فهرست مطالب

عنوان                                                                               صفحه

چکیده فارسی…………………………………………………………….. 1

فصل اول: مقدمه

1-1 پروتئین ALCAM. …………………………………………………………………. 3

1-2 سرطان ……………………………………………………………………………. 6

1-3 سرطان کولورکتال……………………………………………………….. 6

1-3-1انواع مختلف سرطان کوورکتال………………………………… 9

1-3-2 علائم شایع سرطان کولورکتال…………………………………….. 9

1-3-3 تعیین مرحله بیماری  ………………………………………………… 10

1-3-4 تشخیص سرطان کولورکتال ……………………………… 13

1-3-5 انواع ژنتیکی سرطان کولورکتال و تغییرات مولکولی انها ……………………………………. 15

1-3-6 عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان کولورکتال………………………………………….. 20

1-3-7 درمان های رایج سرطان کولورکتال…………………………………………………………. 21

1-4 مساله تحقیق ……………………………………………………………………………………….. 23

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 ALCAM در درمان سرطان……………………………………. 24

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………. 27

3-1-1 باکتری مورد استفاده…………………………………………………………………………………………… 27

3-1-2 پلاسمید………………………………………………………………………………………………………………………. 27

3-1-3 انزیم ها……………………………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-5 انتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………. 28

3-1-6 محیط کشت ………………………………………………. 28

3-1-7 ژل ………………………………………………………………………. 28

3-1-8 مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………………. 28

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………………. 28

3-2  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئینALCAM.. …………………………………………………………………… 34

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر………………………………………………………………………………………………….. 34

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………….. 35

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………… 35

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب……………………………………………………………………………………………….. 35

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده………………………………….. 35

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه……………………………………………………………………………………. 36

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK  حاوی DNA ناحیهV پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 36

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli…………………………………………………………… 38

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 38

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………. 39

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK  حاوی DNA ناحیه Vپروتئین ALCAM………………………………………………… 39

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………. 41

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion………………………………………………………………………………… 42

3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………….. 42

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهV  پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………….. 44

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه Vاز ژل……………………………………………………………….. 44

3-5-2 ………………………………………………………………………….. 46

3-5-3 ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………………………… 46

 

 

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 47

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………… 48

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………. 48

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ناحیه VپروتئیALCAM……………………………………………………. 49

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج ……….. 51

3-6  بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………….. 52

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG…………………………………………………………………………. 52

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page………………………………………………………………. 52

3-6-2-1 محتویات كیت.    SDS-page     ……………………………………………………………………..53

3-6-2-2روش انجام  SDS_page………………………………………………………………… 54

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………… 58

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization…………………………………… 58

4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه …………………………………………… 63

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSKحاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM……………………………………………………….. 65

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM………………………………………………………………………………. 66

4-5 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page………………………….. 69

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث……………………………… 71

نتیجه گیری……………… 83

منابع……………………………………… 84

چکیده انگلیسی………………………………..91

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                          صفحه

شکل1-1. نمای شماتیک از ساختار پروتئینALCAM…………………………………………………………………….. 4

2-1 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیاییALCAM در بافت توموری………………………………………………….. 5

شکل 1-3. اناتومی کولون و رکتوم…………………………………………………………………………………….. 7

شکل1-4 مرحله صفر سرطان کولورکتال……………………………………………………………. 10

شکل1-5 مرحلهƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال…………………………………… 11

شکل1-6 مرحلهƖƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال……………………………………. 11

شکل 1-7 مرحلهA]]] از پیشرفت سرطان کولورکتال………………………… 12

شکل1-8. مرحله. B. ƖƖƖاز گسترش سرطان کولورکتال…………………………………….. 12

شکل 1-9 مکانسیم ناپایداری میکروستلایت………………………………………………………… 18

شکل 1-10 تفاوت های پاتولوژی بین تومورهایی که ناپایداری کروموزومی و میکروستلایت…………………………………………………. 19

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ……………………………………………………………………………….. 29

شکل 3-2.شیکر انکوباتور…………………………………………………………………………………….. 30

شکل  3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 30

شکل 3-4. تانک الکتروفورز (SDS-Page)…………………………………………………………………. 31

شکل 3-5…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………. 31

شکل3-6. سانتریفیوژ اپندورف المان……………………………………………………………………….. 32

شکل 3-7… بن ماری………………………………………………………………………………………………….. 32

شکل 3-8… انکوباتور………………………………………………………………………………………. 33

شکل 3-9 دستگاه تصویرساز ژل………………………………………………………………………….. 33

شکل 3-10 سانتریفوژ یخچال دار. ……………………………………………………………………… 34

شکل 3-11 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز………………………………………………… 39

شکل3-12 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز…………………………………………… 44

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………. 60

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی …………………………….. 60

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………….. 60

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………… 61

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………… 63

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   ………………………………………………………….65

  شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAناحیهV………………………………………………………………………………. 66

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهVپروتئینALCAM.             …………………………………………………………….. 67

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK………………………………………………. 67

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a………………………………………………………….. 68

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه …………………………………….. 69

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه Vدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………. 69

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………. 70

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ………………………………………………………………. 71

فهرست جداول

جدول 1-1 میزان بروز و مرگ ومیر سرطان کولورکتال در ایران و کشور های همسایه ایران در هر صد هزارنفر…………………….. 8

 

چکیده

مقدمه :

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده ایمنوگلوبولین ها ALCAM مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده می باشد.این پروتئین در گسترش تومورزایی سرطان کولورکتال نقش داشته و به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان عمل می کند.بیان این پروتئین به طور قابل توجهی در سرطان کولورکتال نسبت به بافت نرمال افزایش پیدا می کند

سرطان کولورکتال با 2/1 مورد جدید در سال که منجر به مرگ 600 هزار نفر در سال می شود  نزدیک به ⅓ از رایج ترین نوع تومورها را تشکیل می دهند. که از این نظر  دومین نوع شایع از سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد.از طرفی با توجه به متاستاز ان به نواحی مختلف بدن همچون کبد و ریه در مراحل پیشرفته بیماری ،تنها در صورتی که در مراحل اولیه تشخیص داده شود قابل درمان می باشد. در این تحقیق ما ناحیه Vپروتئین ALCAM را که به عنوان مهمترین بخش در تعاملات پروتئین نقش دارد جهت سنتز انتخاب نمودیم. پروتئین ALCAM نیز به عنوان مارکر سلول های سرطان کولورکتال ، با توجه به بیان ان در مراحل مختلف از پیشرفت بیماری در سطح سلول های سرطان کولورکتال می تواند به عنوان یک هدف مناسب جهت استفاده از ان در کارهای درمانی مثل ساخت واکسن و یا تهیه کیت تشخیصی برای سرطان کولورکتال مورد استفاده قرار گیرد.

روش کار :

در این تحقیق ابتدا توالی مورد نظر را با بهره گرفتن از بانک های اطلاعات ژنی استخراج  و سپس به وسیله انالیز

بیو انفورماتیکی توالی مورد نظر  جهت بهترین بیان در میزبان مناسب بهینه سازی شد. توالی مورد نظر به روش شیمیایی سنتز و سپس قطعه سنتز شده را در میزبان مناسب با بهره گرفتن از فرایند کلونینگ و از طریق وکتور بیانی مناسب انتقال داده  شده و تکثیر پیدا کرد.در برسی استفاده از القاگر مناسب بیان ژن ناحیه سنتز شده  در میزبان      بررسی شد.  SDS-pageاستفاده از تکنیک    نوترکیب القا و پروتئین مورد نظر با

بحث و نتیجه گیری :

این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین ناحیه V را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت کرد.

واژه های کلیدی: سرطان کولورکتال، ژن ناحیهV، انالیز بیوانفورماتیکی ،کلونینگ

فصل اول  :   مقدمه

1-1 پروتئین ALCAM(CD166)

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛  مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و         )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

200 تشکیل شده است همچنین وزن موکلولی ان 105 کیلو Kb اگزون[5] و اندازه ایی بیش از

دالتون می باشد(اولریچ وایدله و همکاران ،2010) این پروتئین شامل پنج دومین خارج سلولی  می باشد .(سالمون اوفوری و جودی کینگ[6]،2008C2[7]و سه نوع V[8] ایمنو گلوبولین دو نوع

مابکل بوون واروفوو[9]،1999)

گیادو اسوارت[10]،2002))ALCAM شکل1- 1  نمای شماتیک از ساختار پروتئین

این پروتئین در تعامل سلول- سلول از نوع هموفیلیک و هتروفیلیک نقش دارد.در نوع هموفیلیک    واکنش می دهد.(اولریچ  CD6) و در تعامل هتروفیلیک با ALCAM-ALCAM با خودش (

وایدله و همکاران،2010؛ اریک اندرسون و همکاران[11]،2011؛کاترینا فانالی و همکاران[12] ،2014) این پروتئین هم چنین در مهاجرت سلولی  نقش ایفا می کند.(جودی کینگک و همکاران [13]،2004 )

به طول110 امینواسیدV2  به طول 93 امینو اسید  و هم چنین V1شامل دو قسمت V ناحیه

می باشد هم چنین یک ناحیه کوچک به طول 4 امینو اسید این دو ناحیه را به هم متصل می کند..

را برای هر دونوع تعامل هموفیلیک و Vمطالعات تهیه نقشه عملکردی دومین ها حضور دومین

هتروفیلیک ضروری دانست.(مایکل بوون و همکاران[14]،1996)

چندین روش مبتنی بر  روش های ژنومیک[15] و پروتئومیکس[16] این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان انتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال  شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) انتی ژن ها  مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان