بهمن 1391

فهرست مطالب
عنوان                                                                                                 صفحه
 
چکیده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 1
فصل اول « بررسی آنالیز استاتیکی غیر خطی »
1-1- مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 3
1-2- بر روش های تحلیل لرزه­ای سازه ها—— 5
1-2-1- تحلیل استاتیکی معادل- 5
1-2-2- تحلیل دینامیکی خطی– 6
1-2-2-1- تحلیل دینامیکی طیفی یا تحلیل مودال– 7
1-2-2-2- تحلیل دینامیکی تاریخچه زمانی خطی— 7
1-2-3- تحلیل دینامیکی تاریخچه زمانی غیرخطی– 8
1-3- تحلیل پوش آور مرسوم—- 9
1-3-1- مطالعه مقایسه ای آنالیز استاتیکی غیرخطی با آنالیز دینامیکی غیرخطیبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 9
1-3-2- اساس تحلیل استاتیکی فزاینده غیر خطی– 10
1-3-3- مزایا و نتایج قابل حصول از آنالیز پوش آور– 12
1-3-4- روش انجام تحلیل پوش آور مرسوم ——- 13
1-3-5- ارکان اصلی در انجام آنالیز استاتیکی غیر خطیبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 15
1-4- پوش آور مودی———- 15
1-5- مقدمه ای بر آنالیز پوش آور تطبیقی ——– 15
1-6- نتیجه گیری————- 16
فصل دوم « بررسی ضریب رفتار و اجزاء تشکیل دهنده آن »
2-1- مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 18
2-2- تاریخچه مطالعاتی ضریب رفتار————– 20
2-3- روش های محاسبه ضریب رفتار————— 20
2-3-1- روش های آمریکایی—— 22
2-3-1-1- روش طیف ظرفیت فریمن————- 22
2-3-1-2- روش شکل پذیری یوانگ————– 24
2-3-2- روش های اروپایی——– 27
2-3-2-1- روش تئوری شکل پذیری————– 27
2-3-2-2- روش انرژی——— 29
2-4- تشریح اجزای ضریب رفتار- 30
2-4-1- شکل پذیری———- 30
2-4-1-1- ضریب شکل پذیری کلی سازه———- 30
2-4-1-2- ضریب کاهش نیرو توسط شکل پذیری— 30
2-4-2- مقاومت افزون——— 32
2-4-2-1- عوامل مؤثر در مقاومت افزون———– 33
2-4-2-2- چگونگی محاسبه مقاومت افزون——– 35
2-4-2-3- استفاده از ضریب مقاومت افزون در ترکیبهای بارگذاری آیین نامه­ها———– 36
2-4-2-3- تاریخچه اعدادی محاسبه شده برای مقاومت افزونبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 37
2-4-3- درجه نامعینی——— 38
2-4-3-1- تئوری قابلیت اعتماد در سیستم های سازه ای بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———– 39
2-4-3-2- اثر نامعینی سازه ای در آیین نامه های مختلفبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———– 42
2-4-3-3- آثار درجه نامعینی بر پاسخ لرزه ای سازه هابلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 44
2-5-  محاسبه ضریب رفتار توسط آنالیز تاریخچه زمانیبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 44
2-5-1- معیار های عملکرد در آنالیز دینامیکی تاریخچه زمانیبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 45
2-5-1-1- معیار تغییر مکان نسبی بین طبقات—– 46
2-5-1-2- معیار پایداری——- 46
2-6-روش بررسی ضریب رفتار با روند fema p695  – 47
2-7- نتیجه گیری————- 56
فصل سوم « مدلسازی مسئله »
3-1-مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 58
3-2-فرضیات-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 58
3-3-تحلیل استاتیکی خطی—– 59
3-4-تحلیل پوش آور———– 64

 

3-5-تحلیل دینامیکی غیر خطی(incremental dynamic analysis)بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 68
فصل چهارم « ارزیابی ضرایب رفتار قاب ها »
4-1-مشخصات دینامیکی مدل ها- 74
4-2- ضریب بیش مقاومت—— 74
4-3-محاسبه ظرفیت خرابی بوسیله آنالیز IDA—– 76
4-4- بررسی خرابی———– 83
فصل پنجم « نتیجه گیری »
5-1 نتیجه گیری————– 85
منابع-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 87
 
فهرست جداول
عنوان                                                                                                 صفحه
 
جدول 2-1- مقادیر ضرایب نامعینی در ATC-19 و مقادیر محاسبه شده از پیشنهاد موسز– 42
جدول2-2- نسبت دقت برای نیاز طراحی———- 48
جدول2-3- نسبت دقت برای آزمایش مصالح——- 49
جدول2-4  جهت محاسبه SSF— 53
جدول2-5-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 54
جدول2-6-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 55
جدول 3-1 مشخصات مصالح—- 59
جدول 3-2  انواع قاب ها——- 60
جدول 3-3 نتایج تحلیل استاتیکی خطی———– 62
جدول3-4 خروجی پوش آور—- 68
جدول 3-5 انواع شتاب نگاشت و ضریب نرمال سازی شتاب نگاشت هابلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 69
جدول4-1-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 74
جدول4-2-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 75
جدول4-3 خروجی پوش آور—- 75
جدول4-4-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 76
جدول 4-5-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 77
جدول4-6-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 78
جدول4-7-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 78
جدول 4-8 خروجی IDA—— 79
جدول 4-9-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 80
جدول 4-10-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 81
جدول 4-11-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 81
جدول 4-12-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 81
جدول4-13 نهایی————- 82
 
فهرست شکل ها
عنوان                                                                                                 صفحه
 
شکل 1-1 مراحل اعمال بار جانبی به سازه، از ایجاد تغییرشکلهای ارتجاعی تا آستانه فرو ریزش در آنالیز پوش آور     11
شکل 1-2 منحنی پوش آور—– 14
شکل 2-1 نمودار منحنی ظرفیت یک سازه متعارف– 25
شکل 2-2 مدل رفتاری ساده شده برای سیستم یک درجه آزادبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 28
شکل 2-3 طیف ارتجاعی و غیر ارتجاعی با شکل پذیری ثابت بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 32
شکل 2-4 حالت های کلی ناپایداری.————– 47
شکل2-5نمودار پوش آور——– 50
شکل 2-6 نمودار IDA——— 52
شکل 3-1 مقدار و نحوه بار گذاری بار مرده برای مدل پنج سقف با پنج دهانه———— 60
شکل 3-2 ابعاد تیر و ستون  مدل پنج سقف با پنج دهانهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———— 63
شکل 3-3 مقدار آرماتور طولی برای مدل پنج سقف با پنج دهانهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 63
شکل 3-4 منحنی رفتار فولاد مورد استفاده——— 65
شکل 3-5 نمودار پوش اور مدل پنج دهانه پنج سقف- 67
شکل 3-6  نمودار IDA پنج دهانه سه سقف——- 72
شکل 4-1   نمودار IDA پنج دهانه پنج سقف—— 76
شکل 4-2   نمودار ADI سه دهانه سه سقف——- 77
شکل 4-3 پوش اور نمودار مدل 3×3————– 80
شکل 4-4نمودار جابجایی نسبی طبقات———— 83
 
 
 
فصل اول
« بررسی آنالیز استاتیکی غیر خطی »
 
 
در حال حاضر به نظر می رسد بهترین روش انجام آنالیزهای لرزه ای، آنالیز دینامیکی غیرخطی باشد ولی به دلیل پیچیدگی و زمان بر بودن آن محققین را بر آن داشته است تا طیف وسیعی از مطالعات در مورد آنالیز های استاتیکی غیرخطی موسوم به پوش آور مرسوم داشته باشند.با توسعه کاربرد تحلیل پوش آور در سالهای اخیر روش های پوش آور پیشرفته متعددی برای لحاظ کردن اثر مود های بالاتر و همچنین اثر تغییرات مشخصات مودال سازه در طول تحلیل ناشی از تسلیم اعضاء پیشنهاد شده است. روش های پیشنهادی عموماً برای لحاظ کردن اثرات مود های بالاتر از چندین تحلیل پوش آور با الگوی بارهای متناسب با اشکال مودی سازه استفاده می نماید و نتایج حاصل از این تحلیل ها با یکدیگر ترکیب می شوند. در این فصل فرایند توسعه روش های پوش آور به طور کامل شرح داده می شود و در انتها آخرین نتایج به دست آمده توسط محققین ارائه می گردد.
 
1-1- مقدمه
در سالهای گذشته آنالیز ارتجاعی، بیشترین کاربرد را جهت تحلیل و بررسی رفتار سازه ها در مقابل زلزله داشته است، اما عملکرد سازه ها در زلزله ها نشان داده است که صرفاً تحلیلهای ارتجاعی برای این منظور کافی نیستند. آنالیز دینامیکی تاریخچه زمانی غیر خطی، دقیق ترین روش جهت بررسی رفتار سازه ها هنگام زلزله است، اما این روش بسیار وقت گیر و پیچیده است. در این شیوه برای آنالیز سازه نیاز به مجموعه ای از شتابنگاشتهای مختلف می باشد تا بتوان بر اساس نتایج بدست آمده از آنالیزهای انجام شده تصمیم مقتضی گرفت، ضمن اینکه تصمیم گیری در مورد نتایج بدست آمده نیاز به دانش و تخصص کافی در این زمینه دارد.
در پی مشکلات عنوان شده پژوهشگران پیوسته به دنبال روشی بوده اند که بتواند با سرعت بالاتری سازه ها را در ناﺣﯿﮥ غیر خطی تحلیل کند. در این راستا ایدﮤ تحلیل استاتیکی فزایندﮤ غیر خطی در سال 1975 توسط محققین مطرح گردید و گامهای اولیه در این زمینه برداشته شد.
در روش مذکور، موسوم به آنالیز پوش آور متداول، سازه تحت الگوی بارگذاری ثابت تا تغییر مکان معینی موسوم به تغییر مکان هدف جلو برده می شود، مگر اینکه فروریزش سازه زودتر از رسیدن به تغییر مکان هدف رخ دهد. بعد از انجام آنالیز قادر به استخراج نتایجی از قبیل منحنی ظرفیت سازه، تغییر مکان نسبی طبقات، نیروهای داخلی اعضاء و دیگر پاسخهای لرزه ای سازه خواهیم بود .
لازم به ذکر است در طی سالهای اخیر تحلیل پوش آور به عنوان یک فرایند کاربردی نقش موثری در جهت پیشرفت و توسعه آنالیز های لرزه ای بر مبنای عملکرد داشته است و به طور گسترده ای در آیین نامه ها و دستوالعمل های بهسازی لرزه ای سازه ها مورد استفاده قرار گرفته است. در طی فرایند تحقیقات به عمل آمده در مورد روش های پوش آور از سوی محققین و در جهت رفع معایب پوش آور مرسوم که قادر نمی باشد اثر مودهای بالاتر و اثر تغییر مشخصات مودال سازه در طول تحلیل ناشی از تسلیم اعضاء در نظر بگیرد روش های پوش‌آور جدیدی براساس مفاهیم ترکیب مودال سازه ارائه گردیده است. در سال 2002 روش MPA[1]توسط چوپرا وگوئل پیشنهاد شد. در این روش چندین تحلیل پوش‌آور با الگوی بار متناسب با اشکال مودی الاستیک چند مود اول انجام گرفته سپس پاسخ لرزه‌ای سازه از ترکیب پاسخ‌های حاصل از هر مود با بهره گرفتن از روش ترکیب مجموع مربعات (SRSS) بدست می‌آمد. از آنجایی که در مودهای بالاتر افزایش جابجایی بام متناسب با افزایش جابجایی سایر طبقات نمی‌باشد و حتی در برخی موارد با افزایش برش پایه طبقه بام در جهت عکس حرکت می‌کند لذا استفاده از جابجایی بام به عنوان نقطه کنترل تغییر مکان در مودهای بالاتر با ابهاماتی روبه‌رو بوده است. در سال 2004 چوپرا وگوئل برای رفع این نقیصه روش MMPA[2] ارائه کردند. در تمام این تحلیل‌ها به علت آنکه الگوی بارگذاری ثابت است و باتوجه به کاهش سختی در طی تحلیل الگوی بار بهنگام نمی شود همچنان این آنالیز ها ازنتایج خوبی برخوردار نبود.
پس از چوپرا وگوئل با انجام مطالعات‌و بررسی‌ها در جهت رفع نواقص روش های قبلی، روش هایی ابداع شد که در هرمرحله با کاهش سختی ناشی از تسلیم اعضاء بارگذاری بهنگام می شود و در سالهای اخیر توسط آنتونیو و پینهو جدیدترین روش های پوش‌آور تطبیقی APA[3] که به صورت یک مدل تحلیل فیبری (Fiber)تحت عنوان روش های FAP[4]وDAP[5]توسعه یافته است. در ادامه پس از بر آنالیز های لرزه ای مورد استفاده در آئین نامه ها به شرح کامل آنالیز استاتیکی غیر خطی خواهیم پرداخت.
 
1-2- بر روش های تحلیل لرزه­ای سازه ها
به منظور بررسی رفتار سازه در مقابل زلزله و همچنین طراحی لرزه‌ای، نیاز به تحلیل لرزه‌ای می­باشد. انتخاب نوع تحلیل بستگی به عواملی همچون دقت مورد انتظار و توصیة آیین نامه­ها دارد. آنالیز لرزه‌ای سازه­ها به چهار روش استاتیکی و دینامیکیِ خطی و غیرخطی انجام می‌شود که در ادامه به آنها پرداخته خواهد شد.
 
1-2-1- تحلیل استاتیکی معادل
این روش از متداولترین شیوه‌های تحلیل لرزه‌ای است که در تمام آیین نامه‌های زلزله دنیا با اختلافاتی جزئی نسبت به یکدیگر از آن استفاده شده است. روش کار بدین گونه است که برش پایه طرح که درصدی از وزن سازه است و توسط ضریبی به نام ضریب زلزله بدست می آید، بر اساس یک الگوی بارگذاری مشخص در امتداد قائم سازه توزیع و به آن وارد می­گردد. پس از این مرحله با بهره گرفتن از ترکیبات بارگذاری توصیه شده توسط آیین نامه­ها، تحلیل سازه با فرضیات و تئوری های حاکم بر رفتار ارتجاعی و خطی، انجام می گیرد و نیروهای داخلی اعضا استخراج و سپس طراحی صورت می پذیرد.

چکیده:

 

به منظور بررسی تغییرات فصلی پراکنش و تنوع گاماروسها به تفکیک جنسیت در سواحل ، نمونه برداری بصورت فصلی در ده ایستگاه (از بابلسر تا فریدون کنار) به مدت یکسال ازمرداد 1392 لغایت اردیبهشت 1393 با کوادرات 50×50 سانتیمتر بصورت تصادفی و برداشت کامل تمامی نمونه ها در طول سواحل شنی انجام گرفت. در مطالعات صورت گرفته فقط گونه Pontogammarus maeoticus مشاهده شد. میانگین طول در نمونه های نابالغ و جنسهای نر و ماده بترتیب 1/4، 5/8 و 3/8 میلیمتر و وزن بترتیب 0068/0، 0303/0 و 0282/0 گرم برآورد شد، نرها دارای طول و وزن بیشتری از ماده هستند، حداکثر طول نر و ماده در این گونه 14 میلیمتربدست آمد از مجموع 1906 نمونه شمارش شده در آزمایشگاه 673 (30/35 %) نر ، 873 (80/45%) ماده ، 360 (9/18%) نابالغ بدست آمد. نسبت جنسی (نر/ ماده ) در فصل بهار، تابستان، پاییز و زمستان به ترتیب( 63/) ،(93/) ،(21/1) و(70/) بود. بیشترین نسبت جنسی با 21/1 در فصل پاییز (آبان) و کمترین نسبت جنسی با 63/ در فصل بهار(ادیبهشت) مشاهده شد همچنین این نسبت جنسی  با اختلاف کم به نفع ماده ها می باشد .

 

کلمات کلیدی: دریای مازندران،پراکنش فصلی،گاماروس،Pontogammarus maeoticus

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                صفحه

 

 

فصل اول: مقدمه و کلیات…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

1-1 مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2

1-2 بررسی برخی از فاکتورهای محیطی دریای خزر………………………………………………………………………………………………. 3

1-2-1 تغییرات دما در دریای خزر……………………………………………………………………………………………………………………….. 3

1-2-2 تغییرات شوری دریای خزر……………………………………………………………………………………………………………………….. 3

1-2-3 دریای خرز از نظر اکسیژن ………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3 ناجور پایان ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 3

1-3-1  مشخصات ناجور پایان…………………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-3-2 اندازه ناجور پایان…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3-3 رنگ در ناجور پایان ………………………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-3-4 تولید مثل ناجورپایان ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-3-5 حرکت ناجور پایان ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-3-6 تغذیه ناجور پایان ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4 کلید شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 11

1-4-1 کلید شناسایی جنس……………………………………………………………………………………………………………………………….. 11

1-4-2 کلید شناسایی زیر جنس ………………………………………………………………………………………………………………………… 11

1-4-3 کلید شناسایی گونه…………………………………………………………………………………………………………………………………. 12

1-5 بر پژوهش های انجام شده……………………………………………………………………………………………………………….. 12

1-5-1 پژوهش های صورت گرفته در ایران………………………………………………………………………………………………………… 12

1-5-2 پژوهش های صورت گرفته در دیگر کشور ها…………………………………………………………………………………………… 13

1-9 فرضیه های پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

1-10 اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………………… 15

فصل دوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………. 16

2-1 نمونه برداری …………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-2 روش نمونه برداری ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

2-3 مطالعات صورت گرفته ………………………………………………………………………………………………………………………………. 19

2-3-1 روش شناسایی گونه ………………………………………………………………………………………………………………………………. 19

2-3-2 روش اندازه گیری طول گاماروس ها ………………………………………………………………………………………………………. 20

2-3-3 روش اندازه گیری وزن …………………………………………………………………………………………………………………………. 20

2-3-4 روش تشخیص جنسیت گونه ها …………………………………………………………………………………………………………….. 21

2-3-5 روش شمارش تعداد تخم ها و نوزادان گاماروس …………………………………………………………………………………….. 26

فصل سوم نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………. 28

نتایج حاصل از ایستگاه های مختلف ……………………………………………………………………………………………………………………. 30

3-1 ایستگاه شماره 1 ( ساحل دانشگاه) …………………………………………………………………………………………………………….. 30

3-2 ایستگاه شماره 2 ( ساحل سنگی) ………………………………………………………………………………………………………………. 32

3-3 ایستگاه شماره 3 ( پارکینگ 1) ………………………………………………………………………………………………………………….. 34

3-4 ایستگاه شماره 4 ( پارکینگ 3) ………………………………………………………………………………………………………………….. 36

3-5 ایستگاه شماره 5( پارکینگ 5) …………………………………………………………………………………………………………………… 38

3-6 ایستگاه شماره 6( پارکینگ 6) …………………………………………………………………………………………………………………… 40

3-7 ایستگاه شماره 7 ( شازده رودخانه) ……………………………………………………………………………………………………………. 42

3-8 ایستگاه شماره 8 (دریاکنار) ……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

3-9 ایستگاه شماره 9 ( خزرشهر) …………………………………………………………………………………………………………………….. 46

3-10 ایستگاه شماره 10( پارک لاله) ………………………………………………………………………………………………………………… 48

3-11 فراوانی گاماروس در ماه ها و ایستگاه های مختلف  …………………………………………………………………………………….. 48

3-12 طول و وزن گاماروس ………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

3-13 رابطه بین طول و وزن گاماروس ………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-14 توزیع فراوانی گاماروس های جفت شده در  ایستگاها و ماه های مختلف سال………………………………………………. 55

3-15 هم آوری (تعداد تخم) گاماروس در  ایستگاه ها و ماه های مختلف………………………………………………………………. 57

3-16 توزیع فراوانی نسبت جنسی  گاماروس در  ایستگاه ها و ماه های مختلف ……………………………………………………. 59

3-17 توزیع فراوانی نسبی گاماروس های بالغ و نابالغ در ایستگاه ها و ماه های مختلف………………………………………….. 60

3-18 پارامترهای محیطی و همسبتگی آنها با فراوانی گاماروس ……………………………………………………………………………. 61

فصل چهارم بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4-1 بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65

4-2 نتیجه گیری نهایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………… 69

4-3 پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 69

منابع و مآخذ …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

منابع انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

ضمائم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

Abstract………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 78

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                             صفحه

 

 

شکل1-3-1Maera danaea …………………………………………………………………………………………………………………………….. 5

شکل1-3-2Echinogammarus apfelbecki …………………………………………………………………………………………………… 5

شکل1-3-3  نمای جا نبی یک ناجور پا قسمت بالا،به همراه  قطعات پاهای سینه ای قسمت پایین …………………………….. 6

شکل1-3-4 نمای جانبی یک ناجور پا …………………………………………………………………………………………………………………… 6

شکل1-3-4-1 نمای  جانبی از یک جفت Hyalella azteca ..…………………………………………………………………………….. 9

شکل1-3-4-2 نمای جانبی از نزدیکی یک جفت Melita nitida………………………………………………………………………….. 9

شکل1-3-4-3 نمای جانبی از نزدیکی یک جفت ازGammarus sp. ………………………………………………………………….. 9

شکل2-1-1  نمایی از ده ایستگاه نمونه برداری گاماروسها در سواحل (از بابلسرتا فریدون کنار)…………………………….. 17

شکل2-2-1 کوادرات ، بیلچه، الک با چشمه یک میلیمتر ……………………………………………………………………………………. 18

شکل2-2-2 اندازه گیری دمای ماسه با دماسنج جیوه ای……………………………………………………………………………………… 18

شکل2-2-3 اندازه گیری دمای آب …………………………………………………………………………………………………………………… 18

شکل2-2-4 اندازه گیری دمای هوا ……………………………………………………………………………………………………………………. 18

شکل2-2-5 نمونه های گرفته شده از ساحل ………………………………………………………………………………………………………. 19

شکل2-2-6 وسایل برای نگه داشتن نمونه ها  و خارج کردن تخم ها …………………………………………………………………… 19

شکل2-2-7 نمایی از استریو میکروسکوپ    …………………………………………………………………………………………………….. 19

شکل2-3-1 اندازه گیری نمونه ها توسط خط کش………………………………………………………………………………………………. 20

شکل2-3-2 وزن کردن نمونه ها با ترازوی دیجیتال 001/0………………………………………………………………………………… 21

شکل 2-3-4-1 وجود فرو رفتگی بین بندهای 5 و 6 از نمای کناری  …………………………………………………………………. 21

شکل 2-3-4-2 وجود فرو رفتگی بین بندهای 5 و 6 از نمای بالا ………………………………………………………………………. 21

شکل 2-3-4-3 ماده پونتو گاماروس مائوتیکوس به همرا پنج تخم آن …………………………………………………………………. 22

شکل 2-3-4-4 لارو پونتو گاماروس مائوتیکوس ……………………………………………………………………………………………….. 22

شکل 2-3-4-5 ویژگیهای تاکسونومیک گاماروس ماده………………………………………………………………………………………… 23                              ……………………………………………………………………………………………………………………………………

شکل 2-3-4-6 ویژگیهای تاکسونومیک   گاماروس نر…………………………………………………………………………………………. 25

شکل 2-3-4-7  پونتو گاماروس مائو تیکوس و تورم قسمت سینه ای آن………………………………………………………………. 25

شکل 2-3-5-1 تصویری از کیسه تخمی به همراه تخم های آن  ………………………………………………………………………….. 26

شکل 2-3-5-2 وسایل برای نگه داشتن نمونه ها  و خارج کردن تخم ها………………………………………………………………. 26

شکل 3-11-1 توزیع مکانی (ایستگاهی) و زمانی تعداد گاماروس های شمارش شده……………………………………………… 50

شکل 3-11-2 توزیع فراوانی نسبی (درصد) گاماروس های شمارش شده در ایستگاه های مختلف …………………………….. 51

شکل 3-11-3 توزیع فراوانی نسبی (درصد) گاماروس های شمارش شده در ماه های مختلف …………………………………… 51

شکل 3-13-1 رابطه بین طول و وزن گاماروس در سواحل استان مازندران……………………………………………………………. 54

شکل 3-13-2 رابطه بین طول و وزن گاماروس در جنس نر در سواحل استان مازندران………………………………………….. 54

شکل 3-13-3 رابطه بین طول و وزن گاماروس در جنس ماده در سواحل استان مازندران………………………………………. 55

شکل 3-14-1 توزیع فراوانی نسبت گاماروس های جفت شده …………………………………………………………………………….. 56

شکل 3-14-2 توزیع فراوانی نسبت گاماروس های جفت شده به تعداد کل……………………………………………………………. 56

شکل 3-15-1 میانگین هم آوری (تعداد تخم) گاماروس در ایستگاه های  مختلف از بابلسر تا فریدون کنار………………. 57

شکل 3-15-2 میانگین همآوری (تعداد تخم) گاماروس در ماه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………….. 58

شکل 3-15-3 رابطه بین طول گاماروس و میانگین تعداد در کلاسه های طولی مختلف…………………………………………… 58

شکل 3-16-1 توزیع فراوانی  نر ، ماده ، در ایستگاه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………………………… 59

شکل 3-16-2 توزیع فراوانی نر ، ماده ، در ماه های  مختلف از بابلسر تا فریدون کنار……………………………………………. 59

شکل 3-17-1 توزیع فراوانی نسبی گاماروسهای بالغ و نابالغ در ایستگاه های مختلف از بابلسر تا فریدون کنار………….. 60

شکل 3-17-2 توزیع فراوانی  بالغ ونابالغ در ماه های  مختلف از بابلسر تا فریدون کنار…………………………………………… 61

شکل 3-18-1 میانگین (± انحراف معیار) دمای آب و هوا و ماسه در ماه های مختلف……………………………………………. 62

شکل 3-18-2 میانگین (± انحراف معیار) تغییرات pH ودانسیته در ماه های مختلف…………………………………………….. 63

 

 

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                             صفحه

 

 

جدول 2-1-1 مختصات جغرافیایی ایستگاه های نمونه برداری شده……………………………………………………………………… 17

جدول3-1 ایستگاه شماره 1 ( ساحل دانشگاه)…………………………………………………………………………………………………….. 31

جدول3-2 ایستگاه شماره 2 ( ساحل سنگی)………………………………………………………………………………………………………. 33

جدول 3-3 ایستگاه شماره 3 ( پارکینگ 1)…………………………………………………………………………………………………………. 35

جدول 3-4 ایستگاه شماره 4 ( پارکینگ 3)…………………………………………………………………………………………………………. 37

جدول 3-5 ایستگاه شماره 5( پارکینگ 5)………………………………………………………………………………………………………….. 39

جدول 3-6 ایستگاه شماره 6( پارکینگ 6)………………………………………………………………………………………………………….. 41

جدول 3-7 ایستگاه شماره 7( شازده رودخانه)……………………………………………………………………………………………………. 43

جدول 3-8 ایستگاه شماره 8( دریاکنار)………………………………………………………………………………………………………………. 45

جدول 3-9 ایستگاه شماره 9( خزرشهر)…………………………………………………………………………………………………………….. 47

جدول 3-10 ایستگاه شماره 10( پارک لاله)……………………………………………………………………………………………………….. 49

جدول 3-12-1 میانگین طول و وزن در جنسیت های مختلف گاماروس در سواحل استان ……………………………………….. 52

جدول 3-12-2 میانگین طول و وزن گاماروس در ماه های مختلف در سواحل استان مازندران……………………………………. 53

چکیده:

 

دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.

در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه ­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروه ها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

 

 

 

کلمات کلیدی: جغجغه، ژن فسفوفروکتو کیناز-1، دیابت نوع1

 

 

فصل اول: مقدمه وکلیات

1-1- مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 2

2-1-کلیات تحقیق————- 3

1-2-1-دیابت-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 3

2-2-1- انواع دیابت———— 3

3-2-1- علائم بروز دیابت——- 4

4-2-1- درمان دیابت :———- 5

3-1- گیاه جغجغه ((Prosopis farcta————– 8

1-3-1- خواص دارویی جغجغه— 8

4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):—————- 9

5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :- 13

فصل دوم: بر منابع

1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان– 16

1-1-2- انار-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 17

2-1-2-مكانیسم اثر انار در دیابت:————— 17

2-1-2- سیر—————- 19

2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن—————- 21

فصل سوم: مواد و روشها

1-3- موادو روشها———— 25

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—– 28

1-3-3- نحوه گروهبندی:—— 28

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:————— 29

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———– 29

4-3-3- مراحل انجام تشریح:— 29

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

2-4-3- طراحی پرایمرها—— 35

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

5-3- استخراج RNA:——— 36

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm—— 36

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 38

6-3- سنتز cDNA———– 39

 

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 39

7-3- واکنش های PCR——- 41

1-7-3 – PCR شیب دمایی—- 41

2-7-3- PCR معمولی——– 43

8-3- الکترفورز————— 45

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

1-1-8-3- آگارز————- 45

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—– 46

3-1-8-3- لودینگ بافر——– 46

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl———— 46

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————- 47

9-3- روش کار با ژل الکترفورز– 47

10-3- رسم منحنی استاندارد:– 48

10-3- واکنش Real-Time PCR—————- 48

11-3- Threshold و مقدار CT:- 50

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 51

10-2-3- آنالیز بیان ژن——- 52

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها— 52

فصل چهارم: نتایج و بحث

1-4- جمع آوری نمونه :——- 54

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه—— 54

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 56

5-4- نتایج استخراج RNA:—- 57

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 59

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 61

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——- 61

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP————– 63

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————- 63

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR———— 64

1-9-4- تکثیر ژنPFK——– 65

2-9-4-تکثیر ژن TBP——– 66

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:———— 66

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 67

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———— 67

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————- 68

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP————— 68

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 70

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

15-4- بحث:—————- 71

16-4- پیشنهادات———— 73

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

 

 

جدول1-3- تجهیزات و دستگاه ها……………………………………………………………………………………………….. 26

جدول 2-3 پرایمرهای طراحی شده…………………………………………………………………………………………… 35

جدول3-3- لیست اجزای کیت استخراج RNA……………………………………………………………………….. 36

جدول 4-3 موادلازم برای PCR………………………………………………………………………………………………….. 42

جدول 5-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از TBP…………………………………. 42

جدول 6-3 برنامه PCR  شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از PFK-1…………………………… 43

جدول7-3 مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Tris-Hcl……………………………………………………………………. 47

جدول8-3 مواد و میزان مورد نیاز برای یک واکنش در Real-Time PCR…………………………….. 49

جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در یک واکنش Real- time PCR  برای ژن TBP……… 50

جدول10-3- شرایط دمایی و زمانی واکنش Real time PCR برای ژن PFK-1………………….. 50

 

شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکیناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان…………………. 10

شکل2-1- فروکتوز 2-6 بی فسفات مهمترین فعال کننده آنزیم فسفوفروکتوکیناز 1…………. 11

شکل3-1- مراحل گلیکولیز…………………………………………………………………………………………………………. 12

شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره…………………………………………………………………………………………….. 28

شکل 2-3-  تشریح موشها…………………………………………………………………………………………………………… 30

شکل 3-3- توالی ژن pfk-1…………………………………………………………………………………………………………. 34

شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتری…………………………………………………………………………………………… 39

شکل 5-3 دستگاه PCR  (Eppendorf –mastercyc gradient)…………………………………………….. 44

شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل…………………………………………………………………………………… 48

شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR…………………………………………………………………………………………. 49

شکل 1-4- فراوانی موشهای مورد مطالعه………………………………………………………………………………….. 54

شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر وزن موشهای صحرایی……….. 55

شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر گلوکز ناشتای موشهای صحرایی 57

شکل 5-4- نتایج استخراج Total RNA……………………………………………………………………………………. 59

شکل 6-4- تکثیر قطعه (bp190)مربوط به ژن PFK…………………………………………………………… 60

شکل7-4- تکثیر قطعه (bp126) مربوط به ژن TBP.…………………………………………………………….. 60

شکل 8-4- نتایج شیب دمایی PCR  برای ژن  PFK…………………………………………………………….. 61

شکل 9-4- نتایج شیب دمایی  PCR برای ژن TBP…………………………………………………………………. 62

شکل 10-4- منحنی استاندارد ژن  TBP………………………………………………………………………………….. 63

شکل11-4- منحنی استاندارد ژنPFK……………………………………………………………………………………… 64

شکل 12-4- منحنی تکثیرژن PFK………………………………………………………………………………………….. 65

شکل 13-4- منحنی تکثیرژن TBP………………………………………………………………………………………….. 66

شکل 14-4 تغییرات فلورسانت بر حسب دما برای ژن TBP و PFK……………………………………… 68

شکل 15-4- منحنی ذوب ژن PFK و TBP………………………………………………………………………….. 69

شکل 16-4- عکس ژل  برای ژن PFK1 نتایج حاصل از real- tim PVR…………………………….. 70

 

 

عنوان                                    فهرست مطالب                                 صفحه خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………………….1

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….2

فصل اول:کلیات

1-1) طرح موضوع…………………………………………………………………………………………………………………………………………….5

1-2) بیان مسأله……………………………………………………………………………………………………………………………………………….5

1-3) ضرورت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………….8

1-4) هدف پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………………………..8

1-5) سؤالات و فرضیه ها………………………………………………………………………………………………………………………………….8

1-6) تعریف آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………………………………………………………10

1-7) تاریخچه آنتی بیوتیک…………………………………………………………………………………………………………………………..11

1-8) اهمیت اقتصادی آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………12

1-9) گروه های تولید کننده آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………….13

1-10) معرفی و بیان ویژگی های Saccharopolyspora erythraea ………………………………………………14

1-11) طبقه بندی آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………15

1-11-1) طبقه بندی بر اساس منبع بیولوژیک……………………………………………………………………………………………15

1-11-2) طبقه بندی بر اساس ساختار شیمیایی…………………………………………………………………………………………16

1-11-3) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………………………..17

1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………24

1-13) ماکرولیدها…………………………………………………………………………………………………………………………………………..27

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………………………………………………………30

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………..31

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..32

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………32

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………33

1-19) فارماکوکینتیک…………………………………………………………………………………………………………………………………..34

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………34

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………35

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………36

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین………………………………………………………………………………..36

1-24) مراحل کلیدی فرایند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………………………………………….38

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………………………………………………………39

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن………………………………………………………….44

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding ………………………………………………………………………………..45

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………………………………………………………47

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………………………….48

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک…………………………………………………………………………………………………………….48

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………………………………………………………….49

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……50

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………………………………….50

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی……………………………………………………………………………………………………………………..51

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی………………………………………………………………………………………………………………….55

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………………………………………………………….57

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………………………………………………………….57

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده…………………………………………………………………………………………………………..59

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد………………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها…………………………………………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها…………………………………………………………………………………….61

1-24-4-2-2) تأثیر pH………………………………………………………………………………………………………………………………62

1-24-4-2-3) تأثیر دما………………………………………………………………………………………………………………………………..64

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی…………………………………………………………………………………………………………………………67

1-24-4-2-5) تأثیر هم

 زدن………………………………………………………………………………………………………………………..68

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن…………………………………………………………………………………………………………..71

1-24-4-2-7) تأثیر کف……………………………………………………………………………………………………………………………….71

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………………………………………………………..73

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته……………………………………………………………………………………………………………………74

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………………………………………………….76

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول…………………………………………………………………………………………………..77

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………..79

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن……………………………………………………………………………………………..79

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………80

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا……………………………………………………………………………………………………………81

1-25-4) سویا در ایران………………………………………………………………………………………………………………………………….82

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………………………………………………………….82

1-25-6) کنجاله سویا……………………………………………………………………………………………………………………………………83

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………………………….83

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………………………….84

1-26-2) تاریخچه کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………………..85

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………….86

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا…………………………………………………………………………………………………………………………86

فصل دوم : بر متون گذشته

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………………………..88

فصل سوم : مواد و روش ها

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..93

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش………………………………………………………………………………………………..93

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………….94

3-4) محیط های کشت مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………95

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………………………95

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………………………………………….98

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………………………………………99

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………………………………………………….100

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر…………………………………………………………………………………………………………….104

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر………………… ……..105

3-5) نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………….106

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده……………………………………………………………………………………………………….106

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ………………………………………………………………………………………107

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 ……………………………………..108

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4…………………………………………………………………………………………..108

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو……………………………………………………………………………………………………………….108

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین……………………………………………………………………………………..109

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با بهره گرفتن از کلروفرم…………………………………………………………111

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………………………………………………………………..112

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………..113

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………………………….113

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………………………………113

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث……………………………………………………………………………………………………..114

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………..114

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………………………………..114

3-7-5) تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………………………………………115

3-7-6) تهیه چاهک…………………………………………………………………………………………………………………………………….116

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8………………………………………………………………………………………………………………116

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………………………………….116

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………………………………………………….117

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد…………………………………………………………………………………………………..117

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………………………………….117

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………………………………………..118

3-8-1) فاز متحرک……………………………………………………………………………………………………………………………………..118

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………………………………………………………118

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین……………………………………………………………………………………………………..119

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC …………………………………………………………………………………………………………119

فصل چهارم: نتایج پژوهش

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین ( محیط شاهد )…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..123

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………………………………….123

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)…………………………………………………………………..124

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………………………………………125

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…..125

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین……………………………………………….128

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………………………………..129

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی…………………………………………………130

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی…………………………….130

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………..131

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر……………………………………………………………………………………………………132

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین…………………………………………………………………..132

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر…………………………………………………………….133

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی…………………………………………………………………133

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea…………………134

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…..137

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………………………………………..137

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین……………………………………………………………………………………………………………………………………..138

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین……………………………….144

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرایند…………………………………………………….145

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی………………………………………………………………………………………………………………….146

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………………………..148

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین…………………………………………………………………….149

5-6) برآورد هزینه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………153

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..153

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر…………………………………………154

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……………………..154

5-7) پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………..156

 

منابع و مراجع…………………………………………………………………………………………………………………..158

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….165

ضمائم …………………………………………………………………………………………………………………………….166

 

 

 

عنوان                                      فهرست جداول                                      صفحه

(جدول 1-1) گروه های میکروبی تولید کننده آنتی بیوتیک………………………………………………………………………..14

(جدول 1-2) برخی آنتی بیوتیک های مهم و مکانیسم عمل آنها………………………………………………………………..23

(جدول 1-3) مواد معدنی به کار رفته در محیط کشت…………………………………………………………………………………60

(جدول 1-4) محدوده دمایی رشد میکروارگانیسم های مختلف…………………………………………………………………..64

(جدول 1-5) تأثیر دی اکسید کربن بر تولید سیزومیسین در طی فرایند تخمیر……………………………………….71

(جدول 3-1) محیط کشت اسپورزایی ISP medium 2…………………………………………………………………………..95

(جدول 3-2) محیط کشت اسپورزایی CSL ……………………………………………………………………………………………….96

(جدول3-3) ترکیبات محلول میکروالمنت…………………………………………………………………………………………………….96

(جدول3-4) ترکیبات محیط کشت بذردهی……………………………………………………………………………………………….99

(جدول3-5) ترکیبات محیط کشت تخمیر………………………………………………………………………………………………….104

(جدول3-6) مقادیر کنجاله سویا و کنجاله کلزا در محیط های تخمیر………………………………………………………106

(جدول3-7) محلول های نهایی اریترومایسین استاندارد…………………………………………………………………………….111

(جدول5-1) آنالیز ترکیبی کنجاله سویا افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش……………………139

(جدول5-2) آنالیز ترکیبی کنجاله کلزای افزوده شده به محیط کشت تخمیردر این پژوهش………………….140

(جدول5-3) اسیدآمینه های ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش……………………………………..140

(جدول5-4) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله سویا استفاده شده در این پژوهش………………………………141

(جدول5-5) اسیدآمینه های ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش……………………………………….141

(جدول5-6) اسیدآمینه های غیر ضروری کنجاله کلزا استفاده شده در این پژوهش………………………………..142

 

 

عنوان                                     فهرست نمودارها                                     صفحه

(نمودار 4-1) تغییرات pH در طول فرایند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل…………………………..123

(نمودار 4-2) تغییرات درصد بیومس در طول فرایند تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت کنترل ( منحنی رشد باکتری )………………………………………………………………………………………………………………………………………………..124

( نمودار 4-3) میزان تولید اریترومایسین در محیط کشت کنترل……………………………………………………………..125

(نمودار 4-4) اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا روی pH محیط کشت در روزهای نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………129

(نمودار 4-5) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..130

(نمودار 4-6) تغییرات غلظت تولیدی اریترومایسین در محیط کشت تخمیر در روزهای مختلف و تمامی غلظت ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..131

(نمودار 4-7) تولید اریترومایسین در طول فرایند در محیط کشت حاوی غلظت بهینه……………………………132

(نمودار 4-8) تغییرات pH درطی فرایند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……….133

(نمودار4-9) تغییرات درصد وزن تر بیومس تولیدی درطی فرایند تولید اریترومایسین در محیط کشت تخمیر حاوی غلظت بهینه……………………………………………………………………………………………………………………………134

 

 

 

عنوان                                      فهرست اشکال                                      صفحه

(شکل1-1) اریترومایسین و الئاندومایسین، نمونه ای از ماکرولیدهای 14 عضوی……………………………………….27

(شکل1-2) مسیر کلی بیوسنتز اریترومایسین……………………………………………………………………………………………….29

(شکل1-3) ساختار شیمیایی اریترومایسین………………………………………………………………………………………………….31

(شکل1-4) نمونه ای از یک فرمانتور همزن دار…………………………………………………………………………………………….50

(شکل1-5) شمایی از یک راکتور مجهز به همزن………………………………………………………………………………………….69

(شکل1-6) یک دستگاه تخمیر مجهز به سیستم تزریق هوا…………………………………………………………………………70

(شکل1-7) نمونه ای از کف شکن های مکانیکی………………………………………………………………………………………….72

(شکل1-8) کشتزار کلزا در کلاله ایران…………………………………………………………………………………………………………86

(شکل 3-1) تصویری از آمپول لیوفیلیزه حاوی سویه باکتری Saccharopolyspora erythraea ….93

(شکل3-2) تصویری از اسپورهای تشکیل شده بر روی محیط اسپورزایی CSL در روز 10 …………………….98

(شکل3-3) تصویری از واکنش رنگی اریترومایسین تولیدی و محلول بروموفنل بلو………………………………….112

(شکل 3-4) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..120

(شکل3-5) کروماتوگرافی لایه نازک…………………………………………………………………………………………………………..121

(شکل4-1) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر……..126

(شکل4-2) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر……….126

(شکل 4-3) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر…….127

(شکل4-4) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر………..127

(شکل 4-5) مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر…..128

 

 

 

 

 

چکیده

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )

2- کنجاله سویا 18 گرم در لیتر ( 60 % ) و کلزا 12 گرم در لیتر ( 40 % )

3- کنجاله سویا 12 گرم در لیتر ( 40 % ) و کلزا 18 گرم در لیتر ( 60 % )

4-کنجاله سویا 21 گرم در لیتر ( 70 % ) و کلزا 9 گرم در لیتر ( 30 % )

5- کنجاله سویا 9 گرم در لیتر ( 30 % ) و کلزا 21 گرم در لیتر ( 70 % )

بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد 011/1 برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است .

کلید واژگان : اریترومایسین ، فرمانتاسیون میکروبی، کنجاله سویا ، کنجاله کلزا .

 

 

مقدمه

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با بهره گرفتن از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).

بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).

در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن

 

 

تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

 

 

 

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­ کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­ کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­ شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

کلید واژگان: سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر

 

فهرست مطالب

 

 

. 1

بر مطالعات گذشته. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان. 5

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

و اتصال نوروتروفین.. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

1-6-1 نوروسفر. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

. 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده 46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54

2-6-7 واكنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. 58

… 59

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین.. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت.. 76

4-5 نتیجه گیری.. 77

پیشنهادات.. 77

مراجع   79

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

تنظیم می­ شود.. 22

P75NTR. 23

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­ شود. 24

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.. 25

 شکل 1-5 .ارزیابی شکل­ گیری نوروسفر. 26

 شكل 1. تصاویر فاز كنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط كشت در پاساژهای مختلف. 62

 شكل 2. شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته   64

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم  MSCs پس از هفته سوم. 65

شکل4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی  66

 شکل 5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین  66

شكل6 A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

شكل 6. C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت).    67

 نمودار 6 A.  مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68

 نمودار6  B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست.. 57

 

مقدمه

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­ شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­ شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­ شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­ کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه ­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­ کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیک نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یک منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

1 progenitor

2  Niche

3 symmetric

4 asymmetric

1 Totipotent

2 Pluripotent

3 Inner cell mass

4 Multipotent

5 adult Stem Cell

6 Embryonic Stem Cell