فهرست مطالب

عنوان                 صفحه

خلاصه فارسی ‌ح
فصل اول کلیات

1-1 ………………. سینوزیت… 3

1-2 ………………. شیوع سینوزیت… 4

1-3 ………………. عوامل مستعد کننده سینوزیت… 4

1-4 ………………. منشأ سینوزیت… 5

1-4-1 ………….. سینوزیت با منشأ آلرژیک… 5

1-4-2 ………….. سینوزیت با منشأ ویروسی.. 6

1-4-3 ………….. سینوزیت با منشأ قارچی.. 6

1-4-4 ………….. سینوزیت با منشأ باکتریایی.. 6

1-5 ………………. انواع سینوزیت… 8

1-5-1 ………….. سینوزیت حاد. 8

1-5-1-1 ……… علائم بالینی سینوزیت حاد. 8

1-5-1-2 ……… تشخیص و درمان سینوزیت حاد. 8

1-5-2 ………….. سینوزیت مزمن.. 9

1-5-2-1 ……… علائم بالینی سینوزیت مزمن.. 9

1-5-2-2 ……… تشخیص و درمان سینوزیت مزمن.. 9

1-6 ………………. عوارض سینوزیت… 9

1-7 ………………. مشخصات باکتری های مورد آزمایش…. 10

1-7-1 ………….. مشخصات کلی استرپتوکوک ها 10

1-7-1-1 ……… استرپتوکوک پیوژن. 11

1-7-1-1-1 ….. بیماری زایی.. 12

1-7-1-1-2 ….. تست های تشخیصی.. 12

1-7-1-1-3 ….. درمان. 13

1-7-1-2 ……… استرپتوکوک پنومونیه. 13

1-7-1-2-1 ….. تست های تشخیصی.. 14

1-7-1-2-2 ….. بیماری زایی.. 15

1-7-1-2-3 ….. درمان. 15

1-7-2 ………….. مشخصات کلی استافیلوکوک ها 16

1-7-2-1 ……… استافیلوکوک اورئوس… 16

1-7-2-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 17

1-7-2-1-2 ….. بیماری زایی.. 18

1-7-2-1-3 ….. درمان. 18

1-7-3 ………….. مشخصات کلی پسودوموناس ها 19

1-7-3-1 ……… پسودوموناس آئروژینوزا 19

1-7-3-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 21

1-7-3-1-2 ….. بیماری زایی.. 21

1-7-3-1-3 ….. درمان. 21

1-8 ………………. تاریخچه درمانی گیاهان دارویی.. 22

1-8-1 ………….. ویژگی های خاص تولید گیاهان دارویی.. 23

1-8-2 ………….. شکل های مصرف گیاهان دارویی.. 23

1-9 ………………. ویژگی های گیاهان دارویی مورد آزمایش…. 23

1-9-1 ………….. گیاه درمنه. 23

1-9-1-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 24

1-9-1-2 ……… خواص درمانی.. 25

1-9-2 ………….. گیاه اسطو خودوس… 25

1-9-2-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 26

1-9-2-2 ……… خواص درمانی.. 26

1-9-3 ………….. گیاه دارچین.. 26

1-9-3-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 28

1-9-3-2 ……… خواص درمانی.. 29

1-9-4 ………….. گیاه مورد یا مورت… 29

1-9-4-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 31

1-9-4-2 ……… خواص درمانی.. 32

1-10 ……………. اسانس های گیاهی.. 32

1-11 ……………. نانواسانس های گیاهی.. 33

1-11-1 ………… کیتوزان. 33

1-12 ……………. بررسی اثرات ضد میکروبی.. 35

1-13 ……………. تعیین MIC به روش میکرودایلوشن (ریز رقت) 35

1-13-1 ………… متغیر های مؤثر در انجام آزمون MIC.. 36

1-13-2 ………… تعیین MBC.. 36

1-13-3 ………… دیسک دیفیوژن. 36

1-13-3-1 ……. دینامیک تشکیل هاله. 37

1-13-3-2 ……. دیسک های آنتی بیوتیک… 37

1-13-4 ………… انتشار در آگار (چاهک) 37

1-14 ……………. روش های تهیه سوسپانسیون. 38

 

1-15 ……………. بیان مسئله. 38

1-16 ……………. ضرورت اهمیت موضوع. 39

1-17 ……………. اهداف تحقیق.. 40

1-17-1 ………… هدف کلی.. 40

1-17-2 ………… هدف اختصاصی.. 40

1-18 ……………. فرضیات تحقیق.. 40

1-19 ……………. سوالات تحقیق.. 40

2-1 ………………. سوابق تحقیق در ایران و سایر کشور ها در زمینه استفاده از اسانس ها و نانواسانس های گیاهی   43

3-1 ………………. دستگاه های مورد نیاز. 48

3-2 ………………. مواد و وسایل مورد نیاز. 48

3-2-1 ………….. سوش های میکروبی مورد مطالعه. 50

3-2-2 ………….. اسانس های مورد مطالعه. 50

3-3 ………………. روش کار. 51

3-3-1 ………….. روش تهیه نانواسانس های درمنه، اسطوخودوس، مورد و دارچین.. 51

3-3-1-1 ……… تهیه محلول کیتوزان. 51

3-3-2 ………….. روش تهیه محیط کشت اولیه برای رشد. 53

3-3-2-1 ……… محیط BHI 53

3-3-2-2 ……… محیط MHA.. 53

3-3-2-3 ……… محیط BA.. 53

3-3-3 ………….. فعال کردن باکتری ها و انتقال آن ها به محیط کشت… 54

3-3-4 ………….. روش تهیه محلول سوسپانسیون میکروبی.. 54

3-3-5 ………….. روش ساخت کدورت های استاندارد مک فارلند. 54

3-3-6 ………….. تعیین MIC با روش میکرودایلوشن.. 55

3-3-6-1 ……… روش علمی تعیین MIC.. 55

3-3-7 ………….. تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری یا MBC.. 57

3-3-8 ………….. روش انتشار در آگار (دیسک کاغذی) 57

3-3-8-1 ……… دیسک های آنتی بیوتیک مورد آزمایش (شاهد مثبت) 58

3-3-9 ………….. روش انتشار در آگار (چاهک) 58

4-1 ………………. شرح مختصری از مطالعه. 61

4-2 ………………. نتایج FTIR ترکیبات نانواسانس ها 61

4-3 ………………. نتایج حاصل از پراکندگی نور دینامیکی برای مطالعه اندازه نانوذرات… 63

4-4 ………………. نتایج microscope Scanning electron مربوط به اسانس های نانوکپسول شده 64

4-5 ………………. نتایج microscope Transmission electronمربوط به اسانس های نانو کپسول شده 65

4-6 ………………. نتایج آزمون تعیین حساسیت… 66

4-6-1-1 ……… نتایج MIC نانواسانس ها 68

4-6-1-2 ……… نتایج MIC اسانس ها 68

4-6-1-3 ……… نتایج MBC اسانس ها و نانواسانس ها 69

4-6-2 ………….. نتایج اثرات ضد میکروبی نانواسانس ها به روش انتشار دیسک و مقایسه با چند آنتی بیوتیک رایج   75

4-6-3 ………….. نتایج آزمایش انتشار در آگار(چاهک) 78

5-1 ………………. بحث.. 83

5-2 ………………. نتیجه گیری.. 89

5-3 ………………. پیشنهادات.. 89

. .. 90

چکیده لاتین..95

فهرست جداول

جدول 3-1       روش تهیه استاندارد لوله های مک فارلند. 55

جدول 4-1       نتایج آزمایش MIC و MBC نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد. 67

جدول 4-2       نتایج آزمایش MIC و MBC اسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین بر حسب میکروگرم
بر میلی لیتر μg⁄ml 68

جدول 4-3       قطر هاله عدم رشد سویه های میکروبی مورد آزمایش در برابر تعدادی از دیسک های آنتی بیوتیکی متداول در آزمایش دیسک دیفیوژن 77

فهرست نمودارها

نمودار 4-1       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-2       نمودار حداقل غلظت کشندگی ( MBC ) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-3       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-4       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-5       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-6       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-7       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

نمودار 4-8       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

فهرست شکل ها

شکل 1-1         سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت… 3

شکل 1-2         استرپتوکوک پیوژن رشد یافته در کشت خون. 11

شکل 1-3         رنگ آمیزی گرم از خلط که در آن استرپتوکوک پنومونیه. 13

شکل 1-4         رنگ آمیزی گرم استافیلوکوک اورئوس… 17

شکل 1-5         رنگ آمیزی گرم پسودوموناس آئروژینوزا 20

شکل 1-6         گیاه درمنه. 24

شکل 1-7         گیاه اسطوخودوس… 25

شکل 1-8         گیاه دارچین.. 28

شکل 1-9         چوب و پودر دارچین.. 28

شکل 1-10       گیاه مورد. 31

شکل 1-11       ساختار شیمیایی پلیمر کیتوزان. 34

شکل 1-12       ساختار مولکولی کیتین.. 35

شکل 3-1         اسانس های تهیه شده از شرکت باریج اسانس کاشان. 51

شکل 3-2         دستگاه اولترا سونی کیت در مرکز ژنتیک… 52

شکل 4-1         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب بیوپلی ساکاریدی کیتوزان. 62

شکل 4-2         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب اسید میرستیک… 62

شکل 4-3         نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز دو ترکیب کیتوزان و اسید میرستیک در کنار هم. 63

شکل 4-4         توزیع اندازه نانوذرات ترکیبات اسانس نانوکپسول شده با بهره گرفتن از دستگاه DLS. 64

شکل 4-5         تصویر ساختار نانوکپسول های کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-6         تصویر ساختار نانوکپسول کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-7         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 66

شکل 4-8         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 67

شکل 4-9         پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس اسطوخودوس بر روی استرپتوکوک پیوژن بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-10       پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس دارچین بر روی استرپتوکوک پنومونیه بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-11       پلیت های کشت شده مربوط به تأثیر اسانس اسطوخودوس بر روی استافیلوکوک اورئوس بر روی محیط آگار برای تعیین MBC.. 70

شکل 4-12       پلیت های کشت داده شده مربوط به تأثیر اسانس مورد بر روی پسودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط آگار برای تعیین MBC، رقت شماره 3 رقت MIC.. 70

شکل 4-13       پلیت های تلقیح شده با باکتری پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های کاغذی آغشته به غلظت های مختلف نانواسانس اسطوخودوس… 76

شکل 4-14       پلیت های تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های کاغذی آغشته با غلظت های مختلف نانواسانس دارچین.. 76

شکل 4-15       پلیت تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 77

شکل 4-16       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-17       پلیت تلقیح شده با باکتری استرپتوکوک پیوژن حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-18       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   79

شکل 4-19       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   80

شکل 4-20       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا با غلظت های مختلفی از نانواسانس درمنه. 80

شکل 4-21       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس با غلظت های مختلفی از نانواسانس مورد. 80

خلاصه فارسی

سینوزیت یکی از شایع ترین موارد در بین مراجعان به پزشک عمومی است که احتیاج به تجویز آنتی بیوتیک دارد. از جمله باکتری های شایع در ایجاد این بیماری می توان به استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا اشاره کرد. امروزه با توجه به اثرات مضر داروهای شیمیایی بر بدن انسان، استفاده از روش های نوین فرمولاسیون مانند نانوکپسول کردن اسانس های گیاهی به دلیل کارایی بیشتر و همچنین کاهش عوارض سوء ناشی از کاربرد مستقیم آن ها مورد توجه قرار گرفته است. در این مطالعه که به روش in vitro می باشد، اثر ضدمیکروبی چهار نوع نانواسانس گیاهی بر روی میکروارگانیسم های استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا که از عوامل مهم سینوزیت می باشد در مقایسه با اسانس های طبیعی آن ها بررسی گردید، ابتدا تست کمی حداقل غلظت مهار کننده رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) و سپس تست کیفی (دیسک دیفیوژن) انجام گرفت. نتایج تست کمی MIC از نانواسانس های مورد بررسی در مورد استرپتوکوک پنومونیه با نانواسانس اسطوخودوس 097/0، استرپتوکوک پیوژن با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  097/0، استافیلوکوک اورئوس با نانواسانس درمنه  562/1 و در پسودوموناس آئروژینوزا با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  125/3 بدست آمد و نتایج بدست آمده در مقایسه با اسانس های طبیعی، تأثیر کمتر نانواسانس ها را نشان داد. و در تست دیسک دیفیوژن معلوم شد که نانواسانس ها قدرت رهایش از دیسک های کاغذی و انتشار در محیط جامد را ندارد.

نتایج، بیانگر اثرات خوب نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین بر روی چهار میکروارگانیسم های عامل سینوزیت می باشد و می توانیم به ساخت داروهای مناسب برای از بین بردن این میکروارگانیسم ها با منشأ گیاهی و با عوارض بسیار کمتر دارویی امیدوار باشیم.

واژه های کلیدی: نانواسانس، اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین، MIC، MBC

فصل اول

 

کلیات

 

1-1 سینوزیت

فهرست مطالب

عنوان                صفحه

. 1

.. 1

1-1 تعریف زخم و انواع آن. 2

۱-۲ سوختگی.. 2

۱-۳ زخم بستر. 2

۱-۴ ترمیم زخم. 3

۱-۵ التهاب.. 4

۱-۶ شکل‌گیری بافت.. 5

۱-۷ بلوغ و بازسازی بافت.. 6

۱-۸ روش‌های درمانی برای تسریع و بهبود فرایند ترمیم زخم. 6

۱-۹ پلاکت و نقش آن درروند ترمیمی زخم. 7

۱-۱۰ ساختمان و عملکرد پلاکت‌ها 8

۱-۱۱ مزایای استفاده از خون‌بند ناف.. 11

۱-۱۲ مزیت فرآورده‌های پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف نسبت به خون محیطی.. 12

۱-۱۳ انواع محصولات مشتق از پلاکت.. 12

۱-۱۴ پلاسمای غنی از پلاکت.. 12

۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13

۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14

۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14

۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

 

۲-۸ جمع‌ آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد‌ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68

شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف:

مواد مفید زیستی  مشتق از پلاکت ها نقش محوری در بهبود زخم ایفا می کنند. برای بررسی مکانیسم های سلولی ومولکولی بهبود زخم اثر عصاره پلاکت خون مشتق از خون بند ناف(UCB-PL)  بر فیبروبلاست ها، به عنوان سلول های قوی در بهبود زخم مورد مطالعه قرار گرفت. لذا به دلیل اینکه (UCB-PL)  دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها:

عصاره پلاکتی مشتق از پلاسمای خون بند ناف را تهیه، و سپس فیبروبلاست ها توسط غلظت های مختلف (UCB-PL)   تحت تیمار قرار گرفتند. زنده ماندن سلولها، میزان گسترش و بهبود زخم با بهره گرفتن از  روش  manualمورد بررسی قرار گرفت. سپس مشخصات بیان ژن با بهره گرفتن از روش  real-time PCR انجام شد. در نهایت وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2 / 3، smad2 / 3  از مسیر سیگنالینگ مورد استفاده قرار گرفت.

یافته ها:

نتایج نشان می دهد که افزایش  تکثیر سلولی در غلظت 10٪ (UCB-PL)   بدون اثر بر زنده ماندن سلولها می باشد.در همان غلظت(UCB-PL)  افزایش قابل توجهی از میزان بسته شدن زخم در 6-12 و 24 ساعت پس از تیمار دیده شد. همچنین تغییر نسبت بیان ژن در ژن Smad3 و Smad2 در غلظت10٪ از UCB- PL مقایسه با کنترل مثبت و منفی افزایش قابل توجهی داشت. روش وسترن بلات نشان داد که UCB- PL  اثر قابل توجهی بر سطوح پروتئین های Smad2، Smad3،Psmad2وPsamd3دارد.

نتایج:
UCB- PL باعث تحریک رشد و مهاجرت فیبروبلاست می شودکه موجب بهبود زخم از طریق فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ های مختلف از جمله، SMAD 2/3 مسیر سیگنالینگ می گردد.

واژه‌های کلیدی: ترمیم زخم، عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف، فیبروبلاست، مسیر سیگنالینگ smad

مقدمه

فرآورده عصاره پلاکتی[1] PL مشتق از خون‌بند ناف محصولی هست که از فرآورده پلاسمای غنی از پلاکتی PRP به دست می‌آید.. این ماده به علت غنی بودن از مواد مفید زیستی در ترمیم زخم‌ مورداستفاده قرار می‌گیرد. به دلیل اینکه PL دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

 

سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM حاوی غلظت‌های ۵%، ۸%، ۱۰%، ۱۵% و ۲۰% از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوی FBS 10% و کنترل منفی که خالی از هر ۲ (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنین از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوی از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعیین مقدار مناسب و مؤثر بر تکثیر و درصد بقاء سلولی توسط شمارش سلولی با تریپان‌بلو در زمان‌های متفاوت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بررسی شد. هم‌چنین برای تعیین مقدار مناسب برای مهاجرت سلولی از تکنیک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتی با غلظت‌های متفاوت بر بیان ژن‌های smad2-smad3 در سلول‌های فیبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسی قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسی اثر عصارهی پلاکتی بر مسیر سیگنالینگ Smad، مقدار بیان پروتئین‌های  Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنیک

عنوان                                               فهرست مطالب                                            صفحه

چکیده فارسی………………………………………………………………………………………………………………………..     1

مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………          2

فصل اول: کلیات                                                                               

• هدف……………………………………………………………………………………………………………………………. 6
• بیوتکنولوژی میکروبی……………………………………………………………………………………………………… 7

1-2-1) روش‌های سنتی…………………………………………………………………………………………………………. 7

1-2-2)میکروبیولوژی صنعتی………………………………………………………………………………………………….. 8

1-2-3)بیوتکنولوژی میکروبی نوین……………………………………………………………………………………………9

1-3)جنبه‌های اقتصادی بیوتکنولوژی میکروبی………………………………………………………………………….. 10

1-4)مقدمه ای بر فرایندهای تخمیری………………………………………………………………………………………. 11

1-5)بیوتکنولوژی صنعتی ……………………………………………………………………………………………………… 16

1-6)نقش مهندسی متابولیک در توسعه سویه‌های صنعتی…………………………………………………………… 18

1-7) متابولیت‌های میکروبی …………………………………………………………………………………………………. 21

1-8)تعریف و تاریخچه آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………….  24

1-9)گروه های میکروبی تولید آنتی بیوتیکها……………………………………………………………………………. 25

1-9-1)اکتینومایستها…………………………………………………………………………………………………………….. 26

1-9-1-1) باکتری Saccharopolyspora erythraea  ……………………………………………………………. 30

1-10)تقسیم‌بندی آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………………………………………………………………………. 31

1-10-1) طبقه‌بندی بر مبنای شباهت عمومی ساختار شیمیایی…………………………………………………… 31

1-10-1-1)ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………… 33

1-10-2) طبقه‌بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………. 35

1-10-3)آنتی‌بیوتیک‌های بازدارنده سنتز پروتئین………………………………………………………………………..35

1-11)عوامل تعیین‌کننده حساسیت و مقاومت میکروارگانیسم ها به آنتی‌بیوتیک‌ها………………………… 36

1-12)انتخاب آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………………. 37

1-13)موارد کاربرد آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………. 38

1-14)اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-1)تاریخچه و منبع………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-2)ساختمان و ویژگی‌های اریترومایسین…………………………………………………………………………. 40

1-14-3)آنتی‌بیوتیک‌های مشتق‌شده از اریترومایسین…………………………………………………………………. 42

1-14-4)فعالیت ضد‌باکتریایی اریترومایسین…………………………………………………………………………….. 43

1-14-5)مکانیسم عمل اریترومایسین……………………………………………………………………………………… 44

1-14-6)کاربردهای اریترومایسین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 45

1-14-7)موارد منع مصرف اریترومایسین………………………………………………………………………………… 48

1-14-8)عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………. 48

1-14-9) انواع در دسترس……………………………………………………………………………………………………. 49

1-15)میکروارگانیسم های صنعتی………………………………………………………………………………………….. 49

1-16)جداسازی و نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………. 50

1-17)جداسازی میکروارگانیسم‌های مناسب از محیط……………………………………………………………….. 51

1-18)کلکسیون‌های کشت…………………………………………………………………………………………………….. 52

1-19)نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1)نگهداری در دمای پایین…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1-1) نگهداری روی محیط‌کشت شیب‌دار حاوی آگار…………………………………………………….. 53

1-19-1-2)نگهداری با بهره گرفتن از روش ژرف انجمادی……………………………………………………………. 54

1-19-1-3)نگهداری در نیتروژن مایع…………………………………………………………………………………….. 55

1-19-2)نگهداری در حالت بدون آب……………………………………………………………………………………. 55

1-19-2-1)نگهداری در خاک……………………………………………………………………………………………….. 56

1-19-2-2)نگهداری در سیلیکاژل…………………………………………………………………………………………. 56

1-19-2-3)نگهداری در سلولز……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-4)نگهداری در آب مقطر…………………………………………………………………………………………. 57

1-19-2-5)نگهداری در روغن……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-6) لیوفیلیزه کردن…………………………………………………………………………………………………… 58

1-20) محیط کشت تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………………. 59

1-21) نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها………………………………………………………………………………….. 61

1-21-1) کربن……………………………………………………………………………………………………………………. 62

1-21-1-1) عوامل موثر بر انتخاب منبع کربن…………………………………………………………………………. 62

1-21-2) نیتروژن   ……………………………………………………………………………………………………………. 63

1-21-3) هیدروژن و اکسیژن………………………………………………………………………………………………… 65

1-21-4) مواد معدنی…………………………………………………………………………………………………………… 65

1-22) تنظیم‌کننده‌های متابولیکی…………………………………………………………………………………………… .66

1-23) ضد کف‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 66

1-24) طراحی و فرمول‌بندی محیط کشت………………………………………………………………………………. 67

1-25) فرایند تخمیر تولید آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………………………………….68

1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………68

1-25-2) بخش‌های اصلی فرایند تخمیری……………………………………………………………………………… 68

1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن…………………………………………………………………………… 74

1-25-4) مرحله بذر (Seeding )………………………………………………………………………………………….. 77

1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)…………………………………………………………………………………….. 79

1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار…………………………………………………………………………………………. 83

1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………… 84

1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما………………………………………………………………………………….. 86

1-25-8) تاثیر pH روی متابولیسم سلول………………………………………………………………………………….87

1-25-9) مرحله شناسایی و استخراج محصول………………………………………………………………………… 89

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………… 91

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 97

3-2) معرف‌های رنگی مورد استفاده ……………………………………………………………………………………… 97

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین……………………………………………………………………. 97

3-3-1) تهیه بافر pH 9.6…………………………………………………………………………………………………….. 97

3-3-2) تهیه بافر pH 4.2…………………………………………………………………………………………………….. 98

 

3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9.6 و بافر  pH 9.6اشباع از کلرفرم…………………………………. 98

3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو…………………………………………………………………………………………… 99

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون……………………………………………………………………………………… 100

3-4-1) محیط اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………….. 100

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………. 103

3-4-2) آزمایش ها با محیط‌کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین……………………………………………..103

3-4-2-1) مرحله بذر‌دهی (Seeding)………………………………………………………………………………….. 103

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن‌ها…………………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )……………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-3)بررسی محیط‌های کشت از لحاظ آلودگی ( Contamination test )……………………… 106

3-4-2-2) مرحله تخمیر……………………………………………………………………………………………………….108

3-5) میزان اوره اضافه شده به محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………109

3-5-1) اوره………………………………………………………………………………………………………………………..109

3-6) تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها …………………………………………………………………………….113

3-7) روش تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….113

3-8) روش سنجش غلظت اریترومایسین در نمونه های تخمیری………………………………………………..114

3-8-1) روش HPLC……………………………………………………………………………………………………………114

3-8-1-1) مقدمه ای بر کروماتوگرافی…………………………………………………………………………………….114

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک…………………………………………………………………………………………118

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام……………………………………………………………………….119

3-8-1-4) کاربردهای کیفی…………………………………………………………………………………………………..120

3-8-1-5) آنالیز کمی……………………………………………………………………………………………………………120

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی(External Standard)……………………………………………………..120

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition)………………………………………………….. 121

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی(Internal Standard)…………………………………………………………………121

3-8-1-6) نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………….122

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )…………………………………………………………..122

3-8-2-1) سیر تحولی و رشد……………………………………………………………………………………………….122

3-8-2-2) کوماتوگرافی لایه نازک (TLC )…………………………………………………………………………….123

3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک……………………………………………………………………………..125

33-8-3) روش Spectrophotometric……………………………………………………………………………………126

3-8-3-1) با اسپکتروفوومتر آشنا شویم…………………………………………………………………………………..127

3-8-3-2) قانون بیر- لامبرت………………………………………………………………………………………………..128

3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر……………………………………………………………………………………..128

3-8-4) روش Bioassay………………………………………………………………………………………………………129

3-8-4-1) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………….131

3-8-4-2) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………131

3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………132

3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث………………………………………………………………………….132

3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح…………………………………………………………………………………………………….133

3-8-4-4) ایجاد چاهک……………………………………………………………………………………………………….134

3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH……………………………………………………………………………………134

3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….134

3-8-4-7) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………..135

3-8-4-8) اندازه گیری قطر هاله مهار شده……………………………………………………………………………..135

3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده های گمراه کننده……………………………………………………………….136

3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………………136

3-8-5) استخراج اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..137

3-8-5-1)تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………….137

3-8-5-2) تهیه رقت های مایع تخمیر……………………………………………………………………………………139

3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر……………………………………………………………………..139

3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل‌بلو…………………………………………………..140

3-8-5-5) اندازه‌گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل‌بلو……………………………140

فصل چهارم: نتایج

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم‌درلیتر آرد‌سویا برروی پارامترهای مورد‌نظر در طی تخمیر……………..142

4-1-1 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا برروی pH محیط کشت تخمیر……………………….143

4-1-2 ) بررسی اثرغلظت30 گرم‌درلیترآردسویا برروی درصد وزن‌تر‌بیومس درمحیط تخمیر………….143

4-1-3 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا در میزان تولید اریترومایسین……………………………144

4-1-4)بررسی‌اثرغلظت30گرم‌درلیترآردسویابرروی‌مورفولوژی‌باکتری erythraea .S……………………..145

4-2)سنجش‌ومقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی درتمام غلظت‌ها درطی‌فرایند تخمیر……………148

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت‌های مختلف………………………………………………………………148

4-2-2 )سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت‌های مختلف……………………….149

4-2-3 )سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت‌های مختلف ………………………….150

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………151

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین…………….151

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین………………………….. 151

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت ………………………………152

4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس…………………………153

4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری…………………………….153

فصل پنجم: بحث و پیشنهادها

تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک ها…………………………………….158

5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین………………159

5-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین…160

5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر…………………………………………162

5-3) رابطه بین رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea و میزان تولید اریترومایسین………..163

5-4) رابطه بین میزان رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea وتغییرات بیومس درطی فرایند تخمیر………………………………………………………………………………………………………………………………….165

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….165

5-5)رابطه بین مورفولوژی سویه Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین…………….169

5-6) برآورد هزینه‌ها…………………………………………………………………………………………………………….171

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی سویا دریک bach صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………….172

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا در محیط تخمیر…………………………………………….172

5-6-1-2) استفاده از غلظت بهینه 40% اوره در محیط تخمیر…………………………………………………….173

5-7) پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………….175

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………………..177

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………. 184

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………..185

عنوان                                           فهرست جداول                                             صفحه

جدول (1-1): راهنمای دوزاژ ماکرولیدهای خوراکی…………………………………………………………………..33

جدول (1-2): ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………………..40

جدول(1-3): نقش فیزیولوژیکی عناصر غذایی پرمقدار درون سلول و میزان متوسط مورد نیاز………….61

جدول(1-4 ): مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه……………………………65

جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک…………………………………………………….72

جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروه های باکتریایی………………………………………………………….85

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………….101

جدول(3 -2):  ترکیبات محلول میکروالمنت …………………………………………………………………………..101

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ………………………………………………………………………….104

جدول (3-4): محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………………………..108

جدول(3-5): خصوصیات اوره……………………………………………………………………………………………….111

جدول(3-6): آنالیز اوره…………………………………………………………………………………………………………112

جدول(3-7): غلظت‌های اریترومایسین در حجم‌های استاندارد اریترومایسین و حجم‌های مورد نیاز برای

تهیه آن‌ ها……………………………………………………………………………………………………………………………..139

جدول ( 4-1 ) : غلظت‌های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت‌های مختلف………………………148

عنوان                                            فهرست نمودارها                                         صفحه

نمودار ( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….144

نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت‌های مختلف……………………..149

نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر………………149

نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر…………………150

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر………………………151

نمودار(4-8): تغییرات  pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر…………………………………………..152

نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره………………………………153

عنوان                                              فهرست اشکال                                       صفحه

شکل (3-1): روش تهیه کلروفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم………………………………………….99

شکل (3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون………………………………………………………….102

شکل (3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون………………………………………………………102

شکل (3-4): فرمول شیمیایی و عکسی از اوره………………………………………………………………………….110

شکل (3-5): روش تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………….113

شکل ( 3-6): نمونه ای از سرسمپلر فیلتردار…………………………………………………………………………….113

شکل (3-7): نمایی از دستگاه HPLC……………………………………………………………………………………..119

شکل (3-8): نمونه ای از یک کروماتوگرام………………………………………………………………………………119

شکل (3-9): نمایی از روش TLC………………………………………………………………………………………….125

شکل (4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر………………………………………………………..145

شکل (4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر………………………………………………………….146

شکل (4-3): مورفولوژی میسلیوم ها در روز هشتم تخمیر…………………………………………………………146

شکل (4-4): مورفولوژی میسلیوم ها در روز دهم تخمیر……………………………………………………………147

شکل (4-5): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر……………………………………………………….147

شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر در

غلظت 40% اوره……………………………………………………………………………………………………………………154

شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………..154

شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر در

غلظت 40% اوره………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………155

شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………156

 

چکیده فارسی

صنعت بیوتکنولوژی دارویی یعنی بکارگیری میکروارگانیسم‌های مولد با هدف تولید یک محصول بیوسنتزیک مورد مصرف در درمان و دارو. میکروارگانیسم‌ها قادرند بسیاری از مواد و ترکیبات مهم صنعتی را که بسادگی از منابع دیگر قابل تهیه نیستند تولید کنند. از جمله ترکیبات تولید شده توسط میکروارگانیسم ها، متابولیت‌های ثانویه نظیر آنتی بیوتیک ها هستند. اریترومایسین یک آنتی‌بیوتیک ماکرولیدی است و اهمیت آن در این است که می‌تواند جایگزین پنی‌سیلین ها و تتراساکلین ها در بیمارانی باشد که به این داروها حساسیت مفرط دارند. بدست آوردن حداکثر میزان تولید اریترومایسین مستلزم وجود یک محیط کشت کاملاً متوازن است. تاکنون فنون زیادی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه بکار رفته است، از جمله تغییر ترکیبات موجود در محیط کشت با منابع ارزانتر.تاکنون در مورداثر استفاده از منبع اوره بر روی رشد  erythraea   Saccharopolysporaو تولید اریترومایسین گزارشی نشده است.

در این پژوهش، از باکتری Saccharopolyspora erythraea استفاده شده و منبع نیتروژنی اوره در غلظت‌های مختلف بجای منبع شناخته شده آرد سویا مورد استفاده قرار گرفته است. نمونه‌های حاوی سوسپانسیون اسپوری در محیط بذردهی به مدت 2روز در شیکر انکوباتور با دور rpm200 و دمای C ْ30 قرار گرفته و پس از انتخاب بهترین نمونه و تلقیح به محیط تخمیر، به مدت 12روز در شیکر انکوباتور با دور rpm220و دمای C33ْ گرماگذاری شدند. در روزهای مشخص pH ، درصد وزن تر بیومس و مورفولوژی اندازه گیری ومیزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری و میکروبیولوژیک سنجیده شد.

درنمونه حاوی 40% اوره و 60 % سویا ، بیشترین مقدار تولید اریترومایسین مشاهده شد .

نتایج نشان میدهد که استفاده از اوره منجر به کاهش هزینه‌های تولید می شود که مربوط به پایین تر بودن قیمت اوره نسبت به سویا است و در نتیجه باعث صرفه‌جویی اقتصادی می‌شود.

کلمات کلیدی: اوره ، اریترومایسین ، erythraea   Saccharopolyspora، تخمیر

مقدمه

دنیایی که ما در آن زندگی می‌کنیم، از میلیون ها سال نوری در عمق فضا گرفته تا هزاران کیلومتر در اعماق زمین از دشت‌ها و جنگلها و کوهستانها گرفته تا دریاها و اقیانوس‌های بیکران، همه و همه دارای اسرار ناشناخته و رموز کشف نشده ای هستند که در ذهن بشر چراها و چگونه‌هایی را پدید می‌آورد و پاسخ به این سؤالات یک نیاز اساسی برای هر فرد محسوب می‌شود. بشر از همان ابتدا درصدد پاسخ به این نیاز خود برآمده است و گام‌هایی را در زمینه‌های مختلف علم برداشته است. از زمان انسان اولیه تا انسان غرق در زندگی ماشینی قرن بیست و یکم این اکتشافات به طرق مختلف ثبت شده‌اند تا همگان از آنها بهره ببرند. ما نیز با بهره‌گیری از این نتایج و تحقیقات به ثبت رسیده و تلاش خود این تحقیق را گردآوری نموده ایم تا گامی هر چند کوچک در راه بی پایان علم در زمینه میکروارگانیسم‌ها برداشته باشیم. میکروارگانیسم‌ها، قدیمی‌ترین موجودات زنده روی زمین هستند ولی چون اندازه آنها بسیار کوچک است از آخرین موجوداتی هستند که شناخته شده‌اند. این موجودات اهمیت ویژه‌ای برای انسان دارند. بعد از شناخته شدن میکروارگانیسم‌ها پیشرفت قابل‌توجهی درامر بهداشت حاصل گردیده است از جمله تولید آنتی‌بیوتیکها، چرا که دانشمندان با مطالعه میکروارگانیسم‌های مفید و مضر(80% مفید و 20% پاتوژن یا بیماری زا) و با بهره گرفتن از علم میکروبیولوژی که همان علم مطالعه و شناخته میکروارگانیسم‌هاست طول عمر آدمی را افزایش داده‌اند و دیگر از اپیدمی‌های کشنده نظیر آبله، طاعون، سرخک، دیفتری و … همانند گذشته خبری نیست.

گستردگی‌و تنوع‌ کاربردهای‌ بیوتکنولوژی‌، تعریف‌ و توصیف‌ آنرا کمی‌ مشکل‌ و نیز متنوع ‌ساخته‌ است‌. برخی‌ آنرا مترادف‌ میکروبیولوژی‌ صنعتی‌ و استفاده‌ از میکروارگانیسم‌ها و برخی‌ آنرا معادل‌ مهندسی‌ ژنتیک‌ تعریف‌ می‌کنند. در صنعت نیز آدمی با بهره گرفتن از علم بیوتکنولوژی و نقش ارگانیسم‌ها به عنوان کاتالیست از میکروارگانیسم‌ها استفاده کرده است. در واقع میکروبیولوژی صنعتی، واژه‌ای قدیمی است که در مورد استفاده میکروارگانیسم‌ها در صنعت بیان شده است و امروزه آن را به تکنولوژی میکروبی [1]تغییر داده‌اند.

امروزه با مطالعات فراوانی که دانشمندان در عرصه‌های مختلف انجام داد‌ه‎اند، می‌توان بی‌اغراق ادعا کرد که استفاده از میکروارگانیسم‎ها انقلاب عظیمی در همه ابعاد زندگی انسان به وجود آورده‌است. بشر با شناخت میکروارگانیسم‌ها از گذشته تا کنون هم توانسته فعالیت های نامناسب آنها را بر زندگی انسان کنترل کند در واقع از آنها بر علیه خودشان استفاده کند و هم از آنها در زمینه‎های گوناگون بهره ببرد.

در حال حاضر شاهد کاربرد میکروارگانیسم‌ها در تولید انواع محصولات دارویی از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها هستیم. از دیگر مواد حاصل از متابولیت آنها برای مصارف پزشکی و افزودنی‌های غذایی نظیر الکل‌ها، ویتامین‌ها، آنزیم‌ها و بهره می‌بریم. همچنین در صنعت شاهد نقش موثر این موجودات ریز در زمینه‌های مختلف هستیم.

به طور کلی می‌توانیم بگوییم که فواید این موجودات ریز بیش‌تر از مضرات آن‌ ها است و به همین سبب این موجودات نقش بسیار مهمی در صنعت برای تولید صنایع گوناگون، در تهیه‎ی مواد‌غذایی مثل ماست، پنیرهای قارچی و خیارشور و ، در تولید فرآورده‌های دارویی از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها را ایفا می‌کنند. در واقع تولید فرآورده‌های دارویی مهم‌ترین فایده‌ی آن‌ ها است زیرا با این کار در واقع جان بسیاری از انسان‌ها را در عصرهای گوناگون نجات می‌دهند و این

                                                    فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1	فصل اول: کلیات ..
2	1-1 گیاه­شناسی کلزا ……
2	1-1-1 ارقام کلزا
4	1-1-2 کلزا و اهمیت اقتصادی آن …
5	1-2 تنش خشکی ..
8	1-2-1 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان زراعی .
11	1-2-2 اثر تنش خشکی بر روی کلزا …
12	1-2-3- ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر رشد و فتوسنتز
14	1-2-4 اثر تنش خشکی روی آنزیم­ های آنتی­اکسیدانت و مالون­دی­آلدهید
18	1-2-5 ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز .
19	1-2-6 ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار
21	1-3 کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان .
21	1-3-1 اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان .
23	1-3-2 مسیرهای ژن­های کنترل کننده تنش­های غیر­زنده
24	1-4 ژن­های مورد مطالعه ..
24	1-4-1 پروتئین‌کینازها
26	1-4-2 خانواده ژنیMAPK   ..
28	1-4-3 ژن حساس به اکسین .
33	فصل دوم: مواد و روش­ها
34	2-1 شرایط رشد .
34	2-1-1 نحوه تیمار­دهی گیاهان
35	2-1-2  برداشت نمونه
35	2-1-2-1 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی ..
35	2-1-2-2 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک
36	2-2 روش های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی ..
36	2-2-1 پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA ………………………………………………………….
36	2-2-2 استخراج RNA از بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………………
36	2-2-3 اندازه ­گیری میزان غلظت RNA و رقیق سازی نمونه­ها…………………………………………………………………..
37	2-2-4- روش تهیه cDNA………………………………………………………………………………………………
37	2-2-5- واکنش RT-PCR………………………………………………………………………………………………
38	2-2-6 تهیه ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………..
38	2-2-6-1 تهیه TBE 5X…………………………………………………………………………………………………
38	2-2-7 پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………….
38	2-3 روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………
38	2-3-1  طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­ های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز…………………….
39	2-3-1-1 اندازه ­گیری فعالیت آنزیم آسكوربات پراكسیداز(APX)………………………………………………………
39	2-3-1-2 اندازه ­گیری فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز(GPX)………………………………………………………..
39	2-3-2 سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………………………………………..
40	2-3-3 اندازه ­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)……………………………………………………………………………….
40	2-3-4 اندازه ­گیری پروتئین کل…………………………………………………………………………………………………………….
41	2-3-5 اندازه ­گیری قندهای محلول………………………………………………………………………………………………………………….
41	2-4 آنالیزهای آماری…………………………………………………………………………………………………………………………..
42	فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………….
43	3-1 نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی…………………………………………………………………………….
43	3-1-1 بررسی بیان ژن Protein Kinase تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)………………………….
45	3-1-2 بررسی بیان ژن MAPK4 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….
46	3-1-3 بررسی بیان ژن MAPK3 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….
48	3-1-4 بررسی بیان ژنAuxin responsive protein   تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)……………
49	3-2 بررسی نتایج حاصل از آزمایشات فیزیولوژیکی…………………………………………………………………………………………….
49	3-2-1 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پر­اکسیداز (GPX) درگیاه کلزا………………………………
50	3-2-2 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) درگیاه کلزا……………………………..
52	3-2-3 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) درگیاه کلزا……………………………………………..
53	3-2-4 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان مالون­دی­آلدهید (MDA) درگیاه کلزا…………………………………………………
55	3-2-5  بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا…………………………………………………………………………..
55	3-2-6 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا………………………………………………………………………
57	فصل چهارم: بحث و بررسی…………………………………………………………………………………………………………………………….
58	4-1- بررسی‌های انجام شده در سطح مولکولی……………………………………………………………………………………………………
61	4-2 بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………………………….
66	4-3 نتیجه ­گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………..
67	4-4 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….
68	5- ضمائم…………………………………………………………………………………………………………………………………………..
71	6- منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

چکیده

تغییرات مداوم آب وهوا، مسئول القای چندین عامل تنش­زا در گیاهان می­باشد. در بین این عوامل، خشکی به­عنوان مهم­ترین تنش غیرزیستی شناخته می­ شود. برای مقابله با این شرایط گیاه باید قادر به درک، پاسخ­دهی و سازگاری نسبت به این تغییرات محیطی بوده و فعالیت­های فیزیولوژیکی خود را تغییر دهد. صدها ژن در گیاهان در پاسخ به تنش رطوبتی القا می­شوند. شناسایی و بررسی ویژگی­های ژن­های تنظیم کننده­ کلیدی دخیل در تحمل خشکی اهمیت فوق­العاده­ای در بهبود ژنتیکی گیاهان دارد. در این تحقیق از دو رقم حساس و مقاوم به خشکی گیاه کلزا (Brassica napus L.) بنام­های Okapi (حساس به خشکی) و      Zarfam (مقاوم به خشکی) استفاده شد. هدف از این پژوهش مطالعه­ بیان 4 ژن درگیر در مسیر ترارسانی علامت (signal transduction) تحت تنش خشکی در دو رقم اکاپی و زرفام می­باشد. بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA، پروفایل بیان 4 ژن شامل Protein kinas (PK) ، Auxine– responsive protein، MAPK3 و MAPK4  در زمان­های 0، 3، 12و 24 ساعت خشکی تحت تیمار مانیتول mM  200 در گیاهچه­های 8 روزه کلزا با تکنیک RT-PCR بررسی شد. آزمایش روی کل گیاهچه (Seedling) انجام گرفت. نتایج نشان داد که ژن­های،  Protein kinas (PK) و MAPK4 در رقم حساس، به­ طور معنی­داری افزایش و در رقم مقاوم، به­ طور معنی­داری کاهش سطح بیان نشان داده است. همچنین میزان بیان ژن­ MAPK3 در هر دو رقم افزایش یافته، ولی میزان بیان ژن Auxine- responsive protein در رقم حساس افزایش و در رقم مقاوم کاهش پیدا کرده است. شناخت دقیق نقش این ژن­ها، اصول استراتژی­ های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش کلزا به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر تاثیر تنش مذکور در سطح مولکولی، پاسخ گیاهان در سطح فیزیولوژیکی نیز مورد بررسی قرار گرفت. تنش خشکی موجب احساس کمبود آب در گیاه و در نتیجه بسته شدن روزنه­ها و افزایش احتمال تولید گونه­ های اکسیژن فعال در گیاهان می­گردد. افزایش فعالیت آنزیم­ های APX و GPX و CAT، به­عنوان آنتی اکسیدان آنزیمی، دلالت بر این فرایند درون سلولی دارد. با توجه به نتایج بدست آمده، افزایش ROS  موجب افزایش پراکسیداسیون چربی و در نتیجه افزایش سطح MDA  در گیاه گردید. تجمع محلول­های سازگار نیز از جمله مکانیسم­های دفاعی گیاه در برابر تنش کم آبی بوده که خود را در تجمع کربوهیدرات­ها در گیاه نشان داد. با بررسی مطالب فوق نتیجه ­گیری شد که تنش خشکی اثر زیانباری بر رشد گیاه کلزا داشته و رقم اکاپی دارای حساسیت بالا و رقم زرفام دارای حساسیت پائینی نسبت به تنش خشکی می­باشد.

کلمات کلیدی: تنش خشکی، بیان ژن، کلزا،  RT-PCR

 فهرست مطالب

عنوان                                                                               صفحه

چکیده فارسی…………………………………………………………….. 1

فصل اول: مقدمه

1-1 پروتئین ALCAM. …………………………………………………………………. 3

1-2 سرطان ……………………………………………………………………………. 6

1-3 سرطان کولورکتال……………………………………………………….. 6

1-3-1انواع مختلف سرطان کوورکتال………………………………… 9

1-3-2 علائم شایع سرطان کولورکتال…………………………………….. 9

1-3-3 تعیین مرحله بیماری  ………………………………………………… 10

1-3-4 تشخیص سرطان کولورکتال ……………………………… 13

1-3-5 انواع ژنتیکی سرطان کولورکتال و تغییرات مولکولی انها ……………………………………. 15

1-3-6 عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان کولورکتال………………………………………….. 20

1-3-7 درمان های رایج سرطان کولورکتال…………………………………………………………. 21

1-4 مساله تحقیق ……………………………………………………………………………………….. 23

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 ALCAM در درمان سرطان……………………………………. 24

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………. 27

3-1-1 باکتری مورد استفاده…………………………………………………………………………………………… 27

3-1-2 پلاسمید………………………………………………………………………………………………………………………. 27

3-1-3 انزیم ها……………………………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-5 انتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………. 28

3-1-6 محیط کشت ………………………………………………. 28

3-1-7 ژل ………………………………………………………………………. 28

3-1-8 مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………………. 28

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………………. 28

3-2  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئینALCAM.. …………………………………………………………………… 34

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر………………………………………………………………………………………………….. 34

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………….. 35

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………… 35

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب……………………………………………………………………………………………….. 35

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده………………………………….. 35

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه……………………………………………………………………………………. 36

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK  حاوی DNA ناحیهV پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 36

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli…………………………………………………………… 38

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 38

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………. 39

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK  حاوی DNA ناحیه Vپروتئین ALCAM………………………………………………… 39

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………. 41

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion………………………………………………………………………………… 42

3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………….. 42

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهV  پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………….. 44

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه Vاز ژل……………………………………………………………….. 44

3-5-2 ………………………………………………………………………….. 46

3-5-3 ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………………………… 46

 

 

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 47

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………… 48

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………. 48

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ناحیه VپروتئیALCAM……………………………………………………. 49

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج ……….. 51

3-6  بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………….. 52

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG…………………………………………………………………………. 52

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page………………………………………………………………. 52

3-6-2-1 محتویات كیت.    SDS-page     ……………………………………………………………………..53

3-6-2-2روش انجام  SDS_page………………………………………………………………… 54

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………… 58

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization…………………………………… 58

4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه …………………………………………… 63

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSKحاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM……………………………………………………….. 65

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM………………………………………………………………………………. 66

4-5 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page………………………….. 69

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث……………………………… 71

نتیجه گیری……………… 83

منابع……………………………………… 84

چکیده انگلیسی………………………………..91

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                          صفحه

شکل1-1. نمای شماتیک از ساختار پروتئینALCAM…………………………………………………………………….. 4

2-1 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیاییALCAM در بافت توموری………………………………………………….. 5

شکل 1-3. اناتومی کولون و رکتوم…………………………………………………………………………………….. 7

شکل1-4 مرحله صفر سرطان کولورکتال……………………………………………………………. 10

شکل1-5 مرحلهƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال…………………………………… 11

شکل1-6 مرحلهƖƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال……………………………………. 11

شکل 1-7 مرحلهA]]] از پیشرفت سرطان کولورکتال………………………… 12

شکل1-8. مرحله. B. ƖƖƖاز گسترش سرطان کولورکتال…………………………………….. 12

شکل 1-9 مکانسیم ناپایداری میکروستلایت………………………………………………………… 18

شکل 1-10 تفاوت های پاتولوژی بین تومورهایی که ناپایداری کروموزومی و میکروستلایت…………………………………………………. 19

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ……………………………………………………………………………….. 29

شکل 3-2.شیکر انکوباتور…………………………………………………………………………………….. 30

شکل  3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 30

شکل 3-4. تانک الکتروفورز (SDS-Page)…………………………………………………………………. 31

شکل 3-5…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………. 31

شکل3-6. سانتریفیوژ اپندورف المان……………………………………………………………………….. 32

شکل 3-7… بن ماری………………………………………………………………………………………………….. 32

شکل 3-8… انکوباتور………………………………………………………………………………………. 33

شکل 3-9 دستگاه تصویرساز ژل………………………………………………………………………….. 33

شکل 3-10 سانتریفوژ یخچال دار. ……………………………………………………………………… 34

شکل 3-11 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز………………………………………………… 39

شکل3-12 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز…………………………………………… 44

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………. 60

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی …………………………….. 60

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………….. 60

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………… 61

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………… 63

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   ………………………………………………………….65

  شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAناحیهV………………………………………………………………………………. 66

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهVپروتئینALCAM.             …………………………………………………………….. 67

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK………………………………………………. 67

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a………………………………………………………….. 68

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه …………………………………….. 69

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه Vدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………. 69

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………. 70

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ………………………………………………………………. 71

فهرست جداول

جدول 1-1 میزان بروز و مرگ ومیر سرطان کولورکتال در ایران و کشور های همسایه ایران در هر صد هزارنفر…………………….. 8

 

چکیده

مقدمه :

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده ایمنوگلوبولین ها ALCAM مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده می باشد.این پروتئین در گسترش تومورزایی سرطان کولورکتال نقش داشته و به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان عمل می کند.بیان این پروتئین به طور قابل توجهی در سرطان کولورکتال نسبت به بافت نرمال افزایش پیدا می کند

سرطان کولورکتال با 2/1 مورد جدید در سال که منجر به مرگ 600 هزار نفر در سال می شود  نزدیک به ⅓ از رایج ترین نوع تومورها را تشکیل می دهند. که از این نظر  دومین نوع شایع از سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد.از طرفی با توجه به متاستاز ان به نواحی مختلف بدن همچون کبد و ریه در مراحل پیشرفته بیماری ،تنها در صورتی که در مراحل اولیه تشخیص داده شود قابل درمان می باشد. در این تحقیق ما ناحیه Vپروتئین ALCAM را که به عنوان مهمترین بخش در تعاملات پروتئین نقش دارد جهت سنتز انتخاب نمودیم. پروتئین ALCAM نیز به عنوان مارکر سلول های سرطان کولورکتال ، با توجه به بیان ان در مراحل مختلف از پیشرفت بیماری در سطح سلول های سرطان کولورکتال می تواند به عنوان یک هدف مناسب جهت استفاده از ان در کارهای درمانی مثل ساخت واکسن و یا تهیه کیت تشخیصی برای سرطان کولورکتال مورد استفاده قرار گیرد.

روش کار :

در این تحقیق ابتدا توالی مورد نظر را با بهره گرفتن از بانک های اطلاعات ژنی استخراج  و سپس به وسیله انالیز

بیو انفورماتیکی توالی مورد نظر  جهت بهترین بیان در میزبان مناسب بهینه سازی شد. توالی مورد نظر به روش شیمیایی سنتز و سپس قطعه سنتز شده را در میزبان مناسب با بهره گرفتن از فرایند کلونینگ و از طریق وکتور بیانی مناسب انتقال داده  شده و تکثیر پیدا کرد.در برسی استفاده از القاگر مناسب بیان ژن ناحیه سنتز شده  در میزبان      بررسی شد.  SDS-pageاستفاده از تکنیک    نوترکیب القا و پروتئین مورد نظر با

بحث و نتیجه گیری :

این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین ناحیه V را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت کرد.

واژه های کلیدی: سرطان کولورکتال، ژن ناحیهV، انالیز بیوانفورماتیکی ،کلونینگ

فصل اول  :   مقدمه

1-1 پروتئین ALCAM(CD166)

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛  مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و         )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

200 تشکیل شده است همچنین وزن موکلولی ان 105 کیلو Kb اگزون[5] و اندازه ایی بیش از

دالتون می باشد(اولریچ وایدله و همکاران ،2010) این پروتئین شامل پنج دومین خارج سلولی  می باشد .(سالمون اوفوری و جودی کینگ[6]،2008C2[7]و سه نوع V[8] ایمنو گلوبولین دو نوع

مابکل بوون واروفوو[9]،1999)

گیادو اسوارت[10]،2002))ALCAM شکل1- 1  نمای شماتیک از ساختار پروتئین

این پروتئین در تعامل سلول- سلول از نوع هموفیلیک و هتروفیلیک نقش دارد.در نوع هموفیلیک    واکنش می دهد.(اولریچ  CD6) و در تعامل هتروفیلیک با ALCAM-ALCAM با خودش (

وایدله و همکاران،2010؛ اریک اندرسون و همکاران[11]،2011؛کاترینا فانالی و همکاران[12] ،2014) این پروتئین هم چنین در مهاجرت سلولی  نقش ایفا می کند.(جودی کینگک و همکاران [13]،2004 )

به طول110 امینواسیدV2  به طول 93 امینو اسید  و هم چنین V1شامل دو قسمت V ناحیه

می باشد هم چنین یک ناحیه کوچک به طول 4 امینو اسید این دو ناحیه را به هم متصل می کند..

را برای هر دونوع تعامل هموفیلیک و Vمطالعات تهیه نقشه عملکردی دومین ها حضور دومین

هتروفیلیک ضروری دانست.(مایکل بوون و همکاران[14]،1996)

چندین روش مبتنی بر  روش های ژنومیک[15] و پروتئومیکس[16] این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان انتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال  شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) انتی ژن ها  مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان