فهرست مطالب

عنوان                صفحه

. 1

.. 1

1-1 تعریف زخم و انواع آن. 2

۱-۲ سوختگی.. 2

۱-۳ زخم بستر. 2

۱-۴ ترمیم زخم. 3

۱-۵ التهاب.. 4

۱-۶ شکل‌گیری بافت.. 5

۱-۷ بلوغ و بازسازی بافت.. 6

۱-۸ روش‌های درمانی برای تسریع و بهبود فرایند ترمیم زخم. 6

۱-۹ پلاکت و نقش آن درروند ترمیمی زخم. 7

۱-۱۰ ساختمان و عملکرد پلاکت‌ها 8

۱-۱۱ مزایای استفاده از خون‌بند ناف.. 11

۱-۱۲ مزیت فرآورده‌های پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف نسبت به خون محیطی.. 12

۱-۱۳ انواع محصولات مشتق از پلاکت.. 12

۱-۱۴ پلاسمای غنی از پلاکت.. 12

۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13

۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14

۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14

۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

 

۲-۸ جمع‌ آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد‌ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68

شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف:

مواد مفید زیستی  مشتق از پلاکت ها نقش محوری در بهبود زخم ایفا می کنند. برای بررسی مکانیسم های سلولی ومولکولی بهبود زخم اثر عصاره پلاکت خون مشتق از خون بند ناف(UCB-PL)  بر فیبروبلاست ها، به عنوان سلول های قوی در بهبود زخم مورد مطالعه قرار گرفت. لذا به دلیل اینکه (UCB-PL)  دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها:

عصاره پلاکتی مشتق از پلاسمای خون بند ناف را تهیه، و سپس فیبروبلاست ها توسط غلظت های مختلف (UCB-PL)   تحت تیمار قرار گرفتند. زنده ماندن سلولها، میزان گسترش و بهبود زخم با بهره گرفتن از  روش  manualمورد بررسی قرار گرفت. سپس مشخصات بیان ژن با بهره گرفتن از روش  real-time PCR انجام شد. در نهایت وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2 / 3، smad2 / 3  از مسیر سیگنالینگ مورد استفاده قرار گرفت.

یافته ها:

نتایج نشان می دهد که افزایش  تکثیر سلولی در غلظت 10٪ (UCB-PL)   بدون اثر بر زنده ماندن سلولها می باشد.در همان غلظت(UCB-PL)  افزایش قابل توجهی از میزان بسته شدن زخم در 6-12 و 24 ساعت پس از تیمار دیده شد. همچنین تغییر نسبت بیان ژن در ژن Smad3 و Smad2 در غلظت10٪ از UCB- PL مقایسه با کنترل مثبت و منفی افزایش قابل توجهی داشت. روش وسترن بلات نشان داد که UCB- PL  اثر قابل توجهی بر سطوح پروتئین های Smad2، Smad3،Psmad2وPsamd3دارد.

نتایج:
UCB- PL باعث تحریک رشد و مهاجرت فیبروبلاست می شودکه موجب بهبود زخم از طریق فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ های مختلف از جمله، SMAD 2/3 مسیر سیگنالینگ می گردد.

واژه‌های کلیدی: ترمیم زخم، عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف، فیبروبلاست، مسیر سیگنالینگ smad

مقدمه

فرآورده عصاره پلاکتی[1] PL مشتق از خون‌بند ناف محصولی هست که از فرآورده پلاسمای غنی از پلاکتی PRP به دست می‌آید.. این ماده به علت غنی بودن از مواد مفید زیستی در ترمیم زخم‌ مورداستفاده قرار می‌گیرد. به دلیل اینکه PL دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

 

سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM حاوی غلظت‌های ۵%، ۸%، ۱۰%، ۱۵% و ۲۰% از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوی FBS 10% و کنترل منفی که خالی از هر ۲ (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنین از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوی از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعیین مقدار مناسب و مؤثر بر تکثیر و درصد بقاء سلولی توسط شمارش سلولی با تریپان‌بلو در زمان‌های متفاوت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بررسی شد. هم‌چنین برای تعیین مقدار مناسب برای مهاجرت سلولی از تکنیک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتی با غلظت‌های متفاوت بر بیان ژن‌های smad2-smad3 در سلول‌های فیبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسی قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسی اثر عصارهی پلاکتی بر مسیر سیگنالینگ Smad، مقدار بیان پروتئین‌های  Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنیک