34

3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34

3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35

3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35

3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37

3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37

3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38

3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39

فصل چهارم

نتایج

4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41

4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41

4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42

4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42

4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43

4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44

4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48

5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48

5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52

5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55

5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58

فهرست جداول

جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3

جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44

جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45

فهرست نمودار

نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

چکیده

حضور وسیع باكتریهای بی‌هوازی و آركی‌ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است.  فرایندهای آرام بی‌هوازی در زیر زمین فراوان می‌باشد كه به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروكربن‌ها كه در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میكروارگانیزم‌هایی كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و كربن می‌باشند، با تولید یكسری محصولات جانبی و یا با شكستن تركیبات هیدروكربنی سنگین كمك شایانی در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.

در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده از هیدروکربن های ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با بهره گرفتن از   serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها  به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB  )  اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با بهره گرفتن از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.

کلمات کلیدی :  نفت خام ، باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

فصل اول

کلیات

• مقدمه

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) به منظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرایندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن  در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی  Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک  با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده.  از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S )  و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است.  در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی  و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس  و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

 جهت مقایسه ی انواع نفت خام نمی توان از آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده ی آن استفاده کرد. بدین منظور از آزمایشات استانداردی استفاده میشود که تعیین کننده ی قیمت نفت خام خواهد بود ( 7 ).

کلمه ی نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده می شود از دو کلمه ی petra و oleum که در زبان یونانی به ترتیب به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن می باشند تشکیل شده است . منابع انرژی در طبیعت شامل نفت، زغال سنگ، انرژی هسته ای، انرژی الکتریکی و غیره می باشد. با توجه به محدودیت منابع انرژی و اهمیت صرفه جویی در مصرف و آلودگی های زیستی ناشی از ان تحقیقاتی در زمینه ی علوم مختلف جهت مصرف بهینه و کاهش آلودگی های محیط زیست انجام شده است. به مجموعه تست هایی که شناسه ی نفت خام را مشخص میکنند crude assay گفته میشود. از جمله این خواص : اندازه گیری وزن مخصوص ، گوگرد ، نمک ، آب و مواد رسوبی ، گرانروی ، نقطه ی ریزش ، محدوده ی تقطیر ، ناخالصی های فلزی  و کربن باقی مانده میباشند. درجه ی API نفت خام در اکثر موارد بین10 تا 45 می باشد و به ندرت کمتر از 10 یا بالاتر از 50 میباشد.

نفت خام سنگین: با درجه API 10 الی 20

نفت خام متوسط: با درجه API 20 الی 30

نفت خام سبک: با درجه API بیش از 30

در یک دسته بندی کلی محصولات حاصل از نفت خام ایران شامل:

1-سوخت های گرمایشی

2-سوخت ماشین های درون سوز

فهرست مطالب

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………..1

فصل اول (کلیات تحقیق و مقدمه)…………………………………………………………………………………………………….2

1-1-بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………..5

فصل دوم (مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه آن)……………………………………………………………………………….7

2-1-کلیات (تاریخچه سابقه مطالعه و تحقیق کفزیان در ایران و جهان ………………………………………………….8

2-2-معرفی استان سمنان…………………………………………………………………………………………………………………9

2-3-چشمه های استان سمنان ……………………………………………………………………………………………………….11

2-4-معرفی مهم ترین راسته ها و خانواده های ماکروبنتوزهای آبهای شیرین ایران………………………………….12

2-5-راسته بهاره ها (پلکوپترا)……………………………………………………………………………………………………….12

2-6-راسته یکروزه ها(افموپترا)………………………………………………………………………………………………………16

2-7-راسته دوبالان (دیپترا)…………………………………………………………………………………………………………….23

2-8-بال موداران(تریکوپترا)…………………………………………………………………………………………………………..32

2-9-راسته ناجورپایان(آمفی پودا)…………………………………………………………………………………………………..37

2-10-رده تورکیان……………………………………………………………………………………………………………………….38

فصل سوم (مواد و روش کار)………………………………………………………………………………………………………….40

3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-2-وسایل نمونه برداری کفزیان…………………………………………………………………………………………………..41

3-3-نگهداری نمونه ها ………………………………………………………………………………………………………………..43

3-4-شناسایی ماکروبنتوزها……………………………………………………………………………………………………………43

3-5-دانه بندی رسوبات و تعیین موادآلی………………………………………………………………………………………….43

3-6-تعیین موقعیت ایستگاه های مطالعاتی………………………………………………………………………………………..44

3-7-منطقه مورد بررسی………………………………………………………………………………………………………………..47

3-8-عملیات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………………………………..52

3-9-سنجه یا معیار جمعیتی………………………………………………………………………………………………………….52

3-10-شاخص ها…………………………………………………………………………………………………………………………53

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………….56

4-1-رده بندی نمونه های موجود……………………………………………………………………………………………………57

فصل پنجم (بحث)………………………………………………………………………………………………………………………99

5-1-بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………..100

5-2-پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………..107

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………10 9

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………………….113

چکیده انگلیسی …………………………………………………………………………………………………………………………121

چكیده

تنوع و فراوانی بی مهرگان آبزی بر حسب شرایط محیطی متفاوت می باشند، بنابراین با توجه به حساسیت آنها نسبت به آلاینده های مختلف می توان شرایط آب از نظر آلودگی را ارزیابی نمود.  در این مطالعه تركیب و تنوع ماکروینتوزهای استان سمنان  در سال 1391-92 در چهار ایستگاه(چشمه های باداب سورت،چشمه قل قل وزرابه)،مورد بررسی و شناسایی قرار گرفت.

در این بررسی به منظور شناسایی ماکروبنتوزهای چشمه های باداب سورت قل قل زرابه و کورچشمه استان سمنان بدین منظور از بهمن ماه سال  1391لغایت مرداد ماه 1392 چهار ایستگاه(چشمه های باداب سورت قل قل زرابه و کورچشمه) انتخاب و بصورت فصلی و با بهره گرفتن از قاب توری ((Surber sampler 50×50 سانتی متر به مدت هفت ماه مورد نمونه برداری قرار گرفت و نمونه های جمع آوری شده را با فرمالین 4% تثبیت و جهت بررسی به آزمایشگاه منتقل گردیدند.  برخی شاخص های تعیین كیفیت آب كه بر فیزیولوژی موجودات بنتوزی و نیز كیفیت آب اثر گذار هستند از قبیل(اكسیژن محلول، دما،pH، TDS کل جامدات محلول، EC هدایت الكتریكی ، O2، دبی آب) مورد سنجش قرار گرفتند.  شاخص مارگالف، سیمپسون و شانون نیز برای تمامی ایستگاه ها در طول دوره نمونه برداری محاسبه گردید. براساس نتایج به دست آمده از این بررسی 25 خانواده از 13 راسته ،شامل:, Simuliidae, Tipulidae, Veliidae, Batidae, Stratiomyiidae, Tubificidae ,Anthomyiidae, Gomphidae Lestidae ,Glossiphonidae, Erpobdellidae, Corduliidae Dreissensiidae, Physidae, , Ancylidae, Tabanidae, Chironomidae, Argyronetidae, Gammaridae, Potamidae, Asellidae,Hydropsychidae Ceratopogonidae, Platycnemididae, ,Coenagrionidae, , در مجموع چهار ایستگاه شناسایی شد
واژگان كلیدی: آلودگی، سوربر، پارامترهای فیزیكوشیمیایی، ماكرو بنتوز، شاخص مارگالف, شاخص شانون،شاخص سیمپسون

فصل اول

کلیات تحقیق

مقدمه
آب های شیرین زیستگاه طبیعی گونه های فراوانی ازآبزیان است که هر یک تا حدودی دارای فون وفلور مخصوص به خود می باشد. بنا به عقیده روزنبرگ(Rosenberg,1999)  مهمترین ذخایر آبزی آب های شیرین، بی مهره گان کفزی ساکن آنها می باشند که در شبکه ی غذایی و تولیدات رودخانه نقش اساسی دارند. همچنین برای تعیین کیفیت محیطی رودخانه ها و پایش بیولوژیکی آنها به کار می روند. در این راستا، موجودات شاخص و عکس العمل های آنها را نسبت به شرایط محیطی در نظر می گیرند. بطورکل محققین، اندازه گیری پارامترهای فیزیکی و شیمیایی  آب را به مانند برداشت عکس و بررسی بیولوژیکی (بخصوص ماکرو بنتوزها) را مشابه تهیه فیلم ویدیویی از یک اکوسیستم می دانند(Rosenberg,1999). در واقع تنها راه عملی و به صرفه اقتصادی برای تعیین سلامت اکولوژیکی آب ها و تعیین اینکه آیا فعالیتهای انسانی موجب کاهش کیفیت آنها می شود، ارزیابی و پایش بیولوژیکی است(Lenat,1993). ایده اصلی فرابینی زیستی بسیار ساده است زیرا انواع جانداران آب های شیرین در شرایط معین کیفیت آب قادر به حیاتند. زمانی که شرایط تغییر می کند؛ مثلاً وقتی که یک چشمه مقادیر قابل توجهی از آلودگی دریافت می نماید، فراوانی، توزیع و ترکیب جمعیت موجودات آبزی در منطقه مورد اثر تغییر میکند و بی مهره گان کفزی از رایج ترین ارگانیزم های بکار رفته در این مقوله اند.
تعداد شاخص۵ برابر تمام شاخص هایی است که در ارتباط با سایر گروه ها  (جلبک ها وماهیان) وجود دارد. همچنین رینولدسون بیان می دارد که بی مهره گان کفزی، مؤثرترین گروه بوده و امروزه از اساسی ترین اجزای بیولوژی آب های شیرین هستند که به کمک آنها و با بهره گرفتن از ترکیب جمعیتشان و تکیه بر گروه های شاخص، شرایط کیفی آب ها مشخص می شود(Reynoldson,1992). در واقع  ماکروبتنوزها، موجوداتی هستند از جوامع جانوری که در داخل و یا روی بستر زندگی می کنند. بی مهره گان کفزی جانوری یا زئو بنتوزها ساکنان رایج در محیط های آبی بوده و حدأقل بخشی از چرخه زندگی خود را در بستر آبگیرها سپری می کنند. و بر روی الک های با منافذ ۵۰۰ میکرون (نیم میلیمتر) باقی می مانند(Rosenberg,1999). چندین ویژگی موجب شده که این موجودات بیشتر مورد توجه متخصصان پایش بوم سازه های آبی باشند.از جمله این ویژگی ها میتوان به این موارد اشاره نمود:

۱- آنها در همه آبگیرها حضور دارند.۲- تنوع گونه ای بالایی دارند  و با تعداد زیاد گونه ها اغلب دارای محدوده وسیعی از حساسیت نسبت به آلاینده ها بوده که پاسخهای وسیعی به تغییر شرایط مهیا می نمایند.۳- ساکن بستر بوده، جابجایی و حرکت مشخص ندارند.۴- چرخه زندگی طولانی داشته به طوری که امکان بررسی وتعیین حدود و وسعت مکانی و زمانی آشفتگی ها را فراهم می آورند.۵- تغییرات کیفی آب را برخلاف اندازه گیری پارامترهای فیزیکی وشیمیایی،

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

خلاصه فارسی………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………………………………….. 2

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1. بیان مسئله ……………………………………………………………………………………………………….. 5

1-2.ضرورت اهمیت موضوع ………………………………………………………………………………………. 5

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2.اصول تئوری …………………………………………………………………………………………………………. 7

2-1. مروری بر روش‌های استخراج مایع- مایع و میکرواستخراج مایع- مایع ………………………… 10

2-1-1.میکرو استخراج فاز مایع ………………………………………………………………………………… 11

2-1-1-1.میکرو استخراج فاز مایع با تک قطره …………………………………………………………….. 11

2-1-1-2.میکرو استخراج فاز مایع با فیبر تو خالی (HF-LPME)……………………………………… 13

2-1-1-2-1. اصول استخراج و سیستم‌های مختلف در استفاده از HF-LPME………………………. 14

2-1-1-2-2. جنبه‌های عملی و پیکر بندی‌های مختلف HF-LPME…………………………………… 16

2-1-1-2-3.میکرو استخراج فاز مایع از فضای فوقانی با فیبر توخالی………………………………… 19

2-1-1-3.میکرو استخراج فاز مایع با بهره گرفتن از انجماد حلال استخراج کننده………………………… 22

2-1-1-4.میکرو استخراج فاز مایع- مایع پخشی (DLPME) ………………………………………….. 22

2-1-2.استخراج فاز جامد ……………………………………………………………………………………….. 23

2-2. کروماتوگرافی ………………………………………………………………………………………………… 23

2-2-1. دسته‌بندی روش‌های کروماتوگرافی …………………………………………………………………. 24

2-2-1-1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)…………………………………………………….. 24

2-2-1-2. دستگاه‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………… 26

2-2-1-2-1.مخزن فاز متحرک…………………………………………………………………………………. 26

2-2-1-2-2. سیستم‌های پمپ کننده ………………………………………………………………………….. 27

2-2-1-2-3. سیستم‌های تزریق نمونه ………………………………………………………………………… 28

2-2-1-2-4. ستون‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………. 28

2-2-1-2-4-1. انواع پر کننده‌های ستون ……………………………………………………………………. 29

2-2-1-2-5. دمای ستون ……………………………………………………………………………………….. 29

2-2-1-2-6. آشکارسازها ………………………………………………………………………………………. 30

2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتریک …………………………………………………………………………. 31

2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)………………………………………………………….. 32

2-3.بررسی مطالعات دیگران در این زمینه ……………………………………………………………………. 33

2-4.بررسی داروی مورد مطالعه …………………………………………………………………………………. 36

2-4-1.مکانیسم اثر فارماکوکینتیک دارو………………………………………………………………………… 36

2-4-2.مکانیسم اثر………………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-3. موارد مصرف …………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-4.منع مصرف و احتیاط ……………………………………………………………………………………. 37

2-4-5.عوارض جانبی …………………………………………………………………………………………….. 38

2-4-6. تداخل‌ها …………………………………………………………………………………………………… 38

2-4-7.دوز مصرفی ……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل………………………………….. 38

2-5-1.از دلایل انتخاب این روش………………………………………………………………………………. 39

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1.مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی……………………………………………………………………….. 41

3-2-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه‌های حقیقی …………………………………………………….. 41

3-2-2.تجهیزات دستگاهی ………………………………………………………………………………………. 41

3-3.روش استخراج ………………………………………………………………………………………………… 42

3-3-1.استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت…………………………………………………… 42

3-3-2. مراحل بهینه‌سازی ……………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2-1.نوع حلال آلی …………………………………………………………………………………….. 44

3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده ……………………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-3.اثرpHفاز گیرنده …………………………………………………………………………………… 44

3-3-2-2-4.اثر قدرت یونی فاز دهنده ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آنالیت ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج …………………………………………………………………………………. 44

3-3-3. ارزیابی کارایی روش استخراج ……………………………………………………………………….. 45

3-3-3-1. منحنی درجه‌بندی ……………………………………………………………………………………. 45

3-3-3-2.تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF) ……………………………………………………………………. 45

3-3-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD) ………………………………………………………………………… 46

3-3-4.آنالیز نمونه حقیقی ……………………………………………………………………………………….. 46

فصل چهارم: نتایج

4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل …………………………………. 48

4-2. مراحل بهینه‌سازی…………………………………………………………………………………………….. 48

4-2-1. بهینه‌سازی شرایط HPLC………………………………………………………………………………. 48

4-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………………. 49

4-2-2-1.نوع حلال آلی………………………………………………………………………………………….. 49

4-2-2-2.طراحی آزمایش………………………………………………………………………………………… 51

4-2-2-2-1. غربال‌گری …………………………………………………………………………………………. 51

4-2-2-2-2. طراحی بهینه‌سازی ………………………………………………………………………………. 55

4-2-2-2-3. خلاصه نتایج بهینه‌سازی ……………………………………………………………………….. 59

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه‌ای روش استخراج …………………………………………………………….. 59

4-3-1.تهیه منحنی درجه‌بندی …………………………………………………………………………………… 59

4-3-2.فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) …………………………………………………. 60

4-3-3.تعیین حد تشخیص (LOD) …………………………………………………………………………… 61

4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD) ……………………………………………………………………………. 62

4-4.آنالیز نمونه ادرار و پلاسما ………………………………………………………………………………….. 62

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. بحث و نتیجه‌گیری…………………………………………………………………………………………… 66

5-2. پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………… 69

منابع…………………………………………………………………………………………………………………….. 70

خلاصه انگلیسی …………………………………………………………………………………………………….. 82

ضمایم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 82

فهرست جداول

عنوان                                                                                                           صفحه

جدول 2-1. کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………… 25

جدول 2-2. کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج گونه‌های مختلف ……………………………… 33

جدول 4-1. سطوح پایین و بالای مربوط به فاکتورهای بررسی شده ……………………………………. 52

جدول 4-2. آزمایشات طراحی شده پلاکت- بورمان جهت شناسایی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر روی نتایج SBME-HPLC برای جداسازی و اندازه‌گیری donepezil…………………….. 52

جدول 4-3. آزمایشات طراحی شده باکس- بهکن جهت بهینه‌سازی فاکتورهای موثر بر SBME…. 55

جدول 4-4. خلاصه نتایج بهینه‌سازی استخراج……………………………………………………………….. 59

جدول 4-5. ارقام شایستگی SBME داروی دونپزیل……………………………………………………….. 62

جدول 5-1. مقایسه روش ارائه شده با سایر روش‌های استخراجی……………………………………….. 66

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                            صفحه

شکل ( الف ). روش‌های استخراج و میکرواستخراج ………………………………………………………….. 3

شکل 2-1. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با بهره گرفتن از میله تفلونی …………………. 11

شکل 2-2. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقیم ازدرون محلول

ب)استخراج از فضای فوقانی ……………………………………………………………………………………………. 13

شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی ………………………………. 14

شکل 2-4. (الف) سیستم HF-LPME بر اساس پیکربندی (ب) پیکربندی میله‌ای U………………… 17

شکل 2-5. طرح شماتیک از سیستم HF-LPME…………………………………………………………….. 18

شکل 2-6. (الف): شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد (ب) سیستم نیمه خودکار …………. 19

شکل 2-7. طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش مستقیم (الف) و (ب) فضای فوقانی .. 21

شکل 2-8. شمایی از یک دستگاه HPLC……………………………………………………………………… 26

شکل 2-9. یک حلقه نمونه‌برداری کروماتوگرافی مایع …………………………………………………….. 28

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC………………………………………………………… 32

شکل 2-11. ساختار شیمیایی دونپزیل …………………………………………………………………………. 36

شکل 4-1.کروماتو گرام تزریق مستقیم 1میلی‌گرم بر لیتر محلول ابی دونپزیل ………………………… 49

شکل 4-2. بررسی نوع حلال پر کننده منافذ فیبر ……………………………………………………………. 50

شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحی پلاکت- بورمان …………………………………….. 54

شکل 4-4. نمودار مربوط به میزان و نحوه تغییر سطوح فاکتورهای موثر انتخاب شده ………………. 56

شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحی تخمینی و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهای موثر در کارایی استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC………………………………………………………………………………………. 57

شکل 4-6. منحنی درجه‌بندی در شرایط بهینه SBME 59

شکل 4-7. منحنی درجه‌بندی در محیط آبی حاصل از تزریق دارو قبل از استخراج ………………………………… 60

شکل 4-8. منحنی درجه‌بندی تزریق مستقیم ………………………………………………………………….. 61

شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو………………………………….. 63

شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو……………………………… 64

خلاصه فارسی

داروی دونپزیل یک مهار کننده مرکزی آنزیم استیل کولیناستراز است که در موارد خفیف تا شدید بیماری آلزایمر بهکار می‌رود. همچنین در برخی موارد در درمان بیش فعالی و نیز موارد دمانس مرتبط با پارکینسون مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در این مطالعه برای تغلیظ و اندازه‌گیری مقادیر کم این دارو در نمونه‌های بیولوژیک ادرار و پلاسما، ترکیبی از روش میکرواستخراج سه فازی مایع با نوار حلال و اندازه‌گیری با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)، به کار گرفته شد که بسیار موفقیت‌آمیز بود.

استخراج  دارو از محلول آبی 15 میلی‌لیتری که حاوی دارویدونپزیل در 9/11 pH=بود، به فاز آلی که شامل حلال n-اکتانولی که در منافذ فیبرتوخالی جای داده شده بود، صورت گرفت. سپس به منظور تغلیظ، داروی وارد شده در فاز آلی با یک عمل استخراجی برگشتی، به فاز آبی با 4 /3pH= که در داخل فیبر توخالی قرار داشت، منتقل گردید.

فرایند استخراج به دلیل گرادیان و اختلاف pH بین دو فاز آبی انجام می‌شود. به منظور دستیابی به بیشترین فاکتور تغلیظ، پارامترهای موثر در استخراج نظیر نوع حلال آلی، pH فاز دهنده و گیرنده، قدرت یونی، زمان، سرعت همزدن و دما بررسی و بهینه شدند.

پس از استخراج تحت شرایط بهینه، فاکتور تغلیظ 7/106، و حد تشخیص87/0 /Lبا انحراف معیار نسبی 9/2 درصد حاصل شد.

كلید واژه: دونپزیل – میکرو استخراج سه فازی مایع با نوار حلال

مقدمه

علم شیمی تجزیه روش­های متنوعی را برای آنالیز کمی و کیفی مواد ارائه می­دهد. امروزه روش­های جداسازی، تفکیک گونه­ای موجود در بافت‌های پیچیده را با حد تشخیصی در حد خیلی کم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش­های جداسازی، مرحله­ آماده‌سازی نمونه نیز یکی از مهمترین مراحل در روند تجزیه می­باشد. این مرحله شامل تبدیل بافت یک نمونۀ حقیقی به حالتی است که برای تجزیه با یک تکنیک جداسازی و یا روش­های دیگر مناسب باشد. می­توان گفت مرحله­ آماده‌سازی نمونه برای اهداف زیر طراحی شده است:

1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزایش گزینش‌پذیری روش

2- پیش تغلیظ آنالیت مورد نظر و افزایش غلظت آن به نحوی که بتوان آنرا با دستگاه‌های تجزیه­ای اندازه‌گیری کرد.

3- تبدیل آنالیت­ها به فرمی که برای شناسایی با دستگاه تجزیه­ای مناسب باشد.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                              صفحه

خلاصه فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات

1-1. بیان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-3. باکتریولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 7

1-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………. 10

1-4-1. توکسین پرتوسیس…………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین ها…………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-4-4. پرتکتین………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)…………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)………………………………………………………………………………………………. 17

1-4-7. توکسین حساس به حرارت……………………………………………………………………………………………………….. 18

1-4-8. BrKA………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

1-4-9. اندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس ………………………………………………………………………………………………………… 19

1-6. اپیدمیولوژی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-6-1. وضعیت بیماری در ایران……………………………………………………………………………………………………………. 21

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-9. تشخیص بیماری …………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-2-3. محیط B2…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

3-3-5-1. سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

3-3-5-2. سمیت زدایی با بهره گرفتن از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

فصل چهارم: نتایج

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

 فهرست جداول

عنوان                                                                                                                             صفحه

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2  بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2…………………………………………………………………………………………………… 54

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با بهره گرفتن از آزمون MWG   76

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG 77

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81

 فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                صفحه

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-3. مقایسه­ میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم  باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   66

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   67

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه  سویه 134  توسط  فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی  سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست  MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

نسبت به تیومرسال در سویه  509………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل……………………………………………………………………………………………….. 79

نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واكسن سیاه سرفه حاصل از سمیت­

زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG ……………………….. 79

نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV …………………………………………………………………………………… 81

       فهرست اشكال

عنوان                                                                                                                               صفحه

شكل1-1. كوكوباسیل سیاه سرفه……………………………………………………………………………………………………………… 7

شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی……………………………….. 9

شكل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توكسین…………………………………………………………………………………. 11

شكل3-1. فرمانتور استفاده شده برای كشت سیاه سرفه……………………………………………………………………… 58

خلاصه فارسی

سیاه سرفه بیماری عفونی باكتریال دستگاه تنفس است كه عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باكتری های گرم منفی می باشد.  در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باكتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیكی سانتریفوژ و میكروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باكتری از محیط كشت استفاده گردید. سپس سلول­های جداسازی شده باكتری درPBS  خنك و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­های سوسپانسیون سمیت­زدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD  بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM  10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD  در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انكوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واكسن آزمایشی FD وTD  از مخلوط كردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واكسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick  ارزیابی نمود. نتایج حاكی از آن بود كه روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره  6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش كوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری كاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با كاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر