فهرست مطالب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

صفحه	عنوان
	فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالب گذشته
2	1-1 زیست فناوری
3	2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیست­فناوری
3	1-2-1 پایگاه­داده
4	1-1-2-1 جایگاه Expasy
4	2-1-2-1 پایگاه­داده Swiss-Prot
7	3-1-2-1- پایگاه­دادهProsite  یا پایگاه­داده موتیف­ها
9	3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیش­گویی ساختار پروتئین
9	1-3-1 پیش­گویی ساختار دوم پروتئین­ها
10	2-3-1 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها
11	4-1 نمایش ساختار پروتئین
11	5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئین­ها
12	6-1 فلزات سنگین و اثرات زیست­محیطی آنها
14	7-1 منابع تولید کننده آلودگی­های فلزات سنگین
16	8-1 کادمیوم
16	9-1 حذف فلزات سنگین از محیط­زیست
17	1-9-1 روش­های فیزیکوشیمیائی
17	1-1-9-1 روش اسمز معکوس
17	2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی
17	3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون
18	4-1-9-1 تبادل یونی
18	5-1-9-1 رسوب­دهی شیمیایی
18	2-9-1 روش های پاکسازی زیستی
18	1-2-9-1 پاکسازی گیاهی
18	2-2-9-1 جذب زیستی
19	1-2-2-9-1 سازکار­های جذب زیستی
19	1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی
20	1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی
20	2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس
20	3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی
20	2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی
20	1-2-1-2-2-9-1 متیله­کردن فلز
21	2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن
21	3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم
21	10-1 سازکار­های ورود فلزات سنگین به ریزسازواره­ها
23	11-1 پروتئین­ها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین
26	12-1 نمایش سطحی باکتریایی
27	1-12-1 نمایش­سطحی در باکتری­ های گرم­منفی
29	2-12-1 نمایش پروتئین­های هترولوگ در باکتری­ های گرم مثبت
30	13-1 افزایش جذب­زیستی فلزات سنگین در باکتری­ های گرم منفی با روش­های مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایش­سطحی
33	14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی
36	1-14-1 پیلی­های باکتریایی و پیلی CS3
39	1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرون cst
40	2-1-14-1 تنظیم بیان CS3
40	15-1 اهداف تحقیق
	فصل دوم: مواد و روش­ها
42	1-2 بررسی­های بیوانفورماتیکی
42	1-1-2 پایگاه­های­داده و برنامه ­های بیوانفورماتیکی
43	2-1-2 ساختار پروتئین و روش­های پیش­گویی عملکرد
43	1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی
43	1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی
43	3-1-2  روش­های آنالیز ساختار اول
44	4-1-2 روش­ها و برنامه­ی پیش­گویی ساختار و عملکرد پروتئین
46	5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی
47	2-2 روش­های بیوانفورماتیکی
47	1-2-2 پیش­گویی ساختار دوم
47	2-2-2 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها و مدل­سازی
49	1-2-2-2 جستجوی توالی­های مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاه­داده  PDB
49	2-2-2-2 مدل­سازی مقایسه­ای
49	1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL
50	2-2-2-2-2 مدل­سازی با برنامه Modeller
51	3-2-2-2 مدل­سازی براساس روش شناسایی تاخوردگی
52	4-2-2-2 شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با بهره گرفتن از نرم‌افزار GROMACS
52	5-2-2-2 تغییرات RMSD
52	1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-pdb viewer
53	2-4-2-2-2اندازه ­گیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE
53	3-2-2 پیش­گویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین
54	3-2 مواد
54	1-3-2 ترکیبات استفاده­شده
54	2-3-2 آنتی بیوتیک ها
54	3-3-2 آنتی­بادی­های اولیه
54	4-3-2 آنتی­بادی­های ثانویه
54	5-3-2 باکتری­ ها
55	6-3-2 پلاسمیدها
57	7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها
58	8-3-2 کیت­های آزمایشگاهی
59	9-3-2 آنزیمها
59	10-3-2 نشانگر­ها
59	11-3-2 محلول­ها و بافرها
60	12-3-2 محیط­های کشت
60	1-12-3-2 محیط­های­کشت CFA آگار
60	13-3-2 محلول‌های مورد نیاز برای تهیه سلول‌های باكتریایی مستعد
60	14-3-2 محلول­های مورد نیاز به منظور نگهداری باکتری­ ها
60	4-2 وسایل و دستگاه­ها
61	5-2 روش­ها
61	1-5-2 کشت باکتری
61	2-5-2 استخراج پلاسمید
61	1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی
62	3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با بهره گرفتن از کیت
62	4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژل­آگارز با بهره گرفتن از کیت
62	6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی
62	1-6-5-2 مستعد سازی باکتری­ ها
63	7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری
64	8-5-2 واکنش زنجیره­ای پلی­مراز(Polymerase chain reaction, PCR)
64	1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)
67	1-1.                    9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته  cstHدر وکتورpBR322
68	10-5-2 تائید صحت کلون­های واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)
69	11-5-2 بررسی پروتیئن­ها
69	1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری
70	2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)
70	1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین
71	3-11-5-2 وسترن­بلاتینگ (Western Blotting)
71	4-11-5-2 لکه­گذاری برای سلولهای باکتری
72	12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس
73	13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز
73	14-5-2 ویژگی­های پلاسمیدهای استفاده­شده در این مطالعه
74	15-5-2 بررسی های آماری
	فصل سوم: نتایج
76	1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی
76	1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات
80	2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیش­گویی جایگاه مجاز در آن
80	1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف
87	2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها
90	3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهای­آمینه سطحی
93	4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون
94	5-2-1-3 پیش­گویی و تعیین ساختار دوم
96	3-1-3 پیش­گویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH
96	4-1-3 مدل­سازی پروتئین­های هیبرید
98	2-3  نتایج آزمایشگاهی
98	1-2-3  ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن cstH و توالی متصل شونده به کادمیوم
101	2-2-3 کلونینگ DNA زیر­واحد اصلی(CstH) جهش­یافته در وکتور کلونینگ
103	1-2-2-3 غربالگری کلون­های دارای پلاسمید­های نوترکیب
103	1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتی­بیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل
103	2-1-2-2-3 غربالگری با PCR
105	3-1-2-2-3 برش آنزیمی
105	4-1-2-2-3 تعیین توالی ژن­هایCstH::Cbm  وCstH::Cbβm  در کلون­های نوترکیب
106	3-2-3 کلونینگ ژن­هایcstH::cbm  و cstH::cbβm در اپرون cst
108	1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبرید cst::cbm و  cst::cbbm
109	1-1-3-2-3  تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی
110	2-1-3-2-3  تائید کلونیگ با PCR
112	4-2-3 بررسی بیان پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط روش­های دات­بلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین
113	1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری
114	2-4-2-3 وسترن بلاتینگ
115	5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm  توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسانس
117	6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتری­ های بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب
119	1-6-2-3 جذب کادمیم
120	2-6-2-3 اختصاصیت اتصال
	فصل چهارم: بحث و نتیجه ­گیری
123	1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستم­های بیان پروتئین
124	2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن
129	3-4 مقایسه موتیف­های طراحی­شده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتری­ های نوترکیب ساخته­شده در این پروژه با مطالعات پیشین
135	4-4 پیشنهادات
136	منابع
144	پیوست­ها

 

فهرست جدول­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
جدول 1-1. موتیف­های حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی	8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین	15
جدول 1-3. خانواده­های مهم پروتئین­های دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتری­ ها	22
جدول1 -4. ارگانل­های سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل می­شوند	35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپ­ها و موتیف­های ارائه شده توسط پیلی­ها	38
جدول 2-1. پایگاه­های­داده و برنامه ­های بیوانفورماتیکی	42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی	43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین	43
جدول 2-4. روش­های جستجوی پروفایل و پترن	44
جدول 2-5. ابزارهای پیش­گویی ساختار دوم	44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیش­گویی ساختار سوم	45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی	46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این تحقیق	56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتید­های استفاده شده در این تحقیق	57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR	65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید pPR322	67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق	68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتی­ژنی F1	81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روش­های محاسباتی به همراه امتیازات نمره­دهی بدست آمده­است	87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH	94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+, Cu2+  و Cr3+ بر جذب Cd2+ در حضور کادمیوم	121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستم­های نمایش­سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق	133

 

فهرست شکل­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
شکل 1-1. بخشی از اطلاعاتی که از پایگاه داده Swiss-Prot برای زیر واحد اصلی پروتیئن  CS3	6
شکل 1-2. برخی از عناصر سنگین مهم در طبیعت	14
شکل 1-3. آرایش عناصر ساختار دوم دومین HMA در پروتئین CadA و  اندرکنش فلز سنگین با اسیدهای آمینه سیسئین موجود در پروتئین ناقل فلز سنگین	23
شکل 1-4. ساختار شیمیایی فیتوچلاتین طبیعی و فیتوچلاتین سنتزشده	26
شکل 1-5. ترکیبات سطحی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت	27
شکل 1-6. عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی	29
شکل 1-7. دیاگرام شمایتک از سرهم بندی پیلی توسط مسیر چاپرون و آشر.	34
شکل 1-8. سازماندهی ژنتیکی لوکوس­های اپرون CS3 ، فلش­ها جهت پروموتر­ها را نشان می­دهد	39
شکل 2-2. خلاصه مراحل مدل­سازی پروتئین­ها	48
شکل 2-3. SOEing-PCR برای وارد کردن موتیف متصل شونده به فلز سنگین در جایگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بیانی	66
شکل2-4 .نقشه ژنتیکی پلاسمیدهای دارنده ژن کامل اپرون  cst  ( pPM4567 )  و ژنcstH  (pPM4555)	74
شکل 3-1. پترن توافقی دومین  اتصال به فلزات سنگین (HMA_1) و  نمایش لوگوی توالی پترن	77
شکل3-2. توالی  و نمودار شماتیک مربوط به دومین HMA _1  در پروتئین CadA	78
شکل 3-3. تطابق توالی بر مبنای ساختار دوم در منطقه انتهای آمینی انواع پروتئین­های دسته P1-type ATPases	79
شکل 3-4. همردیفی توالی- ساختاری بین پروتئین های الگو-هدف	85
شکل 3-5. همردیفی توالی الگو و هدف زیرواحد اصلی و چاپرون دو پیلی CS3 و F1 antigen	86
شکل .3-6. مدل­های تولید شده برای دو پروتئین CstH (سمت چپ) و CS3-1	88
شکل 3-7. ارزیابی پایداری دو ملکول CstH  وCS3-1  در طی شبیه سازی دینامیک ملکولی	88
شکل 3-8. بررسی کیفیت مدل های CstH و  cs3-1توسط سرور تحت شبکه Prosa و نقشه راما چاندران با سرور Procheck	90
شکل 3-9. کاندیدهای جایگاه های مجاز	91
شکل 3-10. آنالیز در معرض قرارگیری مدل CstH با کمک نرم افزار Discovery Studio 2.5	92
شکل 3-11. آنالیز مدل CstH با سرور VADAR	92
شکل 3-12. پیش گویی  پیش­گویی ساختار دوم زیرواحد اصلی پیلی  CstHو موقعیت نسبی مناطق مجاز بر روی آن	95
شکل 3-13. مدل سه بعدی CstH و موقعیت جایگاه های مجاز در آن   شکل 3-14. مقایسه ساختاری الگوها با مدل هیبرید و آنالیز و بررسی در معرض قرارگیری موتیف متصل شونده به فلز سنگین	96   97
شکل 3- 15. ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن cstH و توالی متصل شونده به کادمیوم	99
شکل 3–16. الکتروفورز محصولات SOEing-PCR	100
شکل 3-17. نحوه کلونینگ محصولات SOEing PCR در ناقل pBR322	102
شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسمید pBR322 و کلون­های نوترکیب بر روی ژل آگارز یک درصد	103
شکل 3- 19. الکتروفورز محصولاتPCR  کلون های نوترکیب   شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزیمی DNA نوترکیب با آنزیم­ های  AocI و. BamH1	104   105
شکل3- 21. شکل شماتیک کلونینگ ژن هیبرید cstH::cbm و  cstH::cbβm در اپرون پیلی CS3	107
شکل3 -22. برش آنزیمی پلاسمید pPM4567 و پلاسمید­های نوترکیب	108
شکل 3-23. الکتروفورز DNA پلاسمید­های نوترکیب pEYSm2 و pEYSbm2 روی ژل آگارز یک درصد.	109
شکل3-24. الکتروفورز برش آنزیمی DNA پلاسمید­های حامل اپرون نوترکیب با آنزیم HindIII بر روی ژل آگارز یک درصد	110
شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلون­های نوترکیب حامل کل اپرون بر روی ژل آگارز یک درصد.	112
شکل 3-26. دات بلاتینگ باکتری E. coli بیان کننده پیلی هیبرید با بهره گرفتن از آنتی­بادی CS3	113
شکل 3-27. وسترن بلاتینگ باکتری E. coli بیان کننده پیلی نوترکیب با بهره گرفتن از آنتیCS3.	115
شکل 3-28. تصاویر میکروسکوپ فلوئورسانس باکتریE. coli  بیان کننده پیلی نوترکیب با بهره گرفتن از آنتی­بادی CS3	116
شکل 3- 29. منحنی ظرفیت جذب کادمیوم در باکتری بیان کننده موتیف اتصالی به کادمیوم و باکتری E. coli میزبان	117
شکل 3-30. بررسی اثر عامل زمان بر جذب کادمیوم در باکتری­ های مهندسی شده	118
شکل 3-31. مقایسه جذب کادمیوم در سلولهای کنترل و سلولهای نوترکیب	120
شکل 4- 1.  ساختار دمین متصل شونده به فلز واقع در انتهای­آمینی پروتئین CadA باکتری لیستریا مونوسیتوژن و مدل پیشنهادی برای نحوه پیوند فلز با موتیف	128

 

چکیده:

گسترش فعالیت­های طبیعی و صنعتی در جوامع امروزی منجر به آلودگی اکوسیستم­های آبی و خاکی با فلزات سنگین، ترکیبات معدنی، آلی و رادیونوکلئوئیدها و در نتیجه به مخاطره افتادن حیات اکوسیستم­ها و سلامت انسان شده­است. حضور فلزات سنگین بیش از استاندارهای تعریف شده در محیط باعث بروز مشکلات و عوارض جدی و گاهاً جبران ناپذیر برای انسان و ساکنان آن اکوسیستم می­گردد. لذا می­بایست چاره اندیشی­های جدی در جهت کنترل و حذف آلاینده­ها از بیوسفر بکاربرد.

روش­های مختلفی برای حذف فلزات سنگین و کنترل آنها در محیط و از جمله پسماندهای صنعتی وجود دارد که بطور عمده شامل روش­های فیزیکی (مانند اولترافیلتراسیون و اسمز معکوس)، شیمیایی (از قبیل تبادل یونی و رسوب شیمیایی) و بیولوژیکی (مانند احیای باکتریایی سولفات، حذف گیاهی و حذف و پاکسازی با عرضه سطحی باکتریایی) می­باشند. روش های بیولوژیکی به سبب مزایایی مانند هزینه پایین، کارایی بالا، عدم نیاز به مواد مغذی فراوان، امکان احیای جاذب و امکان بازیافت فلز مورد توجه بیشتری قرارگرفته ­است.

عرضه سطحی باکتریایی با کمک متدهای DNA نوترکیب روش توانمندی برای ارائه پروتئین­ها و پپتیدهای همولوگ در سطح باکتری­ هاست که کاربردهای وسیعی در تهیه و تولید واکسن­های باکتریایی، غربالگری کتابخانه ­های پپتیدی، تولید آنتی­بادی­ها، تولید بیوکاتالیست­های نوترکیب، توسعه بیوسنسورها و ایجاد جاذب­های بیولوژیکی دارد. لذا بنظر می­رسد با بیان سطحی پروتئین­ها یا پپتیدهای قابل اتصال به فلزات سنگین مانند گلوتاتیون­ها، متالوتیونین­های غنی از سیستئین، فیتوکلاتین­های سنتزی و پپتیدهای موثر در نقل و انتقالات فلزات درباکتری­ ها، بتوان فلزات سنگین را در حداقل زمان از محیط­های آلوده حذف نمود.

در این مطالعه، ابتدا با کمک ابزارها و روش­های بیوانفورماتیکی، توالی پپتیدهای قابل اتصال به فلز کادمیوم استخراج گردید و نواحی مجاز دریافت پپتیدهای­بیگانه در سطح پیلی CS3 باکتری اشریشیاکلی پیش­گویی شد. سپس با فنون مهندسی ژنتیک و SOEing PCR، موتیف­های قابل اتصال به فلز کادمیوم در این مناطق وارد شده و بیان آنها در سطح باکتری اشریشیاکلی با روش های متعدد از جمله روش های لکه­گذاری و میکروسکوپ فلوروسانس ارزیابی شد.

در نهایت قابلیت و ظرفیت جذب فلز کادمیوم بوسیله باکتریهای نوترکیب، با روش جذب­اتمی اندازگیری گردید و نتایج نشان­داد که بطور متوسط سطح جذب فلز در باکتری­ های بیان کننده پیلی نوترکیب واجد موتیف و یا موتیف به همراه زنجیره β در مقایسه با سویه کنترل بیان کننده پیلی 8 الی 16 برابر شده­است و علاوه بر این، سویه­های نوترکیب از محلولی که شامل مخلوطی ازفلزات که شامل مس، نیکل، کادمیوم و کروم بود بطور ترجیحی و انتخابی کادمیوم را جذب می­نمایند.

واژگان کلیدی: مدل­سازی پروتئین، موتیف جاذب فلز سنگین، پیلی باکتریایی و جذب فلز سنگین