فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

چکیده

فصل اول : کلیات

1-1مقدمه…………… 2

1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق…….5

1-2-1 آنزیم ها 5

آنزیم ها واهمیت آن. 6

1-2-3 منابع آنزیمی.. 7

1-2-3-1 میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمی.. 7

1-2-3-2 موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمی.. 8

1-2-3-3 میکروارگانیسم هایGRAS.. 8

به عنوان منابع میکروارگانیسم ها 9

1-2- 5 بازار جهانی آنزیم. 10

1-2-6 پروتئازها 11

1-2-6-1 اعمال پروتئازها. 12

1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها. 17

1-2-7 کاربرد پروتئازها 22

1-2-7-1 صنعت شوینده. 22

1-2-7-2 صنعت چرم. 23

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

نوترکیب و اهمیت آن. 29

1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن. 30

1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن) 31

.. 32

-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب.. 34

هدف از انجام پروژه 36

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

فصل سوم: روش شناسی

3-1مواد شیمیایی.. 42

3-2 میكروارگانیسم ها ومحیط های كشت مورد استفاده 43

3-2-1 میكروارگانیسم ها و پلاسمیدها. 43

3-2-2محیط های كشت میكروبی.. 44

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

العات اولیه آنزیم شناسی.. 46

3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-3 دمای بهینه. 47

3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیكی آنزیم.. 47

3-5 جداسازی باکتری.. 48

 

 

3-5-1 استخراج  DNAژنومی.. 48

3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR… 48

 3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A  . 50

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

3-6 روش های الکتروفورزی.. 53

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

نوتركیب.. 54

3-7-1 ساختار ناقل كلونینگ…. 54

3-7-2 آماده سازی قطعهDNA  برای انتقال به درون وكتور. 55

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل.. 56

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

3-7-5 مستعدکردن باکتری  DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α . 59

3-8 بافرCracking. 60

3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب… 62

3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با بهره گرفتن از روش الکتروفورز. 63

3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب.. 66

نیاز تخلیص پروتئین نوترکیب… 66

3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب… 67

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

4-1 جداسازی باکتری.. 70

DNAژنومی.. 70

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+) 71

4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب.. 75

4-6 منحنی استاندارد. 77

روی فعالیت آنزیم. 77

4-8 دمای بهینه آنزیم. 78

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

5-2 پیشنهادات.. 88

 منابع و مأخذ. 89

فهرست منابع انگلیسی….89

فهرست جداول

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با بهره گرفتن از NCBI…………………………………………………………..71

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74

شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75

شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77

نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78

نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79

نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80

فصل اول

 

کلیات

 

مقدمه

پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قلیایی شدن بیش از حد خون می باشد بطوریكه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای

چکیده

هدف اصلی این پژوهش ارزیابی کمّی و کیفی بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران در اولویت­های علم و فناوری منتخب از نقشه جامع علمی کشور شامل فناوری­های نانو، زیست و انرژی هسته­ای با بهره گرفتن از داده ­های بخش­های نمایه استنادی گسترش یافته علوم و همایش­های علوم پایگاه وب آو ساینس در طی سال­های 2002 تا 2011 در مقایسه با کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404 بوده است. همچنین بررسی کمّی و کیفی میزان همکاری­های بین ­المللی ایران، دانشگاه­ها و نویسندگان برتر ایرانی و وضعیت مجلات علمی بین ­المللی که به چاپ تولیدات علمی ایرانیان پرداخته­اند، از دیگر اهداف این پایان نامه می­باشد. این پژوهش از نوع مطالعات علم­سنجی است که با بهره گرفتن از روش تحلیل استنادی انجام می­گیرد. از روش تطبیقی و هم­چنین نرم­افزارهای SPSSو Excel برای تجزیه تحلیل اطلاعات استفاده شده است. بروندادهای علمی ایران در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی در طی ده سال مذکور رشد صعودی داشته است؛ به طوری که نرخ رشد متوسط تولیدات علمی ایران در حوزه های اولویت­دار فناوری نانو 57 درصد، زیست فناوری 29 درصد و در انرژی هسته­ای 42 درصد می­باشد. در رتبه ­بندی بر اساس تعداد تولیدات علمی در زمینه فناوری نانو، کشور ایران در بین 136 کشور جهان، با تعداد 2325 تولیدات علمی حدود 26/1 درصد از کل تولیدات علمی جهان در این زمینه را دارا می­باشد و رتبه نوزدهم را دارد. در زیست فناوری در بین 186 کشور جهان، در رتبه 25 و با تعداد تولیدات 2162 در حدود 9/0 تولیدات کل جهان را دارا است. در انرژی هسته­ای هم از بین 137 کشور جهان، ایران با تعداد 933 تولیدات و حدود 79/0 درصد از کل تولیدات جهان، در رتبه 29 می­باشد. بیشترین همکاری علمی بین ­المللی کشور ایران در هر سه اولویت علم و فناوری منتخب با کشور آمریکا می­باشد و میانگین ضریب همکاری گروهی بین نویسندگان ایرانی در حوزه زیست فناوری با 66/0 بیشتر از دو حوزه دیگر و در حوزه انرژی هسته­ای با 64/0 بیشتر از حوزه فناوری نانو با 59/0 می­باشد. مطالعه ارتباط بین تعداد انتشارات و تعداد استنادات، تعداد انتشارات و شاخص اچ، تعداد نویسندگان و تعداد استنادات، و تعداد کشورهای همکار در تولید بروندادهای علمی و استنادات در کشورهای رقیب مورد بررسی، وجود رابطه مستقیم و معناداری را نشان می­دهد. بین تعداد استنادات دریافتی در سه حوزه اولویت­دار مورد بررسی هم تفاوت معناداری وجود دارد.

کلیدواژه‌ها: ارزیابی بروندادهای علمی، ایران، اولویت­های علم و فناوری، نقشه جامع علمی کشور، همکاری علمی بین­المللی، شاخص ­های ارزیابی مجلات

 فهرست مطالب

عنوان……….. صفحه

چکیده أ‌

فهرست جدول‌ها ص‌

فهرست شکل­ها ک‌

فصل اول: کلیات پژوهش… 1

1-1. مقدمه. 2

1-2. بیان مسأله. 4

1-3. اهداف پژوهش… 6

1-3-1. هدف کلی.. 6

1-3-2. اهداف فرعی.. 7

1-4. اهمیت موضوع پژوهش… 10

1-4-1. اهمیت و ضرورت نظری پژوهش: 10

1-4-2. اهمیت کاربردی پژوهش: 11

1-5. سؤالات پژوهش… 11

1-5-1. سؤال اصلی پژوهش… 11

1-5-2. سؤالات فرعی پژوهش… 12

1-6. تعاریف متغیرهای پژوهش… 15

1-6-1. تعاریف نظری اجزای مسأله. 15

1-6-1-1. بروندادهای علمی.. 15

1-6-1-2. اولویت­های علم و فناوری نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 15

1-6-1-3. همکاری علمی.. 16

1-6-2. تعاریف عملیاتی اجزای مسأله. 16

1-6-2-1. بروندادهای علمی.. 16

1-6-2-2. اولویت­های علم و فناوری منتخب(فناوریهای نانو، زیست و انرژی هسته­ای) 16

1-6-2-3. همکاری علمی.. 17

1-7. جمع­بندی.. 17

فصل دوم. 18

مبانی نظری و پیشینه پژوهش… 18

2-1. مقدمه. 19

2-2.علم­سنجی و ارزیابی بروندادهای علمی.. 20

2-2-1. تعریف علم­سنجی.. 20

2-2-2. تاریخچه پیدایش علم­سنجی.. 22

2-2-3. تعریف کتابسنجی.. 24

2-2-4. ارتباط علم­سنجی با کتاب­سنجی.. 25

2-2-5. استناد. 26

2-2-6. کاربرد تحلیل استنادی.. 27

2-3. شاخص ­های ارزیابی بروندادهای علمی.. 31

2-3-1. تاریخچه پیدایش شاخص ­های ارزیابی.. 31

2-3-2. اهمیت انجام مقایسه و نرمالسازی با رویکرد علم سنجی.. 35

2-4. تحلیل بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 38

2-4-1. موانع توسعه علم و فناوری در کشور جمهوری اسلامی ایران. 40

2-5. اهمیت ارزیابی پژوهشگران و مؤسسات پژوهشی.. 41

2-5-1. شاخص ­های بهنجار شده موجود برای ارزیابی دانشمندان و مؤسسات پژوهشی.. 43

2-5-1-1. شاخص اچ.. 43

2-5-1-2. شاخص جی.. 45

2-5-1-3. شاخص اچ جی.. 46

2-5-1-4. شاخص پی.. 46

2-6. اهمیت مجلات… 46

2-6-1. شاخص ­های ارزیابی مجلات… 47

2-6-1-2. ایجاد طرح وزندهی کردن. 49

2-6-1-3. کاربرد عملی نفوذ مجلات نارین و ضریب تأثیر گارفیلد در علم­سنجی.. 50

2-7. همکاری­های علمی.. 52

2-7-1. ضریب همکاری گروهی.. 54

2-8.چشم­انداز و نقشه جامع علمی کشور ایران. 54

2-8-1. چشم­انداز جمهوری اسلامی ایران در افق 1404 هجری شمسی.. 54

2-8-2. مفهوم شناسی نقشه جامع علمی کشور به عنوان چشم­انداز علمی کشور. 56

2-8-3. دسته­بندی حوزه های اولویت دار. 57

2-8-4. نرخ تولید علم و کیفیت تولید علم در نقشه جامع علمی کشور. 58

2-8-5. چشم­انداز کشور ترکیه. 59

2-9.اولویت­های علم و فناوری منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 60

 

 

2-9-1. اهمیت فناوری­های نوین در جهان. 60

2-9-1-1. فناوری نانو(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 60

2-9-1-2. زیست­فناوری(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 63

2-9-1-3. انرژی هسته ای.. 67

2-10.معرفی پایگاه­های استنادی مورد استفاده 68

2-10-1. وب آو ساینس… 69

شکل 2-2. صفحه جستجوی پیشرفته پایگاه وب آو ساینس… 69

جدول2-1. انواع مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس(برگرفته از صفحه جستجوی پایگاه وب آو ساینس) 70

جدول 2-2 . انواع مختلف قالب مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس… 71

2-10-2. پایگاه اطلاعاتی جی سی آر. 72

شکل 2-3 . صفحه اصلی پایگاه استنادی نشریات… 72

2-10-3. پایگاه ای اس آی.. 73

شکل 2- 4. صفحه اصلی پایگاه اطلاعاتی ESI 73

2-11. جمع بندی مبانی نظری.. 74

2-12. پیشینه پژوهش… 75

2-12-1. پیشینه در داخل ایران. 75

2-12-1-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 75

2-12-1-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه های مختلف علم و فناوری.. 78

2-12-1-3. بررسی جایگاه ایران در علوم جهانی.. 87

2-12-1-4. ارزیابی بروندادهای علمی دانشگاه­ها و مؤسسات… 93

2-12-2. پیشینه در خارج از ایران. 96

2-12-2-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 96

2-12-2-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه های مختلف علم و فناوری.. 108

2-13. جمع­بندی از مرور پیشینه­ها 117

فصل سوم. 120

3-1. مقدمه. 121

3-2. روش پژوهش… 121

3-3. جامعه آماری پژوهش… 122

3-4. روش نمونه گیری و حجم نمونه. 123

3-5. ابزار گردآوری داده ­ها 123

3-6. روش جمعآوری داده ­ها 124

3-7. روش تجزیه تحلیل داده ­ها 127

3-8. جمع­بندی.. 128

فصل چهارم. 129

4-1. مقدمه. 130

4-2. پاسخ به سؤالات پژوهش… 131

4-2-1. تعداد و سهم کل بروندادهای علمی کشورهای جهان در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی در دوره زمانی2002-2011 به تفکیک قاره­های جهان. 131

4-2-2. برترین کشورها از نظر کمّیت تولیدات علمی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری منتخب   134

4-2-3. بروندادهای علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از حوزه های اولویت­دار علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 138

4-2-3-1. تعداد کل بروندادهای علمی، سهم جهانی از بروندادهای علمی و رتبه جهانی و منطقه­ای کشورهای مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار منتخب… 139

4-2-3-2. رتبه منطقه­ای بروندادهای علمی ایران و سایر کشورهای رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی به طور کلی و بدون اعمال محدودیت زمانی برای شناسایی جایگاه واقعی کشور ایران در حوزه های مذکور. 143

4-2-4. میزان رشد بروندادهای علمی جهانی در سال­های مختلف مورد بررسی در اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 144

4-2-4-1. تعداد و میزان رشد بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 147

4-2-5. میزان کیفیت بروندادهای علمی 23 کشور مورد بررسی در هر یک از اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 148

4-2-6. تعداد نویسندگان، دانشگاه ها، کشورهای همکار و تعداد نشریات در کشورهای مورد بررسی برای ارائه فرمولی برای پیش ­بینی آینده 155

4-2-6-1. آزمون رگرسیون. 158

4-2-6-1-1. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 158

4-2-6-1-2. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در رشته فناوری نانو. 160

4-2-6-1-3. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 161

4-2-7. دستهبندیهای موضوعی مرتبط با اولویت­های علم و فناوری در بروندادهای علمی کشور ایران  163

4-2-8. وضعیت شاخصهای کیفی علمسنجی مانند شاخص اچ، جی، اچجی، پی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هستهای بروندادهای علمی کشور ایران. 166

4-2-9. میزان همکاریهای علمی بین المللی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای با سایر کشورهای جهان. 167

2-4-9-1. کشورهای برتر از نظر تعداد همکاریهای علمی بین ­المللی با کشور ایران و همچنین شاخصهای ارزیابی کیفیت مانند تعداد استنادات، میانگین استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 168

2-4-9-1-1. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه زیست فناوری.. 168

2-4-9-1-2. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه فناوری نانو. 169

2-4-9-1-3. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 170

4-2-9-2. مقایسه بروندادهای علمی با همکاری­های علمی بین المللی و ملّی بر اساس شاخص ­های کمّی و کیفی در هر یک از اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 171

4-2-10. شبکه هم­نویسندگی برای بروندادهای علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بین المللی در هر یک از حوزه های اولویتدار مورد بررسی در طی سالهای 2002 تا 2011. 172

4-2-10-1. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه زیست فناوری.. 173

4-2-10-2. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه فناوری نانو. 174

4-2-10-3. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 175

4-2-11. ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در طی سال­های 2002 تا 2011. 176

4-2-12. وضعیت نویسندگان برتر ایرانی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای بر اساس شاخص ­های ارزیابی کمّی و کیفی.. 177

جدول 4-23. وضعیت کمّی و کیفی نویسندگان ایرانی در حوزه اولویتدار زیست فناوری در سال­های 2002 تا 2011  177

4-2-13. برترین دانشگاه ها و مؤسسات ایرانی در حوزه های اولویتدار زیست، نانو و انرژی هسته­ای در دوره زمانی 2002 تا 2011. 180

4-2-13-1. دانشگاه ها و مؤسسات برتر ایرانی از لحاظ دارا بودن بیشترین تعداد بروندادهای علمی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری و بررسی کیفیت آنها بر اساس شاخص ­های بروندادی.. 180

4-2-14. مجلات معتبر بین ­المللی که بیشترین تولیدات علمی نویسندگان ایرانی در زمینه ­های موضوعی مذکور در آنها چاپ شده است، کدامند؟. 186

4-2-15. مجلاتی که تولیدات علمی ایرانیان در آنها به چاپ رسیده اند در مقایسه با مجلات بین المللی ، در حوزه های موضوعی مورد بررسی به صورت تفکیک سال­های مورد بررسی از نظر شاخص ­های مختلف ارزیابی کیفیت در چه وضعیتی قرار دارند؟. 192

4-2-16. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) 198

4-2-16-1. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  198

4-2-16-2. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  198

4-2-16-3. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  199

4-2-17. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 199

4-2-17-1. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای.. 199

جدول4-38. ضریب همبستگی اسپیرمن بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  199

4-2-17-2. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو. 200

4-2-17-3. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 200

4-2-18. بررسی ارتباط بین تعداد استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویتدار علم و فناوری انرژی هسته­ای ، نانو و زیست… 200

4-2-18-1. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  201

4-2-18-2. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  201

4-2-18-3. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  202

4-2-19. بررسی ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 202

4-2-19-1. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای  202

4-2-19-2. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  203

4-2-19-3. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  203

4-2-20. بررسی ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار انرژی هسته­ای ، نانو و زیست فناوری.. 203

4-2-20-1. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 204

4-2-20-2. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در زمینه فناوری نانو  204

4-2-20-3. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 205

4-2-21. آزمون­های آماری مربوط به بررسی وجود و یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری در شاخصهای ارزیابی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 205

4-2-21-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در سه حوزه اولویت­دار علم و فناوری منتخب… 205

4-2-21-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص تعداد استنادات به ازای انتشارات 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 206

4-2-22. آزمونهای بررسی تفاوت برای بروندادهای علمی کشور ایران. 207

4-2-22-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار میان میزان رشد بروندادهای علمی کشور ایران در هر یک از اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 207

4-2-22-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری تفاوت بین میزان استناد به بروندادهای علمی ایران در اولویت­های علم و فناوری.. 207

4-2-22-3. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین نسبت بین استنادات و انتشارات نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی.. 208

4-2-22-4. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار بین بروندادهای علمی اولویت­های علم و فناوری و میزان استنادات دریافتی نویسندگان برتر ایرانی.. 208

4-2-22-5.بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی 209

فصل پنجم. 210

5-1. مقدمه. 211

5-2. نتیجه ­گیری از یافته­ های پژوهش… 211

5-2-1. کمّیت و سهم بروندادهای علمی جهان به تفکیک قاره­های مختلف در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری چگونه می­باشد؟. 212

5-2-2. برترین کشورهای جهان از نظر تعداد بروندادهای علمی و بررسی زبان و قالب بروندادهای علمی جهانی و ایرانی کدامند؟ 212

5-2-3. رتبه جهانی و منطقه­ای ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، بر اساس کمّیت و سهم جهانی بروندادهای علمی آنها، در طی ده سال مذکور به چه نحوی میباشد؟. 213

5-2-4. ضریب رشد تولیدات علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از سه اولویت منتخب در طی سال­های مذکور چقدر است؟. 213

5-2-5. وضعیت کیفی بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، به چه نحو میباشد؟. 214

5-2-6. وضوعاتی که بیشترین تعداد بروندادهای علمی را در هر یک از حوزه های اولویت­دار مورد بررسی دارا می­باشند کدامند؟ 215

5-2-7. کمّیت و کیفیت تولیدات علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بین المللی و ملّی در اولویت­های منتخب علم و فناوری به چه نحوی میباشد؟. 215

5-2-8. میانگین ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در هر یک از سه حوزه اولویتدار مورد بررسی در دوره زمانی 2002 تا 2011 به چه میزانی میباشد؟. 217

5-2-9. برترین نویسندگان ایرانی از نظر تعداد بروندادهای علمی و بررسی وابستگی سازمانی و کیفیت بروندادهای علمی آنها کدامند؟. 217

5-2-10. مجلات بین ­المللی که بیشترین تولیدات علمی محققان ایرانی در آنها به چاپ رسیده است کدامند و کیفیت و نفوذ آنها به چه نحوی می­باشد؟. 218

5-2-11. آیا بین شاخص ­های مختلف بروندادی در 23 کشور رقیب مورد بررسی رابطه معناداری وجود دارد؟ 218

5-4. پیشنهادهای حاصل از پژوهش… 219

5-4-1. پیشنهادهای اجرایی.. 219

5-4-2 پیشنهادهایی برای پژوهش­های آینده 220

فهرست منابع. 221

پیوست الف… 230

چکیده انگلیسی.. 232

مقدمه

علم و فناوری زیربنای توسعه پایدار هر کشور محسوب می­ شود؛ از این رو ارزیابی آن در سطح بین ­المللی به عنوان فرایندی رو به رشد در سال­های اخیر، مورد توجه قرار گرفته است و هم­اکنون در بیشتر کشورهای صنعتی به طور منظم و توسط مؤسساتی در بخش عمومی یا خصوص انجام می­ شود؛ زیرا بدین طریق می­توان نظام علم و فناوری هر کشور را توصیف و ساختار آن را شناسایی و نقاط ضعف و قوت آن را مشخص کرد تا بتوان با تعیین راهبردها و برنامه ­ریزی­های دقیق و منظم و اجرای عملی آنها به توسعه پایدار دست یافت(خالقی، 1386).

سیاست­ها، برنامه­ها و فعالیت­های علوم و تکنولوژی در کشورهای مختلف مبین این حقیقت است که دستیابی به اهداف عالی توسعه علم وتکنولوژی، بدون سیاست­ها و برنامه ­های روشن و مشخص و ساختاری مناسب ممکن نبوده و اتلاف

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: مقدمه	1
1-1-مقدمه	2
1-2-انجماد	2
1-2-1-تاریخچه ی انجماد	3
1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی	3
1-2-2-1-انجماد آهسته	4
1-2-2-2-انجماد شیشه ای	5
1-2-3-محلول های انجمادی	5
1-2-3-1-ضدیخ ها	5
1-2-3-2-سرم	7
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه	7
3- 1-3-پیوند	9
4- 1-4-کشت	10
5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد	11
1-5-1-آپوپتوزیس	12
1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن	13
1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن	14
1-5-1-3-P53	16
1-5-1-4-کاسپاز 3	17
1-6-هدف	18
1-7-پرسش پژوهشی	18
1-8-فرضیات	18
فصل دوم : مواد و روش ها	19
2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه	20
2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه	21
2-2-1-روش تهیه محیط پایه	21
2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای	21
2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I	21
2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II	22
2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای	22
2-2-3-1-روش انجمادی I	22
2-2-3-2-روش انجمادی II	23
2-2-4-ذوب بافت بیضه	23
2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب	23
2-2-4-2-مراحل ذوب	23
2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه	24
2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی	26
2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه	26
2-6-1-1-هضم مکانیکی	27
2-6-1-2-هضم آنزیمی	27
2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با بهره گرفتن از رنگ PI	27
2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری	28
2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی	29
2 -7-کشت بافت بیضه	30
2-7-1-آماده سازی آگار	30
2-7-2-آماده سازی محیط کشت	31
2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI	31
2-7-3-کشت بافت بیضه	32
2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی	32
2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later	32
2-8-2-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول	32
2-8-2-1-هموژن کردن بافت   2-8-2-2-مرحله ی جداسازی	33   33
2-8-2-3-رسوب RNA	33
2-8-2-4-شستشو RNA	33
2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده	34
2-8-4-تیمار نمونه­یRNA  با بهره گرفتن از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی	34
2-8-5-سنتز cDNA	35
2-8-6-پرایمر	37
2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها	37
2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها	39
2-8-7-الکتروفورز	39
2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE	39
2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1	40
2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز	40
2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر	40
-8-7-4-بررسی کیفیت RNA	41
2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر	41
2-8-9 Real-Time PCR	42
2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش Real-Time PCR	43
2-9-آنالیز آماری داده	44
فصل سوم: نتایج	45
3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	46
3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب	46
3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	47
3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	48
3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه	48
3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت	49
3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی	49
3-4-2-Bax	49
3-4-3-BCL2	49
3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2	50
3-4-5-Caspase3	50
3-4-6-Fas	50
3-4-7-Fas Ligand	51
3-4-8-P53	51
27- فصل چهارم: بحث	66
4-1-کلیات	67
4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه	68
4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه	69
4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه	71
4-5-نتیجه گیری	75
4-6-پیشنهادات	76

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی  هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان  BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand   Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز	16
شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری	28
شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز	30
شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر	59
شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر	60
شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت	61
شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت	62
شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	63
شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	64
شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	65

چکیده

گرچه انجماد بافت بیضه روشی مناسب جهت حفظ باروری در کودکان مبتلا به سرطان است اما القای آپوپتوز و مرگ سلولی تحت تاثیر فرایند انجماد نکته ی مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. هدف از انجام این پژوهش ارزیابی میزان آپوپتوز سلولی پس از انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش نابالغ با دو روش انجمادی مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.

بافت های بیضه از موش های سوری نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفی در سه گروه کنترل ، انجمادیI و انجمادی II تقسیم گردید. در گروه انجمادی I، بافت ها با بهره گرفتن از غلظت های افزایشی ضدیخ های DMSO و EG و در گروه انجمادی II، با بهره گرفتن از  غلظت افزایشی ترکیب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه های انجمادی پس از ذوب همراه با نمونه ها ی کنترل به مدت 20 ساعت در محیط کشت RPMI حاوی 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژی، بقای سلولی، میزان وقوع آپوپتوز سلولی و میزان بیان ژن ها آپوپتوزی  (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با بهره گرفتن از روش های میکروسکوپ نوری، آنالیز فلوسایتومتری و Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.

روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II از لحاظ حفظ یکپارچگی بافت و بقای سلولی مشابه نمونه ی کنترل بود. آپوپتوز اولیه ی سلولی نیز طی ساعات کشت در گروه های انجمادی به طور معناداری (P<0/05) کاهش یافت ولی آپوپتوز ثانویه ی سلولی در گروه های انجمادی در ساعت 3 پس از کشت در مقایسه با زمان صفر به طور معناداری (P<0/05) افزایش یافت در حالی که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در گروه انجمادی I و گروه کنترل در مقایسه با گروه انجمادی II به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. میزان بیان ژن BAX در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل در طی ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. بیان ژن BCL2 در گروه های انجمادی در طی ساعات کشت کاهش یافت ولی این کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ی گروه ها در زمان 3و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد. بیان ژن های  Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه های انجمادی در مقایسه با زمان صفر افزایش معناداری (P<0/05) یافت. میزان بیان ژن p53 در گروه های کنترل و انجمادی I در ساعت 3 و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد ولی بیان این ژن در گروه انجمادی II در طی فرایند کشت نسبتا ثابت بود.

با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد هر دو روش انجمادی به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولی از طریق مسیر نکروزی و آپوپتوزی می شوند، اما روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II مرگ سلولی را بیشتر از طریق آپوپتوز القا می کند تا نکروز. از سوی دیگر با توجه به تغییرات الگوی بیان ژن P53 در حین فرایند کشت در هر دو گروه انجمادی می توان نتیجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بیضه مستقل از ژن P53 است.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

چكیده………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………………………………………………… 2

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- سندرم تخمدان پلی‌کیستیک (PCOS)…………………………………………………………………………. 5

2-2- سابقه‌ی سندرم تخمدان پلی‌کیستیک……………………………………………………………………………. 7

2-3- اپیدومیولوژی سندرم تخمدان پلی‌کیستیک…………………………………………………………………….. 7

2-4- خصوصیات بالینی سندرم تخمدان پلی‌کیستیک………………………………………………………………. 8

2-5- چرخه‌ی قاعدگی……………………………………………………………………………………………………. 10

2-5-1- فاز فولیکولار…………………………………………………………………………………………………….. 10

2-5-1-1- فولیکول بدوی………………………………………………………………………………………………. 11

2-5-1-2- فولیکول پیش انترال………………………………………………………………………………………… 13

2-5-1-3- فولیکول انترال……………………………………………………………………………………………….. 15

2-5-1-4- انتخاب فولیکول غالب…………………………………………………………………………………….. 16

2-5-1-5- فولیکول پیش تخمک‌گذاری……………………………………………………………………………… 18

2-5-1-6- تخمک‌گذاری……………………………………………………………………………………………….. 21

2-5-2- فاز لوتئال…………………………………………………………………………………………………………. 23

2-6- عدم تخمک‌گذاری…………………………………………………………………………………………………. 27

2-6-1- علل عدم تخمک‌گذاری……………………………………………………………………………………….. 27

2-6-2- نقائص مرکزی…………………………………………………………………………………………………… 30

2-6-2-1- تومورهای هیپوفیز…………………………………………………………………………………………… 31

2-6-2-2- هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………….. 31

2-6-3- بالا بودن غلظت استروژن به طور مزمن……………………………………………………………………. 31

2-6-4- نقص در فوران LH……………………………………………………………………………………………. 32

2-7- بیماری‌های موضعی تخمدان……………………………………………………………………………………… 33

2-7-1- سندرم تخمدان چند کیستی…………………………………………………………………………………… 33

2-7-1-1- زنان با یک مشخصه‌ی منحصر تخمدان‌های پلی‌کیستیک………………………………………….. 36

2-7-1-2- تعریف حاضر از تخمدان پلی‌کیستیک…………………………………………………………………. 36

2-7-1-3- ویژگی‌های بالینی و بیوشیمیایی PCOS……………………………………………………………….. 39

2-7-1-3-1- گنادوتروپین‌ها در PCOS……………………………………………………………………………. 39

2-7-1-3-1-1- ترشح نامناسب گنادوتروپین……………………………………………………………………… 39

2-7-1-3-2- تولید استروئید در زنان PCOS………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-1- ترشح آندروژن………………………………………………………………………………………. 40

2-7-1-3-2-2- تولید استروئید در تخمدان………………………………………………………………………… 40

2-7-1-3-2-3- هیپرآندروژنمی………………………………………………………………………………………. 43

2-7-1-3-2-3-1- هیپرآندروژنیسم بالینی…………………………………………………………………………. 45

2-7-1-3-3- اختلالات تیروئیدی…………………………………………………………………………………….. 46

2-7-1-3-4- هیپرپرولاکتینمی…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5- خصوصیات متابولیکی در PCOS…………………………………………………………………… 46

2-7-1-3-5-1- تحمل گلوکز…………………………………………………………………………………………. 46

2-7-1-3-5-2- مقاومت به انسولین…………………………………………………………………………………. 47

2-7-1-3-5-3- کلیرانس و ترشح انسولین………………………………………………………………………… 49

2-7-1-3-5-4- مقاومت انسولینی در زنان PCO………………………………………………………………… 50

2-7-1-3-5-5- فاکتورهای رشد شبه‌انسولینی در PCOS………………………………………………………. 50

2-7-1-3-6- لپتین و PCOS………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-1-3-7- لیپیدها و PCOS………………………………………………………………………………………… 54

2-7-1-3-7-1- دیس‌لیپیدمی…………………………………………………………………………………………. 55

2-7-1-3-8- تنظیم وزن و انرژی…………………………………………………………………………………….. 55

2-7-1-3-9- هیرسوتیسم………………………………………………………………………………………………. 56

2-7-1-3-9-1- هیرسوتیسم ایدیوپاتیک……………………………………………………………………………. 57

2-7-1-3-10- اختلالات قاعدگی و خطر ابتلا به سرطان آندومتر…………………………………………….. 58

2-7-1-3-11- ژنتیک PCOS…………………………………………………………………………………………. 59

2-7-1-3-12- مدیریت بالینی………………………………………………………………………………………… 60

2-7-1-3-13- تغییرات نحوه‌ی زندگی……………………………………………………………………………… 61

2-8- ناهنجاری‌های متابولیک و خطرات سلامت همراه با آن‌ ها…………………………………………………. 62

2-9- معیارهای تشخیص PCOS………………………………………………………………………………………. 64

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3- 1- منشور اخلاقی……………………………………………………………………………………………………… 66

3- 2- جامعه‌ی مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………… 66

3- 3- نمونه‌گیری…………………………………………………………………………………………………………… 67

3-3-1- خون‌گیری وریدی………………………………………………………………………………………………. 67

3-4- آزمایش‌های بیوشمیایی……………………………………………………………………………………………. 67

3-4-1- اندازه‌گیری گلوکز………………………………………………………………………………………………. 67

3-4-2- اندازه‌گیری پروفایل لیپیدی…………………………………………………………………………………… 68

3-4-3- اندازه‌گیری تری‌گلیسرید………………………………………………………………………………………. 68

3-4-4- اندازه‌گیری کلسترول…………………………………………………………………………………………… 69

 

3-4-5- اندازه‌گیری لیپوپروتئین………………………………………………………………………………………… 70

3-4-5-1- اندازه‌گیری لیپوپروتئین با دانسیته‌ی بالا به روش مستقیم…………………………………………… 70

3-4-5-2- اندازه‌گیری لیپوپروتئین با دانسیته‌ی پایین……………………………………………………………… 70

3-4-6- سنجش هورمونی……………………………………………………………………………………………….. 71

3-4-6-1- اندازه‌گیری هورمون LH در سرم………………………………………………………………………… 71

3-4-6-2- اندازه‌گیری هورمون FSH در سرم………………………………………………………………………. 72

3-4-6-3- اندازه‌گیری هورمون تستوسترون در سرم………………………………………………………………. 73

3-4-6-4- اندازه‌گیری هورمون DHEA-S………………………………………………………………………….. 74

3-4-6-5- اندازه‌گیری هورمون پرولاکتین در سرم………………………………………………………………… 75

3-4-6-6- اندازه‌گیری هورمون آندروستندیون……………………………………………………………………… 76

3-4-6-7- اندازه‌گیری هورمون پروژسترون در سرم………………………………………………………………. 76

3-4-6-8- اندازه‌گیری هورمون استروژن در سرم………………………………………………………………….. 77

3-4-6-9- اندازه‌گیری هورمون TSH در سرم………………………………………………………………………. 78

3-5- تکمیل پرسش‌نامه‌ها………………………………………………………………………………………………… 79

3-5-1- پرسش‌نامه‌ی کیفیت زندگی…………………………………………………………………………………… 79

3-5-2- پرسش‌نامه‌ی دموگرافیک……………………………………………………………………………………… 79

3-6- تجزیه و تحلیل‌های آماری……………………………………………………………………………………….. 79

فصل چهارم: نتایج

4-1- بررسی ویژگی‌های جمعیت‌شناختی زنان مورد مطالعه……………………………………………………… 81

4-2- مقایسه‌ی هورمون‌ها در زنان PCOS با زنان سالم…………………………………………………………… 82

4-3- مقایسه‌ی عوامل خونی در زنان PCOS با زنان سالم……………………………………………………….. 87

4-4- مقایسه‌ی عوامل بالینی در زنان PCOS با زنان سالم………………………………………………………… 89

4-5- بررسی ارتباط نمایه‌ی توده‌ی بدنی با پارامترهای مورد مطالعه……………………………………………. 90

4-5-1- بررسی ارتباط نمایه‌ی توده‌ی بدنی با هورمون‌های مورد مطالعه………………………………………. 90

4-5-2- بررسی ارتباط نمایه‌ی توده‌ی بدنی با عوامل خونی مورد مطالعه……………………………………… 91

4-6- بررسی ارتباط سن با پارامترهای مورد مطالعه………………………………………………………………… 92

4-6-1- بررسی ارتباط سن با هورمون‌های مورد مطالعه………………………………………………………….. 92

4-6-2- بررسی ارتباط سن با عوامل خونی مورد مطالعه…………………………………………………………. 92

4-7- بررسی ارتباط سطوح هورمون‌ها با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)……………………………………. 94

4-8- بررسی ارتباط سطوح عوامل خونی با تشخیص نهایی (PCOS- سالم)………………………………… 96

4-9- بررسی ارتباط بین هورمون‌های مورد مطالعه………………………………………………………………….. 98

4-10- بررسی ارتباط بین عوامل خونی مورد مطالعه………………………………………………………………. 98

4-11- بررسی ارتباط بین عوامل خونی و هورمون‌های مورد مطالعه……………………………………………. 100

فصل پنجم: بحث

5-1- شایع‌ترین علایم بالینی در افراد مبتلا به PCOS…………………………………………………………….. 101

5-2- شایع‌ترین عوامل خونی غیر طبیعی در افراد PCOS………………………………………………………… 104

5-3- تغییرات هورمونی افراد PCOS………………………………………………………………………………….. 105

5-4- متغیرهای دموگرافیک در بیماران PCOS……………………………………………………………………… 106

5-4-1- رابطه‌ی توده‌ی بدنی با هورمون‌ها و عوامل خونی در بیماران PCOS……………………………….. 106

5-4-1-1- رابطه‌ی توده‌ی بدنی و هورمون‌ها……………………………………………………………………….. 106

5-4-2- رابطه‌ی توده‌ی بدنی با عوامل خونی……………………………………………………………………….. 107

5-4-3- رابطه‌ی سن با هورمون‌ها و عوامل خونی در بیماران PCOS…………………………………………. 107

5-4-3-1- رابطه‌ی سن با هورمون‌ها………………………………………………………………………………….. 107

5-4-3-2- رابطه‌ی سن با عوامل خونی………………………………………………………………………………. 108

5-5- اثرات متقابل متغیرهای دموگرافیکی، هورمونی و خونی در بیماران PCOS……………………………. 109

5-6- کیفیت زندگی بیماران PCOS……………………………………………………………………………………. 110

5-7- نتیجه‌گیری کلی……………………………………………………………………………………………………… 111

6- منابع……………………………………………………………………………………………………………………….. 114

7- پیوست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………. 127

8- چکیده‌ی انگلیسی………………………………………………………………………………………………………. 129

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                               صفحه

جدول 2-1- خلاصه‌ای از مطالعاتی نشان دهنده‌ی میزان شیوع تخمدان پلی‌کیستیک PCO به کمک اولتراسونوگرافی (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………………………………………………………………………………… 36

جدول 2-2- مشخصات بافت‌شناسی تخمدان پلی‌کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)……………….. 37

جدول 2-3- معیار اولتراسونوگرافی برای تشخیص PCO (برگرفته از Koivunen, 2001)………………… 37

جدول 2-4- کرایتریای تشخیصی برای سندرم‌ تخمدان پلی‌کیستیک برطبق تعاریف مختلف منتشر شده، برگرفته از Conder & Escobar-Morreale, 2007 )………………………………………………………………………………. 65

جدول3-1- تعداد افراد مورد مطالعه…………………………………………………………………………………… 67

جدول 3-2- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست LH به روش ELISA……………………………………. 72

جدول 3-3- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست FSH به روش ELISA………………………………….. 73

جدول 3-4- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست تستوسترون به روش ELISA………………………….. 74

جدول 3-5- مقادیر مورد انتظار برای سیستم تست پرولاکتین به روش ELISA…………………………….. 76

جدول 4-1- مقایسه‌ی ویژگی‌های جمعیت‌شناختی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی‌کیستیک و زنان سالم (کنترل)    82

جدول 4-2- مقایسه‌ی هورمون‌های مورد بررسی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی‌کیستیک و زنان سالم (کنترل)       83

جدول 4-3- مقایسه‌ عوامل خونی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی‌کیستیک و زنان سالم (کنترل)……….. 87

جدول 4-4- مقایسه‌ی عوامل بالینی زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی‌کیستیک و زنان سالم (کنترل)…….. 89

جدول 4-5- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه‌ی توده‌ی بدنی با هورمون‌های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 91

جدول 4-6- ضریب همبستگی اسپیرمن بین نمایه‌ی توده‌ی بدنی با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………………………………………………………………………… 92

جدول 4-7- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با هورمون‌های مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-8- ضریب همبستگی اسپیرمن بین سن با عوامل خونی مورد بررسی در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………………………………….. 93

جدول 4-9- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی هورمون‌های مورد بررسی در نقطه‌ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 96

جدول 4-10- مقادیر حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی عوامل خونی مورد بررسی در نقطه‌ی برش تعیین شده……………………………………………………………………………………………………………… 97

جدول 4-11- ضریب همبستگی اسپیرمن بین هورمون‌های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 99

جدول 4-12- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS 98

جدول 4-13- ضریب همبستگی اسپیرمن بین عوامل خونی و هورمون‌های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیر مبتلا به PCOS …………………………………………………………………………………………………………………….. 100

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                 صفحه

نمودار 4-1- مقایسه‌ی هورمون LH زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……………… 83

نمودار 4-2- مقایسه‌ی هورمون FSH زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……………. 84

نمودار 4-3- مقایسه‌ی نسبت LH/FSH زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای………… 84

نمودار 4-4- مقایسه‌ی هورمون تستوسترون زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……. 84

نمودار 4-5- مقایسه‌ی هورمون DHEA-S زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای…….. 85

نمودار 4-6- مقایسه‌ی هورمون پرولاکتین زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……… 85

نمودار 4-7- مقایسه‌ی هورمون آندروستندیون زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای… 85

نمودار 4-8- مقایسه‌ی هورمون پروژسترون زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……. 86

نمودار 4-9- مقایسه‌ی هورمون استروژن زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……….. 86

نمودار 4-10- مقایسه‌ی هورمون TSH زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای…………. 86

نمودار 4-11- مقایسه‌ی گلوکز زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای…………………… 87

نمودار 4-12- مقایسه‌ی کلسترول زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……………….. 88

نمودار 4-13- مقایسه‌ی LDL زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای……………………. 88

نمودار 4-14- مقایسه‌ی HDL زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای…………………… 88

نمودار 4-15- مقایسه‌ی تری‌گلیسرید زنان گروه PCOS و کنترل با بهره گرفتن از نمودار جعبه‌ای…………… 89

نمودار 4-16- مقایسه عوامل بالینی درزنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS…………………………………………. 90

نمودار 4-17- منحنی مشخصه‌ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف هورمون‌های مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 94

نمودار 4-17- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 95

نمودار 4-18- منحنی مشخصه‌ی عملکرد (ROC) در نقاط برش مختلف عوامل خونی مورد مطالعه در دو گروه زنان مبتلا و غیرمبتلا به PCOS………………………………………………………………………………………………………… 98

نمودار 4-18- ادامه………………………………………………………………………………………………………… 98

فهرست شکل‌ها

عنوان                                                                                                                 صفحه

شکل 2-1- برش عرضی تخمدان (برگرفته از Chedumbarum Pillay, 2009)………………………………. 12

شکل 2-2- تصویر سونوگرافی یک تخمدان پلی‌کیستیک (برگرفته از Koivunen, 2001)…………………. 38

شکل 2-3- مسیرهای ساخته شدن استروئیدها در فولیکول انترال تخمدان بر اساس دو گنادوتروپین (برگرفته از Koivunen, 2001)………………………………………………………………………………………………………….. 42

شکل 2-4- تاریخچه‌ طبیعی زنان با PCOS (برگرفته از Koivunen, 2001)……………………………….. 54

 

چكیده

سندرم تخمدان پلی‌کیستیک (PCOS)، شایع‌ترین بیماری مرتبط با عدم تخمک‌گذاری مزمن است و 6-4 درصد زنان را در سن باروری مبتلا می‌کند. PCOS یک اختلال اندوکرین اختصاصی یا مجزا با علت یا پاتوفیزیولوژی منحصر به فرد نمی‌باشد، بلكه در پاتوفیزیولوژی آن، عوامل ژنتیکی و محیطی در تعامل و ترکیب با یكدیگر می‌باشند. در واقع، به این اختلال می‌توان به عنوان مسیر نهایی مشترک در عدم تخمک‌گذاری نگاه کرد. هیرسوتیسم، آکنه، افزایش غیر طبیعی استروئیدوژنز تخمدانی و آدرنال که نشانه‌ای از هیپرآندروژنیسم است، در بیماران PCOS دیده می‌شوند. همچنین مقاومت انسولینی و سندرم متابولیک می‌توانند در این بیماران زمینه‌سازی برای بروز بیماری‌های قلبی- عروقی باشد.

در این تحقیق، هیرسوتیسم، عوامل خونی (گلوکز، تری‌گلیسرید، کلسترول، LDL، HDL) و عوامل هورمونی (LH، FSH، تستوسترون، DHEA، DHEA-S، پرولاکتین، پروژسترون، استروژن و TSH) و روابط متقابل میان آن‌ ها در 400 فرد PCOS و 500 فرد سالم مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد که از میان نشانه‌های بالینی مورد بررسی، علائمی چون موهای زائد، دردهای قاعدگی، قاعدگی نامنظم و تأخیر در قاعدگی بیماران PCOS جزو شایع‌ترین علائم در زنان ایرانی مورد مطالعه می‌باشند. همچنین مشخص شد که افسردگی، خستگی زودرس، آکنه و نازایی در زنان PCOS مورد بررسی، شیوع بیش‌تری داشت. مطالعه‌ی حاضر نشان داد که میانگین گلوکز، کلسترول، LDL و تری‌گلیسرید زنان PCOS به طور معنی‌داری بالاتر از گروه کنترل بود. علاوه‌بر این، هورمون‌های LH، FSH، تستوسترون، DHEA، DHEA-S، پرولاکتین، پروژسترون و استروژن در زنان PCOS بالاتر از زنان سالم بود. نتایج به‌دست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که ارتباط معنی‌داری بین نمایه‌ی توده‌ی بدنی و هورمون‌های پرولاکتین و TSH در زنان ایرانی PCOS وجود دارد و این‌که این نمایه در زنان PCOS می‌تواند ارتباط مستقیمی با سطوح گلوکز، کلسترول، LDL و تری‌گلیسرید داشته باشد. مطالعات نشان داد که در زنان ایرانی PCOS، با افزایش سن نسبت LH به FSH افزایش می‌یابد. همچنین افزایش سن در این بیماران ارتباط مستقیمی با سطوح گلوکز، LDL و تری‌گلیسرید دارد. با استناد به نتایج حاصل از این تحقیق، هورمون LH در این بیماران نقش بسیار مهمی دارد، هرچند که جزئیات انواع آن و سن آغاز تغییرات مورد مطالعه قرار نگرفته است.                                                                                                        

واژگان کلیدی: PCOS، عوامل هورمونی، عوامل خونی، هیرسوتیسم، آکنه، نمایه‌ی توده‌ی بدنی

فصل اول

 

مقدمه

سندرم تخمدان پلی‌کیست (PCOS)[1] مهم‌ترین علت اولیگولاسیون و عدم تخمک‌گذاری در جمعیت زنان نابارور می‌باشد و حدود 5 تا 10 درصد از جمعیت زنان را گرفتار می‌کند. در این سندروم تخمدان‌ها بزرگ شده و حاوی چند کیست کوچک می‌شوند که با یک یا چندین نشانه شامل قاعدگی غیر طبیعی، افزایش موی بدن، آکنه، و ناباروری، مشخص می‌شود و خطر ابتلا به چاقی، دیابت، فشار خون واحتمال بیماری‌های قلبی- عروقی را افزایش می‌دهد. افراد مبتلا به این سندرم دچار مقاومت به انسولین و هیپرانسولیمی هستند (Azziz, 2005). مطالعات نشان داده است که انسولین دارای اثرات عمیقی در دو سطح استرومای تخمدان و فولیکول است. انسولین ترشح آندروژن‌ها را در تخمدان القا می‌کند وافزایش آندروژن به نوبه‌ی خود باعث آترزی یا تحلیل فولیکول در حال رشد می‌شود. بنابراین، الگوهای ترشح طبیعی استروژن مختل شده و با عدم وقوع موج هورمونLH [2]  در اواسط سیکل، ترشح پروژسترون در فاز لوتئال[3] وجود ندارد. بیشتر زنان مبتلا به PCOS، دارای افزایش سطح سرمی LH، سطح سرمی FSH[4] در محدوده‌ی پایین و افزایش نسبت  LHبه FSH می باشند (Carmina et al., 1992).

علایم هیپرآندروژنیسم بالینی نظیر هیرسوتیسم، آکنه و بروز خصوصیات مردانه در حدود 66 درصد از نوجوانان مبتلا به PCOS مشاهده می‌شود. شایع‌ترین علامت بالینی هیپرآندروژنیسم، هیرسوتیسم است و آکنه یکی از شایع‌ترین تظاهرات پوستی ناشی از هیپرآندروژنیسم است. حدود 17 درصد از زنان مبتلا به آکنه در سونوگرافی، تظاهرات تخمدان پلی‌کیستیک دارند. هیرسوتیسم علل دیگری نیز دارد، از جمله نئوپلاسم‌های[5] تخمدان، هیپرپلازی و تومورهای

فهرست مطالب

فصل اول. 1

مقدمه و کلیات.. 1

1-1 مقدمه. 2

1-1-1 گاو 4

1-1-2 گاومیش رودخانه ای.. 4

1-1-3 گوسفند. 5

1-1-4 بز. 6

1-1-5 اهداف.. 7

1-2 كلیات.. 7

1-2-1 تاریخچه مطالعات سیتوژنتیک در دامپروری.. 7

1-2-2 منطق نقشه یابی ژن ها روی كروموزوم. 8

1-2-3 نقشه های لینكاژی.. 9

1-2-4 نقشه های فیزیكی.. 9

1-2-5 نقشه یابی مقایسه ای و اصلاح دام. 10

1-2-6 همولوژی.. 11

1-2-7 کشت سلول های خونی.. 11

1-2-7-1 تاریخچه. 11

1-2-7-2 اصول بنیادی.. 12

1-2-8 تکنیک های باندینگ (رنگ آمیزی) كروموزوم ها 12

1-2-8-1 تاریخچه. 12

1-2-8-2 اصول پایه ای.. 13

1-2-9- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 15

1-2-9-1 تاریخچه. 15

1-2-9-2 اصول بنیادی.. 15

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی.. 16

1-2-9-4 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات.. 17

1-2-9-5 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH برای اتصال نقشه های لینكاژی و RH روی كروموزوم ها 19

1-2-9-6 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH در رهیافت كلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها 20

1-2-10 انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH.. 21

1-2-11 ایمونوفلوروسنس… 21

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیک خانواده گاو سانان. 22

1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیك… 22

1-2-12-2 كروموزوم های جنسی.. 26

1-2-13 بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 27

1-2-13-1 ژن برولا (FecB) 27

) 28

1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX) 29

1-2-13-4 اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری.. 30

فصل دوم. 32

بررسی منابع. 32

2-1 سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تكنیک FISH در حیوانات مزرعه ای.. 33

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای.. 37

فصل سوم. 40

مواد و روش ها 40

3- مواد و روش ها 41

3 – 1  تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی.. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون. 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های  مناسب برای FISH.. 41

3-2 انتخاب و سفارش كلون های BAC.. 42

3-2-1 شناسایی كلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 44

3-2-1-1 ژن BMPR1B.. 45

3-2-1-2 ژن BMP15. 46

3-2-1-3 ژن GDF9. 47

3-3 كشت باكتری های حاوی كلون های BAC و استخراج DNA.. 48

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 51

3-5 تهیه كاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 51

3-7 مراحل بعد از FISH.. 52

3-7-1 آشكار سازی سیگنال های FITC.. 53

3-7-2 RBPI- باندینگ… 53

3-8 بررسی میكروسكوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC.. 53

3-9 تعیین محل دقیق (باند كروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی كروموزوم ها 54

فصل چهارم. 55

نتایج.. 55

4- نتایج.. 56

4-1 كیفیت DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 56

 

4-2 نتایج حاصل از كشت سلولی و كاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ    56

) 56

) 56

) 56

) 57

4-3 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تكنیک FISH روی كروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه. 57

) 57

) 57

) 57

) 58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان. 58

فصل پنجم. 96

بحث و نتیجه گیری.. 96

5- بحث.. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی.. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیكی و لینكاژی.. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای.. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی.. 103

5-5 پیشنهادات.. 103

واژه نامه. 104

منابع و مآخذ. 106

Abstract 121

 

فهرست جداول

جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول های لنفوسیت خون در پژوهش حاضر. 43

جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوی موسسه INRA فرانسه. 44

جدول 3-3. مشخصات كامل كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر.44

جدول 3-4. تركیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA.. 50

جدول 4-1. جایگاه های ژنی نقشه یابی شده، کلون های BAC شناسایی شده

فهرست شکل ها

شکل 2-1.  مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم. 22

شکل 3-1. اطلاعات كلون  BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B.. 45

شکل 3-2. اطلاعات كلون  BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B. 46

شکل 3-3. اطلاعات كلون  BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 47

شکل 3-4. اطلاعات كلون  BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 48

شکل 3-5. اطلاعات كلون  BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 49

شکل 3-6. اطلاعات كلون  BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 50

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation. 52

شکل 4-1. نتایج حاصل از استخراج DNA از كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر. 60

شکل 4-2. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاو (BTA) در پژوهش حاضر. 61

شکل 4-3. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو 62

شکل 4-4. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاومیش رودخانه ای (BBU) در پژوهش حاضر. 63

شکل 4-5. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو میش رودخانه ای.. 64

شکل 4-6. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر. 65

شکل 4-7. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گوسفند. 66

شکل 4-8. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای بز (CHI) در پژوهش حاضر. 67

شکل 4-9. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 68

شکل 4-10. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گاو (BTA) 69

شکل 4-11. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 70

شکل 4-12. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو (BTA) 71

شکل 4-13. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 72

شکل 4-14. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 گاو (BTA) 73

شکل 4-15. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش رودخانه ای (BBU). 74

شکل 4-16. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 7 گاو میش رودخانه ای (BBU) 75

شکل 4-17. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 76

شکل 4-18. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو میش رودخانه ای (BBU) 77

شکل 4-19. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 78

شکل 4-20. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 9 گاو میش رودخانه ای (BBU) 79

شکل 4-21. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 80

شکل 4-22. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گوسفند (OAR) 81

شکل 4-23. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 82

شکل 4-24. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گوسفند (OAR) 83

شکل 4-25. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 84

شکل 4-26. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 5 گوسفند (OAR) 85

شکل 4-27. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 86

شکل 4-28. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 بز (CHI) 87

شکل 4-29. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 88

شکل 4-30. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم شماره X بز (CHI) 89

شکل 4-31. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 90

شکل 4-32. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 بز (CHI) 91

شکل 4-33. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI). 92

شکل 4-34. جایگاه  فیزیکی ژن BMPR1B روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 93

شکل 4-35. جایگاه  فیزیکی ژن BMP15 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 94

شکل 4-36. جایگاه  فیزیکی ژن GDF9 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 95

 

چکیده

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. هدف مطالعه حاضر مكان یابی فیزیكی مقایسه ای كلون های BAC گاوی حاوی ژن های باروری فاکتور رشد تمایز یافته 9 (GDF9)، پروتئین ریخت زای استخوان 15 (BMP15) و گیرنده نوع یک آن (BMPR1B) با بهره گرفتن از تكنیک هیبرید سازی در محل فلورسنتی (FISH) برای اولین بار روی كروموزوم های R- باندینگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو میش رودخانه ای (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. برای تهیه كروموزوم های R- باند شده با وضوح زیاد، نمونه های خون كامل از گونه های مورد مطالعه با وارد سازی دیر هنگام BrdU و Hoechst33258 كشت شدند. كلون های BAC حاوی ژن های مورد نظر از روی آخرین سازه ژنوم گاوی با توجه به گردآوری های توالی ژنوم گاوی UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسایی شده و سپس از كتابخانه BAC گاوی موسسه INRA تهیه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازی آن با روش Nick translation، اسلایدهای متافازی در حضور COT-l DNA گاوی به مدت یک شب تحت تیمار FISH قرار گرفتند. مراحل ردیابی سیگنال های FITC و تهیه متافازهای RBPI- باندینگ به ترتیب با بهره گرفتن از سیستم آنتی بادی های FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آمیزی اسلایدها با پروپیدیوم آیوداید انجام شد. تجزیه و تحلیل FISH موقعیت دقیق فیزیكی و باندهای كروموزومی مربوط به ژن های مورد مطالعه را روی متافازهای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز نشان داد. جایگاه دقیق فیزیكی ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز یكسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاومیش رودخانه ای، ژن BMPR1B روی موقعیت BBU7q21 مكان یابی شد. ژن BMP15 در گاو و گاومیش رودخانه به ترتیب روی BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعیت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مكان یابی شد. برای جایگاه GDF9، موقعیت های كروموزومی BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3  و CHI7q22.3 به ترتیب برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز شناسایی شدند. داده های حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه های سیتوژنتیک گونه های مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه های ژنتیكی روی باندهای اختصاصی كروموزومی شده و همچنین می تواند برای مطالعات ساختاری و عملكردی دقیق تر ژن های اخیر مخصوصاً در گاوسانان مورد استفاده قرار گیرد. انتظار می رود كه علاوه بر ردیابی دقیق موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، بتوان هر چه بیشتر از تکنیک های مبتنی بر سیتوژنتیک مولکولی در مطالعات مرتبط به شناسایی نواقص کروموزومی و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادی، خصوصاً صفات تولید مثلی در دام های اهلی استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسایی موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، منجر به این خواهد شد که ردیابی QTLها در حوالی این ژن ها هر چه سریع تر و با هزینه کمتر گیرد.

كلمات كلیدی: BMPR1B، BMP15، GDF9، نقشه یابی با FISH، كلون های BAC، گاو، گاومیش رودخانه، گوسفند، بز.

فصل اول

 

مقدمه و کلیات

 

1-1 مقدمه

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. اگر چه نقشه های ژنتیکی که تا کنون برای حیوانات اهلی تهیه شده ­اند برای ردیابی ژن ها و جایگاه های صفات کمی در فواصل 10-5 سانتی مورگان (cM) و شروع برنامه های MAS کفایت می کنند، اما شناسایی دقیق جایگاه فیزیکی ژن ها و سپس كلونینگ و ردیابی واریانس های ژنتیکی آن ها و در گام بعدی مطالعه ارتباط این واریانس ها با صفات اقتصادی در اکثر موارد به ویژه در نژادهای موجود در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران، به پژوهش های بیشتری نیاز دارند. به کارگیری داده های ژنوتیپی در ارزیابی های ژنتیکی تجاری و استراتژی های انتخاب بهینه، از جمله چالش های اصلاح نژادی می باشند که قطعاً نیازمند پیشرفت های بیشتری هستند.

كاربرد سیتوژنتیک در دام های اهلی از تكنولوژهای مفید برای توسعه ژنتیكی دام های اهلی است. سیتوژنتیک می تواند برای انتخاب حیوانات مولد فاقد نواقص كروموزومی مسئول نواقص فیزیكی (آنیوپلوئیدی)، باروری كمتر (نواقص بالانس كروموزومی) یا ناباروری (نواقص كروموزوم های جنسی) استفاده شود. همچنین سیتوژنتیک می تواند برای بررسی آلودگی های محیطی با مطالعه حیوانات موجود در مناطق آلوده و استفاده از آن ها به عنوان شناساگرهای بیولوژیكی استفاده شود (یانوزی، 2007).

مك كوسیک (1980) پیشنهاد داد كه ژنوم را به عنوان بخشی از آناتومی باید مورد توجه قرار داد. آناتومی ژنوم هم از نگاه ساختاری و هم از نگاه عملكردی برای موجودات بسیار مهم است. آنالیز ژنوم گونه های اهلی ما را قادر به شناسایی و فهم مكانیسم كنترل ژنتیكی صفات مهم اقتصادی می كند. نقشه یابی ژن ها قدم اول در آنالیز ژنوم موجودات است. با در دسترس قرار گرفتن نقشه های دقیق كروموزومی و توالی های DNA، یک پژوهشگر می تواند در اكثر موارد با جستجو در بانك داده های نقشه یابی، روی یک ناحیه كاندید در ژن مورد نظر خود تمركز كند تا اینكه ساعت ها تا ماه ها زمان را صرف فعالیت های آزمایشگاهی وقت گیر كند. با توجه به اشتباهات موجود در نقشه های لینكاژی و همچنین گردآوری های توالی ژنومی حیوانات، بهترین روش برای كاهش اشتباهات نقشه یابی ژن­ها استفاده همزمان از اطلاعات نقشه ها و توالی یابی برای تایید ترتیب ژنی در جایگاه های مورد نظر است (ویلسون و همکاران، 2001).

نقشه یابی مقایسه ای امكان دست یابی به حجم زیادی از اطلاعات را در نتیجه برنامه های ژنومی انسان فراهم آورده است. نقشه یابی ژن های انسان پایه و اساس كلونینگ موقعیتی- مقایسه ای ژن های كاندید برای جایگاه های صفات است. نقشه های مقایسه ای بر اساس نقشه یابی لوكوس های حفظ شده در حیوانات مختلف قرار دارد. نقشه یابی لینكاژی نمی تواند كمك زیادی به نقشه یابی مقایسه ای بكند زیرا جایگاه های حفظ شده اغلب به دلیل فقدان تنوع آللی تابع نقشه یابی ژنتیكی نیستند. بنابراین نقشه یابی مقایسه ای عمدتاً بر پایه مكان یابی فیزیكی ژن ها و نشانگرها استوار است (فرایز و رووینسکی، 1999).

پژوهش های سیتوژنتیک و تجزیه و تحلیل های كروموزومی در حیوانات مزرعه از نظر اقتصادی بسیار حائز اهمیت است. بنابراین تمامی حیوانات مزرعه خصوصاً آن دسته از حیواناتی كه از تلقیح مصنوعی استفاده می كنند به دلیل امكان پخش سریع نواقص كروموزومی در گله، باید تحت كنترل های سیتوژنتیک نگهداری شوند.

به عنوان مثال در كشور ایتالیا حدود 25 درصد از مشكلات تولید مثلی جمعیت گاومیش های ماده در اثر نواقص كروموزومی است كه به هیچ عنوان در فنوتیپ نمود پیدا نمی كنند و به طور مخفی باعث زیان اقتصادی می شوند. این نقایص تنها از طریق بررسی های سیتوژنتیک و تهیه كاریوتایپ حیوانات قابل شناسایی هستند (یانوزی و همکاران، 2003). شناسایی زود هنگام نواقص كروموزومی از طریق بررسی كاریوتایپ حیوانات مولد می تواند منجر به حذف زود