چکیده
 
هدف از انجام این مطالعه تولید بیوپلیمر پلی­هیدروکسی­ آلکانوآتها با بهره گرفتن از منابع کربنی گلوکز، فروکتوز، ملاس و آب پنیر توسط میکرو ارگانیسم های   Azohydromonas lata  DSMZ 1123، Azotobacterbeijerinckii DSMZ 1041 ، Cupriavidus necator DSMZ 545، Hydrogenophaga pseudoflava DSMZ 1034  بوده است. در مرحله نخست جهت غربالگری میکروارگانیسم ها وانتخاب میکرو ارگانیسم هدف برای تولید بیوپلیمر، شرایط مناسب دما، سن تلقیح و شدت هم زدن برای هر میکروارگانیسم مشخص گردید. در شرایط بهینه هر یک از منابع کربنی به تنهایی مورد استفاده قرار گرفتند تا نوع و میزان بیوپلیمر تولیدی توسط هر یک تعیین گردد.  با توجه به نتایج به دست آمده C. necator  به لحاظ دارا بودن شرایط مطلوب (رشد مناسب وموثر بر روی محیطهای مورد نظر،ثبات  فعالیت بیولوژیکی نسبت به سایر میکروارگانیسم های مورد بررسی وبازده تولید قابل ملاحظه بیوپلیمر  ) به عنوان میکروارگانیسم مناسب جهت ادامه تحقیق انتخاب شد . در فرایند غیر پیوسته تولید بیوپلیمر در فلاسک با بهره گرفتن از C. necator  بر روی منابع گلوکز، فروکتوز و ملاس ، میزان تولید بیوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات به ترتیب 3/3 ، 9/5 ، 3/1 گرم بر لیتر ومیزان بهره دهی بهترتیب 07/0 ، 08/0 ، 03/0 گرم بر لیتر بر ساعت بوده است . علاوه براین از استات ( استات سدیم با غلظت بهینه 10 گرم بر لیتر ) به عنوان مکمل منبع کربنی به همراه ملاس جهت تولید بیوپلیمر استفاده شد که منجر به تولید میزان 2/7 گرم برلیتر کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات شد. از کوپلیمر تولید شده میزان پلی هیدروکسی بوتیرات و پلی هیدروکسی والرات به ترتیب 9/6 و 32/0 گرم بر لیتر بود. در مرحله دوم با بررسی سینتیک رشد در فرایند غیر پیوسته وپیش بینی روند رشد و تولید محصول، فرایند غیر پیوسته و نیمه پیوسته در بیوراکتور جهت تولید بیوپلیمر مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا در فرایند غیر پیوسته بر روی گلوکز،  میزان پلی هیدروکسی بوتیرات 2/4 گرم بر لیتر به ازای مصرف 16 گرم بر لیتر منبع کربنی بود و ضریب انتقال  اکسیژن 16/0 بر ثانیه وشدت رشد ویژه میکروارگانیسم 17/0 بر ساعت به دست آمد. سپس فرایند نیمه پیوسته با بهره گرفتن از دو روش خوراک دهی ثابت و متغیر پله ای منبع کربن و نیتروژن در غلظتهای 300 و 10 گرم بر لیتر بررسی شد. میزان تولید پلی هیدروکسی بوتیرات در خوراک دهی ثابت 2/8 گرم بر لیتر و در خوراک دهی متغیر 8/11 گرم بر لیتر به دست آمد که  حدود 40 درصد افزایش یافت . میزان بهره دهی فرایند های غیر پیوسته و نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت و متغیر به ترتیب 04/0 ، 085/0 ، 137/0 گرم بر لیتر بر ساعت بود. در مرحله سوم امکان تولید نانوکامپوزیتهای پلیمری با بهره گرفتن از بیوپلیمر تولید شده مورد بررسی قرار گرفت . با بهره گرفتن از روش تثبیت در حلال ، محلول کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات  در کلروفرم به همراه نانوذرات هیدروکسی اپتایت قرار گرفت.نتایج حاکی از آن بود که تولید نانوکامپوزت با بهره گرفتن از اولتراسونیک نتیجه بهتری در بر داشت و نانوذرات بصورت یکنواخت بر روی سطح بیوپلیمر تثبیت گشتند.
 
کلمات کلیدی:   پلی هیدروکسی آلکانوات، Cupriavidus necator DSMZ 545، کشت غیر پیوسته،کشت نیمه پیوسته،مدل سینتیکی، نانوکامپوزیت بیوپلیمری
فهرست مطالب
عنوان                                                                                                         صفحه
مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………1
فصل اول- مروری بر مطالعات پیشین
1-1- میکروارگانیسم­های تولیدکننده پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها …………………………………………………… 7
 1-2- کوپلیمرهای هیدروکسی­آلکانوات  ………………………………………………………………………………….11
1-3- نحوه سنتز بیوپلیمرهای هیدروکسی­آلکانوات………………………………………………………………………14
1-4- منابع ارزان­قیمت کربنی در تولید پلیمرهای PHA ………………………………………………………………15
1-5- سنتز پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها در گیاهان………………………………………………………………………..16
1-6- اندازه ­گیری کمی بیوپلیمرها…………………………………………………………………………………………….18
1-7- خواص فیزیکی و موارد استفاده پلیمرهای زیستی………………………………………………………………. 19
1-8- قابلیت تجزیه­پذیری پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها………………………………………………………………….21
1-9- فرایند تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها…………………………………………………………………………….23
1-9-1- فرایند  غیر پیوسته……………………………………………………………………………………………………..23
1-9-2- فرایند نیمه پیوسته و پیوسته………………………………………………………………………………………….24
1-10- مدل سینتیکی رشد میکروارگانیسم…………………………………………………………………………………28
1-10-1- بررسی سینتیک رشد در فرایند غیر پیوسته……………………………………………………………………31
1  -11- تعیین ضریب انتقال اکسیژن  دربیوراکتور……………………………………………………………………….33
1-11-1- روش های اندازه گیری  ………………………………………………………………………………………33
 
 عنوان                                                                                                        صفحه
1-12- استفاده پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها در صنایع …………………………………………………………………….36
1-13- کاربرد بیوپلیمر ها در نانوکامپوزیتهای پلیمری……………………………………………………………………39
1-13-1-  انواع نانوکامپوزیتهای پلیمری ……………………………………………………………………………………39
1-13-2- روش های ساخت نانوکامپوزیتهای پلیمری …………………………………………………………………..41
 
فصل دوم- مواد و روش ها
2-1- میکروارگانیسم………………………………………………………………………………………………………………45
2-2- انتقال میکروارگانیسم از حالت یخ خشک به محیط كشت اولیه………………………………………………47
2-3- محیط نگهداری…………………………………………………………………………………………………………….47
2-4- محیط کشت تلقیح………………………………………………………………………………………………………..48
2-5- محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………………….48
2-6- آماده سازی کشت تلقیح………………………………………………………………………………………………..49
2-7- شرایط تخمیر ونمونه برداری…………………………………………………………………………………………..49
2-8-  تهیه منحنی كالیبراسیون وزن خشك سلولی- جذب…………………………………………………………..50
2-9-  تهیه منحنی­های كالیبراسیون جهت تعیین مقادیر منابع کربن…………………………………………………51
2-9-1-  طرز تهیه محلول معرف DNS…………………………………………………………………………………..51
2-9-2- رسم منحنی كالیبراسیون قندهای قابل تبدیل………………………………………………………………….51
 
 
عنوان                                                                                                        صفحه
2-10- شرایط کروماتوگراف­گازی برای اندازه ­گیری پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها……………………….52
2-10-1- تهیه استاندارد داخلی………………………………………………………………………………………….53
2-10-2- تهیه منحنی­های کالیبراسیون متیل­هیدروکسی­بوتیرات، متیل هیدروکسی­والرات
و متیل­هیدروکسی­هگزانوات……………………………………………………………………………………………..53
2-10-3- استخراج بیوپلیمر و آماده سازی نمونه برای تزریق به دستگاه GC………………………………54
2-10-4- روش شناسائی و تایید بیوپلیمر توسط 13C NMR،1H NMR ،. FT-IR…………………………..55
2-10-4-1- طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) …………………………………………………………………..55
2-10-4-2- طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ………………………………………………55
2-11- فرایند بیولوژیکی جهت تولید بیوپلیمر درون سلولی در بیوراکتور…………………………………..56
2-11-1- فرایند کشت غیرپیوسته………………………………………………………………………………………..56
2-11-2- فرایندکشت نیمه پیوسته………………………………………………………………………………………..56
2- 11- 2- 1- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت منبع کربن ونیتروژن………………………57
2- 11- 2- 2- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی متغیر  منبع کربن ونیتروژن …………………….57
2-11-3- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور………………………………………………………………..57
2-12- تولید نانو کامپوزیت پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات
/هیدروکسی اپتایت………………………………………………………………………………………………………….59
 
 
 
عنوان                                                                                                       صفحه
فصل سوم- نتایج و بحث
3-1- میکروارگانیسم Hydrogenophaga pseudoflava DSMZ 1034…………………………62
3-1- 1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی………………………………………………………………………………62
3-1-2- استفاده از گلوکز بعنوان  تنها منبع کربن……………………………………………………………………..63
3-1-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن …………………………………………………………………….65
3-1-3- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن …………………………………………………………………….66
3- 2- میکروارگانیسم  Cupriavidus necator DSM 545………………………………………………68
3-2-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی ……………………………………………………………………………….68
3-2-1-2- بررسی تاثیر نسبت نیتروژن به کربن ……………………………………………………………………….69
3-2-2- استفاده از گلوکز بعنوان  تنها منبع کربن……………………………………………………………………..73
3-2-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن…………………………………………………………………….74
3-2-4- استفاده ازملاس بعنوان تنها منبع کربن………………………………………………………………………..75
3-2-5- تاثیر استات بر رشد میکروارگانیسم و تولید بیوپلیمر……………………………………………………..77
3-2-5-1 -ترکیب ملاس و استات بعنوان منابع کربن……………………………………………………………….77
3-3- میکروارگانیسم  Azotobacter beijerinckii DSMZ 1041…………………………………..80
3-3-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی………………………………………………………………………………80
3-3-2- استفاده از گلوکز بعنوان  تنها منبع کربن…………………………………………………………………….82
3-3-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن……………………………………………………………………83
3-3-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن…………………………………………………………………….84
3-4- میکروارگانیسم Azohydromonas lata DSMZ 1123…………………………85
عنوان                                                                                                     صفحه
3-4-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی………………………………………………………………………………85
3-4-2- استفاده از گلوکز بعنوان  تنها منبع کربن……………………………………………………………………87
3-4-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن …………………………………………………………………..88

3-4-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن …………………………………………………………………..89
3-5- نتایج کلی مقایسه چهار میکرو ارگانیسم در تولید بیوپلیمر ……………………………………………….92
3-6- بررسی سینتیک رشد میکروارگانیسم در تولید بیوپلیمر……………………………………………………92
3-7- فرایند کشت غیر پیوسته در بیوراکتور………………………………………………………………………….95
3-7-1- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور ………………………………………………………………..97
3-8- فرایند کشت نیمه پیوسته  با خوراک دهی ثابت در بیوراکتور………………………………………….98
3-9- فرایند کشت نیمه پیوسته  با خوراک دهی متغیر (پله ای) در بیوراکتور……………………………….99
3-10- بازده بیومس ……………………………………………………………………………………………………..100
3-11- بهره دهی ………………………………………………………………………………………………………..102
3-12- بازده تولید ……………………………………………………………………………………………………….103
3- 13- آزمایشهای تشخیصی جهت تایید بیوپلیمر تولید شده……………………………………………………105
3-13-1- طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) …………………………………………………………………….105
3-13-2- طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ………………………………………………….106
3-14- بررسی امکان استفاده از بیوپلیمر تولید شده در نانوکامپوزیتها………………………………………….108
 
 
عنوان                                                                                                     صفحه
 
فصل چهارم-نتیجه گیری وپیشنهادات
4-1- نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………113
4-2- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………..116
مراجع …………………………………………………………………………………………………………………..117
چکیده انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………127
پیوستها…………………………………………………………………………………………………………………128
 
عنوان                                                                                                          صفحه
شکل 1-1-شمای ختار کلی پلی هیدروکسی آلکانوآتها…………………………………………………………………..8
شکل 1-2- ساختار شیمیایی پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها …………………………………………………………………12
شکل 1 -3- مسیر بیوسنتز پلی­هیدروکسی­بوتیرات و پلی­هیدروکسی­بوتیرات – والرات………………………….14
شکل1-4- تغییرات موردی یک نمونه از مواد تخریب پذیر زیستی در طول زمان…………………………………….. 22
شکل 1-5- شمائی از بیوراکتور استفاده شده جهت فرایند غیر پیوسته و پیوسته …………………………………. 25
شکل 1-6- نمائی از فرایند پیوسته دو مرحله ای…………………………………………………………………………….26
شکل 1-7-  مدل های رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………29
شکل 2-1- اندازه گیری مستقیم میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت  توسط روش دینامیک…………..58
شکل 3-1-  تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm ………………………………………………………………………………………………62
شکل 3-2- تاثیر شدت  هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 12 h ………………………………………………………………………………………………….63
شکل 3-3- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate =
250 rpm ، (seed age = 12…………………………………………………………………………………………….63
شکل 3-4 – بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا…….64
شکل 3- 5- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا…..65
 
عنوان                                                                                                          صفحه
شکل 3-6 – بیوپلیمر تولیدشده (PHB,PHV)  ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر……………….66
شکل 3-7 – تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm……………………………………………………………………………………………….68
شکل 3-8-  تاثیر شدت  هم زدن بر روی رشد سلولی  وتولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی (T = 30°C،(seed age = 24………………………………………………………………………………………………………69
شکل 3-9- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،  (seed age = 24…………………………………………………………………………………………………..  69
شکل 3-10- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 20) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر………………………71
شکل 3-11- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 30) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر………………………71
شکل 3-12-  بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز  با نسبت کربن به نیتروژن 40 72
شکل 3-13- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 50) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر………………………73
شکل 3-14- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا….75
شکل 3-15- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ملاس به عنوان سوبسترا……76
شکل 3-16- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت
(35 به 5) به عنوان سوبسترا…………………………………………………………………………………………………….. 77
شکل 3-17- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات بانسبت
( 30 به10 ) به عنوان سوبسترا……………………………………………………………………………………………………78
 
عنوان                                                                                                          صفحه
شکل 3-18- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت
(25 به 15) به عنوان سوبسترا…………………………………………………………………………….. ……………………..79
شکل 3-19-  بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت
(20 به 20)  به عنوان سوبسترا……………………………………………………………………………………………………79
شکل 3-20- تاثیر شدت  هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی
(T = 30°C،(seed age = 15   …………………………………………………………………………………………81
شکل 3-21- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی
(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =15h…………………………………………………………………81.
شکل 3-22- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا ……82
شکل 3-23- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا …83
شکل 3-24- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا ….85
شکل 3-25- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی
(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm………………………………………………………………………….86
شکل 3- 26- تاثیر شدت  هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی
(T = 30°C،(seed age =18 …………………………………………………………………………………………….86
شکل 3- 27- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی
(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =18 ………………………………………………………………….87
شکل 3-28- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا……88
عنوان                                                                                                         صفحه
شکل 3- 29- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا….89
شکل 3- 30- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا …90
شکل 3-31- برازش مدل سینتیکی مونود در فرایند تولید پلی هیدروکسی بوتیرات ……………………………..94
شکل 3- 32- برازش مدل مالتوس بر روی داده های آزمایشگاهی حاصل از فرایند تولید بیوپلیمر
توسط ……………………………………………………………………………………………………………..94C. necator
شکل 3-33 – تولید جرم سلولی وپلی هیدروکسی بوتیرات توسط C.necator در فرایند غیر پیوسته…….96
شکل 3-34 – اندازه گیری میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت بیوراکتور توسط روش دینامیک……97
شکل 3-35 –  فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک دهی ثابت گلوکز ونیتروژن…98
شکل 3-36 –  فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک متغیر  گلوکز ونیتروژن………100
شکل 3-37- طیف FT- IR از نمونه پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات تولید………………….105
شکل 3-38- طیف FT- IR از نمونه استاندارد تهیه شده پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات..106
شکل 3-39- طیف 1HNMR حاصل از کوپلیمر  پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات……….107
شکل 3-40- طیف 13CNMR حاصل از کوپلیمر  پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات……..108
شکل 3- 41-  تصویر SEM   از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات……………….109
شکل 3-42- تصویر SEM   از سطح فیلم  پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/
هیدروکسی اپتایت ……………………………………………………………………………………………………………..110
شکل 3-43- تصویر SEM   از سطح فیلم  پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/
هیدروکسی اپتایت تحت اواتراسونیک……………………………………………………………………………………111
 
 
عنوان                                                                                                         صفحه
شکل پ-1- منحنی كالیبراسیون وزن خشك سلولی باکتری C. necator………………………………………129
شكل پ-2- منحنی كالیبراسیون وزن خشك سلولی باکتری Hydrogenophaga pseudoflava….129
شكل پ-3- منحنی كالیبراسیون وزن خشك سلولی باکتری Azotobacter beijerinckii…………….130
شكل پ-4- منحنی كالیبراسیون وزن خشك سلولی باکتری Azohydromonas lata  …………………130
شكل پ-5- منحنی کالیبراسیون گلوکز……………………………………………………………………………………..131
شكل پ-6- منحنی کالیبراسیون فروکتوز……………………………………………………………………………………131
شكل پ- 7-  منحنی کالیبراسیون لاکتوز…………………………………………………………………………..132
شكل پ-8- منحنی کالیبراسیون 3- متیل­هیدروکسی­بوتیرات، 3-متیل­هیدروکسی­والرات و
3-متیل هیدروکسی­هگزانوات………………………………………………………………………………………………….132
شکل پ 9- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 200 ………………………………………………….133
شکل پ 10- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 400 ………………………………………………..134
شکل پ 11- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 600 ………………………………………………..135
شکل پ 12- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 800 ………………………………………………..136
شکل پ 13- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 1000 ………………………………………………137
شکل پ 14- طیف حاصل از FT-IR   بیوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات…………….138
شکل پ 15-  طیف C NMR    کوپلیمر( پلی 3- هیدروکسی بوتیرات/ 4- هیدروکسی بوتیرات)
به دست آمده از فرایند رشدC. necator  بر روی روغن نخل…………………………………………………….139
شکل پ 16-  طیف C NMR    بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشد

1. necator بر روی سوبستراهای کیک سویا و مخلوط کیک سویا  و ملاس………………………………140

شکل پ 17. طیفهایC NMR  وH NMR  کوپلیمرPHBV به دست آمده از مخمر نوترکیب……..140
شکل پ 18 . طیف H NMR    بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشد
E.coli  T.V.N. ………………………………………………………………………………………………………………141
شکل پ 19. طیف H NMR  کوپلیمر PHBV به دست آمده از Comamonas sp. EB172 …..141
فهرست جداول
عنوان                                                                                                         صفحه
جدول 1-1- برخی از باکتریهای مورد استفاده در تولید پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها……………………………..9
جدول 1-2- میکروارگانیسم­ها و منابع مورد استفاده در تولید کوپلیمر هیدروکسی­بوتیرات – والرات……..13
جدول1-3- مقایسه برخی از خواص فیزیکی پلیمرهای تولیدی……………………………………………………….19
جدول 1-4- برخی از میکروارگانیسم­های جداسازی شده جهت تجزیه  PHAs………………………………21
جدول1-5- تعدادی از متداول ترین مدل‌های رشد غیر ساختاری……………………………………………………30
جدول 1-6- شرکتهای تولید­کننده پلیمرهای زیست­تخریب­پذیر……………………………………………………..38
جدول 2-1- اجزای محیط کشت تولید (DSMZ, Medium 81)  ……………………………………………46
جدول 3- 1-   نتایج حاصل از فرایند بیولوژیکی  تولید بیوپلیمر  توسط میکروارگانیسم ها بر روی
منابع مختلف کربنی………………………………………………………………………………………………………………..91
جدول 3- 2- مدلهای سینتیکی به کار برده شده برای تولیدپلی هیدروکسی بوتیرات با بهره گرفتن از گلوکز..93
جدول 3-3- پارامترهای سینتیکی جهت تولید پلی هیدروکسی بوتیرات از منابع کربنی مختلف…………….95
جدول 3-4- حداکثر بازدهی تولید با بهره گرفتن از ترکیبات مختلف…………………………………………………..104
مقدمه
 استفاده از پلیمرها و پلاستیک ها در اغلب وسایل انسان از ریزترین آنها گرفته تا بزرگترین آنها انكار ناپذیر است. دلیل این استفاده وافر پلیمرها و پلاستیک ها در زندگی  انسان خواص بسیار زیاد آنها می باشد. مصرف سرانه پلاستیک در اروپا 60 كیلوگرم و در آمریكا 80 كیلوگرم در سال است [1]. علیرغم فواید فراوان پلیمرها و پلاستیک ها، استفاده از آنها باعث معضلات زیست محیطی فراوان شده است و همین امر باعث شده است كه بشر به فكر تولید پلیمرهای زیست تخریب پذیر و تخریب زیستی پلیمرها و پلاستیک ها بیافتد.
مکانیسمهای درونی و توانایی خود تنظیمی طبیعت نمی توانند این آلاینده ها را تجزیه کنند چون با این مواد نا آشنا هستند. این امر موجب شده است بسیاری از کشورها شروع به توسعه پلاستیک های قابل تجزیه زیستی کنند. بر اساس یک تخمین، بیش از 100 میلیون تن پلاستیک هر ساله تولید می شوند. 40% از این مقدار به محل های دفن زباله منتقل می شود و چند صد هزار تن هر ساله به محیط های دریایی ریخته می شوند و در مناطق اقیانوسی تجمع می یابند. سوزاندن پلاستیک ها  یکی از گزینه ها در دفع پلاستیک ها می باشد؛ اما علاوه بر پرهزینه بودن خطرناک نیز می باشد[1-2].
پلاستیک هایی که کاملا تجزیه پذیرند، نسبتاٌ جدید و نوید دهنده اند که به خاطر بهره گیری از باکتریها برای تشکیل بیوپلیمر می باشد که عمدتاٌ شامل پلی هیدروکسی آلکانویت ها[1]، پلی لاکتیک اسیدها[2]، پلی استرهای آلیفاتیک[3]، پلی ساکاریدها[4]،  و یا ترکیبی از این مواد می باشند[1].
 
 
 
1- انواع پلیمرهای زیست تخریب پذیر
پلیمرهای زیست تخریب پذیر زیادی شناسایی شده اند و یكی از مهمترین آنها پلی هیدروكسی آلكانوات ها می باشد. استفاده از این گروه پلیمرهای زیست تخریب پذیر در كشاورزی و صنایع دارویی و غیره بسیار مورد توجه قرار گرفته است كه دلیل آن سازگاری با محیط زیست و سامانه های حیاتی می باشد[2].
پلی هیدروكسی آلكانوات ها ،پلیمرهای زیست تخریب پذیر هستند و به صورت ذرات درون سلولی در میکروارگانیسم های مختلف تشکیل می شوند[3]. وزن مولکولی این پلیمرها در محدوده 105*2 تا  106*3 دالتون می باشد. وزن مولکولی بر حسب نوع میکروارگانیسم و شرایط رشد تغییر می کند[3].
یکی ازمهمترین پلی هیدروکسی آلکانوات ها، پلی هیدروكسی بوتیرات است. پلی هیدروكسی بوتیرات یک پلیمر خطی از 3-هیدروكسی بوتیرات است و در اندازه های مختلفی از ذرات در داخل سلول موجود است. پلی هیدروكسی بوتیرات به عنوان یک منبع ذخیره انرژی و كربن برای میكروارگانیزم می باشد و تحت شرایطی مثل محدودیت نیتروژن، فسفر، اكسیژن، یون ها و غیره در داخل سلول تجمع می یابد و با رفع این محدودیت ها پلی هیدروكسی بوتیرات تجزیه می شود. پلی هیدروكسی بوتیرات جامد به عنوان یک پلی استر ترموپلاستیک زیست تخریب پذیر مورد توجه قرار گرفته است زیرا خواص شبیه به خواص تعداد زیادی از پلاستیک های سنتزی معمولی دارد[4-6].
 
2- ویژگیهای پلی هیدروکسی آلکانوآتها
پلی هیدروكسی بوتیرات دارای خواص فیزیكی و شیمیایی شبیه به پلی اتیلن و پلی پروپیلن است و مانند پلاستیكهای معمولی در زمینه های متعددی قابل استفاده است. به عنوان مثال می توان آن را قالب ریزی كرد، توسط پركن های غیر آلی تقویت كرد، به صورت رشته هایی به هم تابید یا به شكل ورق درآورد و دارای خواص آب بندی عالی است[7].
طی دو دهه اخیر پلی‌هیدروكسی‌آلكانوات‌ها بطور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. آنها قابل تجزیه و سازگار با محیط‌زیست بوده و از منابع تجدید‌پذیر قابل استحصال می‌باشند. این خواص، آنها را بعنوان جایگزینی مناسب برای پلیمرهای مشتق‌شده از مواد نفتی معرفی می‌كند. بسیاری از گونه­ های میکروارگانیسم که جزو اعضای خانواده Halobactericeae می­باشند قادر به تولید پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها می­باشند. تاکنون بیش 300 گونه از این میکروارگانیسم­ها شناسایی گردیده و تعداد آن مرتبا در حال افزایش می­باشد[8]. باکتریها قادر به سنتز طیف وسیعی از ترکیبات پلی­هیدروکسی­آلکانوات هستند و تقریبا 150 ترکیب متفاوت از پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها تاکنون شناسایی شده است. پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها که از سلولهای باکتریها گرفته می­شوند دارای ویژگیهای مشابه با پلاستیکهای متداول نظیر پلی­پروپیلن می­باشند[9].. پلی‌هیدروكسی‌آلكانوات‌ها را برحسب نوع مونومر به دو دسته می‌توان تقسیم نمود. دسته اول پلیمرهایی با زنجیره كوتاه هستند كه دارای 3 تا 5 اتم كربن بوده و ترد و شكننده می‌باشند. دسته دوم، پلیمرهایی با زنجیره متوسط كه دارای 6 تا 14 اتم كربن بوده و دارای خاصیت الاستیكی می‌باشند[10].
پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها در فرایند بیولوژیکی هوازی و در محدوده دمایی C° 60 و رطوبت 55% به کمپوست تبدیل می­گردند. مطالعات نشان داده است که در فرایند دفن بهداشتی، 85 درصد پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها تجزیه می­گردد. پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها        از گستره وسیعی از مواد اولیه همچون منابع تجدید پذیر (ساکاروز، نشاسته، سلولز) و منابع فسیلی (متان، نفت خام، لیگنیت)، محصولات فرعی (ملاس، آب پنیر، گلیسرول)، اسیدهای آلی مثل (اسید استیک، اسید پروپیونیک و اسید بوتیریک) و دی اکسید کربن قابل استحصال می­باشند[11-12].
 
 
 
3- بیان مسئله
تنوع گسترده مونومرها در پلی­هیدروکسی­آلکانوات­ها طیف وسیعی از پلیمرها با خواص فیزیکی متفاوت ایجاد کرده است. پلی­هیدروکسی­بوتیرات حالت ترد و شکننده داشته و دارای کاربرد بسیار کمی می­باشد. پلی­هیدروکسی­آلکانوات­هایی که دارای زنجیره متوسط هستند خاصیت الاستیکی داشته و موادی سخت محسوب می­شوند که برای تولید لاستیک بسیار مناسب می­باشند. کوپلیمرهای پلی­هیدروکسی­آلکانوات شامل هیدروکسی­بوتیرات به همراه زنجیره­های بلندتر نظیر هیدروکسی­ والرات، هیدروکسی ­هگزانوات یا هیدروکسی ­اوکتانوات بوده و دارای انعطاف­پذیری بیشتری بوده و دوام بالاتری دارند. این ترکیبات قابلیت مصرف در طیف وسیعی از تولیدات نظیر بطری، خودتراش، پوششهای ضد آب و بسته­بندی مواد غذایی را دارا هستند[13].
در این تحقیق با استفاده  از منابع کربنی مختلف توانایی باکتریهای Cupriavidus necator DSMZ 545، Azotobacterbeijerinckii  DSMZ 1041  و  Azohydromonas lata DSMZ 1123   و درنهایت   Hydrogenophaga pseudoflava DSMZ 1034    در تولید بیوپلیمر هیدروکسی مورد بررسی قرار گرفته است. از جمله سوالاتی که سبب شروع این تحقیق گردید:

• میزان تولید بیوپلیمر توسط باکتریهای مذکور بر روی منابع ارزان چگونه است؟