فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: مقدمه	1
1-1-مقدمه	2
1-2-انجماد	2
1-2-1-تاریخچه ی انجماد	3
1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی	3
1-2-2-1-انجماد آهسته	4
1-2-2-2-انجماد شیشه ای	5
1-2-3-محلول های انجمادی	5
1-2-3-1-ضدیخ ها	5
1-2-3-2-سرم	7
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه	7
3- 1-3-پیوند	9
4- 1-4-کشت	10
5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد	11
1-5-1-آپوپتوزیس	12
1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن	13
1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن	14
1-5-1-3-P53	16
1-5-1-4-کاسپاز 3	17
1-6-هدف	18
1-7-پرسش پژوهشی	18
1-8-فرضیات	18
فصل دوم : مواد و روش ها	19
2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه	20
2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه	21
2-2-1-روش تهیه محیط پایه	21
2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای	21
2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I	21
2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II	22
2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای	22
2-2-3-1-روش انجمادی I	22
2-2-3-2-روش انجمادی II	23
2-2-4-ذوب بافت بیضه	23
2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب	23
2-2-4-2-مراحل ذوب	23
2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه	24
2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی	26
2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه	26
2-6-1-1-هضم مکانیکی	27
2-6-1-2-هضم آنزیمی	27
2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با بهره گرفتن از رنگ PI	27
2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری	28
2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی	29
2 -7-کشت بافت بیضه	30
2-7-1-آماده سازی آگار	30
2-7-2-آماده سازی محیط کشت	31
2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI	31
2-7-3-کشت بافت بیضه	32
2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی	32
2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later	32
2-8-2-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول	32
2-8-2-1-هموژن کردن بافت   2-8-2-2-مرحله ی جداسازی	33   33
2-8-2-3-رسوب RNA	33
2-8-2-4-شستشو RNA	33
2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده	34
2-8-4-تیمار نمونه­یRNA  با بهره گرفتن از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی	34
2-8-5-سنتز cDNA	35
2-8-6-پرایمر	37
2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها	37
2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها	39
2-8-7-الکتروفورز	39
2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE	39
2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1	40
2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز	40
2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر	40
-8-7-4-بررسی کیفیت RNA	41
2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر	41
2-8-9 Real-Time PCR	42
2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش Real-Time PCR	43
2-9-آنالیز آماری داده	44
فصل سوم: نتایج	45
3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	46
3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب	46
3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	47
3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	48
3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه	48
3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت	49
3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی	49
3-4-2-Bax	49
3-4-3-BCL2	49
3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2	50
3-4-5-Caspase3	50
3-4-6-Fas	50
3-4-7-Fas Ligand	51
3-4-8-P53	51
27- فصل چهارم: بحث	66
4-1-کلیات	67
4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه	68
4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه	69
4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه	71
4-5-نتیجه گیری	75
4-6-پیشنهادات	76

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی  هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان  BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand   Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز	16
شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری	28
شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز	30
شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر	59
شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر	60
شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت	61
شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت	62
شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	63
شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	64
شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	65

چکیده

گرچه انجماد بافت بیضه روشی مناسب جهت حفظ باروری در کودکان مبتلا به سرطان است اما القای آپوپتوز و مرگ سلولی تحت تاثیر فرایند انجماد نکته ی مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. هدف از انجام این پژوهش ارزیابی میزان آپوپتوز سلولی پس از انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش نابالغ با دو روش انجمادی مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.

بافت های بیضه از موش های سوری نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفی در سه گروه کنترل ، انجمادیI و انجمادی II تقسیم گردید. در گروه انجمادی I، بافت ها با بهره گرفتن از غلظت های افزایشی ضدیخ های DMSO و EG و در گروه انجمادی II، با بهره گرفتن از  غلظت افزایشی ترکیب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه های انجمادی پس از ذوب همراه با نمونه ها ی کنترل به مدت 20 ساعت در محیط کشت RPMI حاوی 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژی، بقای سلولی، میزان وقوع آپوپتوز سلولی و میزان بیان ژن ها آپوپتوزی  (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با بهره گرفتن از روش های میکروسکوپ نوری، آنالیز فلوسایتومتری و Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.

روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II از لحاظ حفظ یکپارچگی بافت و بقای سلولی مشابه نمونه ی کنترل بود. آپوپتوز اولیه ی سلولی نیز طی ساعات کشت در گروه های انجمادی به طور معناداری (P<0/05) کاهش یافت ولی آپوپتوز ثانویه ی سلولی در گروه های انجمادی در ساعت 3 پس از کشت در مقایسه با زمان صفر به طور معناداری (P<0/05) افزایش یافت در حالی که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در گروه انجمادی I و گروه کنترل در مقایسه با گروه انجمادی II به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. میزان بیان ژن BAX در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل در طی ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. بیان ژن BCL2 در گروه های انجمادی در طی ساعات کشت کاهش یافت ولی این کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ی گروه ها در زمان 3و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد. بیان ژن های  Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه های انجمادی در مقایسه با زمان صفر افزایش معناداری (P<0/05) یافت. میزان بیان ژن p53 در گروه های کنترل و انجمادی I در ساعت 3 و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد ولی بیان این ژن در گروه انجمادی II در طی فرایند کشت نسبتا ثابت بود.

با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد هر دو روش انجمادی به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولی از طریق مسیر نکروزی و آپوپتوزی می شوند، اما روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II مرگ سلولی را بیشتر از طریق آپوپتوز القا می کند تا نکروز. از سوی دیگر با توجه به تغییرات الگوی بیان ژن P53 در حین فرایند کشت در هر دو گروه انجمادی می توان نتیجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بیضه مستقل از ژن P53 است.