چکیده

بیوفیلم بیانگر یک جامعه است كه در آن ارتباطات درونی بین گروه‌های متفاوت باکتری وجود دارد. بیوفیلم می‌تواند از یک گونه و یا گونه‌های مختلف میكروبی تشكیل شود. این ساختار نشان می‌دهد كه میكروارگانیسم‌ها توانایی به كار گرفتن میان كنش‌های بین سلولی برای سازگاری خود با تغییر پارامترهای محیطی را دارند. اكثر بیوفیلم‌ها دارای یک جمعیت ناهمگون از سلول‌ها، چند لایه ی احاطه شده در یک ماتریكس پلی‌ساكاریدی و كانال‌های آب هستند. هدف این تحقیق بررسی ساختمان بیوفیلم ها، همچنین بررسی اتصال باکتری های بیوفیلم به سطوح به منظور درک خصوصیات سطحی باکتری های بیوفیلم و در نهایت سنجش اثر بعضی از عوامل ضد میکروبی روی بیوفیلم به منظور حذف بیوفیلم  یا کشتن سلول های درون آن می باشد. در این تحقیق ابتدا از بیوفیلم های موجود در سیسـتم خنـک کننده کارخانـه پلی اکریل اصفهان نمونه برداری صورت گرفت. سپس باکتری های g+  و g–  بیوفیلم جداسازی و شناسایی شدند. در ادامـه، بـرای بـررسـی خصـوصـیات سطـحی ایـن باکتـری هـا، از روش هــای MATH ، Co- MATH ،Bio- MATH ، اسلاید شیشه ای و میکروپلیت استفاده شد. سپس بررسی ساختمان بیوفیلم توسط میکروسکوپ نوری و الکترونی انجام شد. در نهایت کارآیی اثر چند بیوساید با غلظت های متفاوت روی بیوفیلم به منظور حذف بیوفیلم و کشتن سلول های درون آن از طریق روش جدید میکروپلیت مورد سنجش قرار گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که باکتری های بیوفیلم دارای خصوصیات سطحی بسیار متفاوت می باشند. همچنین باکتری ها به طور برنامه ریزی شده بیوفیلم را تشکیل می دهند و می توانند ساختار های منحصر به فردی را بوجود آورند. در نهایت در این تحقیق، قابلیت بیوساید های مورد آزمایش از نظر توانایی در حذف یا کشتن سلول های درون بیوفیلم، نشان داد که توانایی حذف بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و بیوفیلم مخلوط آن ها با هم، توسط بیوساید های اکسید کننده مثل هیدروژن پراکساید و هیپوکلریت سدیم در مقایسه با غیر اکسید کننده ها مثل سولفاتیازول و الکیل دی متیل آمونیوم کلراید بسیار بالا می باشد. در نتیجه این بیوساید ها برای کنترل بیوفیلم های پایدار روی سطح، مناسب می باشند. همچنین مشخص شد که بیوساید های غیر اکسید کننده در کنترل بیوفیلم های پایدار کارآیی ندارند. در حقیقت این بیوساید ها را باید برای جلوگیری از رشد بیوفیلم به کار برد. یعنی در حالتی که بیوفیلم هنوز رشد نکرده است کاربرد این بیوساید ها مناسب می باشد. زیرا در کشتن سلول های باکتریایی کارآیی خوبی دارند.

 

فهرست مطالب

عنوان……………………………………….. صفحه

 

فصل اول: مروری بر منابع……………………….. 1

1- مقدمه…………………………………….. 1

1-1- جوامع میكروبی……………………………. 1

1-2- رفتارهای جمعی……………………………. 2

1-3- ساختار و تمایز در بیوفیلم‌ها……………….. 2

1-4- فوائد اكولوژیكی؛ چرا یک بیوفیلم تشكیل می‌شود؟… 3

1-4-1- حفاظت در برابر محیط اطراف……………….. 3

1-4-2- محافظت در برابر مواد ضد عفونی كننده………. 4

1-4-3- كسب مواد غذایی و همكاری‌های متابولیكی……… 4

1-4-3-1- كسب مواد غذایی……………………….. 4

1-4-3-2- همكاری‌های متابولیكی…………………… 5

1-4-4- كسب خصوصیات ژنتیک جدید………………….. 5

1-4-5- جنبه‌های ژنتیكی تشكیل بیوفیلم…………….. 6

1-5-فرایندهای اولیه در تشكیل بیوفیلم و تمایز ساختاری حاصل از آنها  7

1-5-1- تمایز ساختاری………………………….. 7

1-5-2- تمایز فنوتیپی و اتصال اولیه……………… 8

1-5-3- اتصال برگشت‌ناپذیر………………………. 8

1-6- بلوغ بیوفیلم…………………………….. 9

1- 7-كنده شدن به عنوان یک بخش از تكامل بیوفیلم…… 9

1- 8- تشكیل بیوفیلم به عنوان یک فرایند تكاملی……. 11

1-9- ارتباطات سلول-سلول در طول تشكیل بیوفیلم…….. 12

1- 10- خصوصیات بارز بیوفیلم……………………. 13

1-10-1- بیوفیلم به عنوان جوامع میكروبی مرتبط از نظر فیزیولوژیكی    13

1-10-2- بیوفیلم به عنوان جوامع میكروبی مرتبط از نظر رفتاری    13

1-10-3- بیوفیلم به عنوان جوامع میكروبی با ساختار پیشرفته  13

1-11- فاكتورهای شركت كننده در گسترش و بلوغ بیوفیلم.. 14

1-11-1- جنس سطح مواد………………………….. 15

1-11-2- مناسب بودن سطح مورد نظر………………… 15

1-11-3- صاف و صیقلی بودن سطح…………………… 15

1-11-4- شدت جریان آب………………………….. 15

1-11-5- محدودیت مواد غذایی…………………….. 16

1-12- بیوفیلم و انسان…………………………. 16

1-13- بیوفیلم در سیستم‌های آبی………………….. 18

1-14- فرایندهای تمیزسازی………………………. 20

1-15- میكروارگانیسم‌های برج‌های خنك كننده…………. 21

1-15-1- جلبك‌ها……………………………….. 22

1-15-2- قارچ‌ها……………………………….. 23

1-15-3- باكتری‌ها……………………………… 24

1-16- چگونگی تغذیه‌باكتری‌ها در آب……………….. 25

1-17- مشكلات ایجاد شده در سیستم‌ برج‌های خنك كننده‌ توسط باكتری‌ها 25

1-18- خوردگی میكروبی………………………….. 27

1-19- مسائل خوردگی……………………………. 27

1-20- مسائل ایجاد رسوبات………………………. 28

1-21- باكتری‌های تولید كننده‌ی لایه لعابی………….. 29

1-22- مراحل ایجاد تخریب زیستی در سیستم برج‌های خنك كننده   30

1-23- بیوسایدها………………………………. 30

1-23-1- خصوصیات اصلی یک بیوساید………………… 31

1-23-2- بیوسایدهای اكسید كننده…………………. 31

1-23-2-1- كلرین………………………………. 32

1-23-2-2- بروماین و مشتقات آن………………….. 33

1-23-2-3- اوزون………………………………. 34

1-23-2-4- پراكسید هیدروژن……………………… 34

1-23-3- بیوسایدهای غیر اكسید كننده……………… 34

1-23-3-1- گلوتارآلدئید………………………… 35

1-23-3-2- تركیبات آمونیوم چهار ظرفیتی…………… 35

1-23-3-3- ایزوتیازولون‌ها………………………. 36

1-24- مكانیسم‌های مقاومت باكتری‌ها در بیوفیلم به عوامل ضد میكروبی    38

1-24-1- جلوگیری از انتشار به درون بیوفیلم……….. 38

1-24-2- مقاومت از طریق آنزیم…………………… 38

1-24-4- حالت متابولیک ارگانیسم‌ها در بیوفیلم……… 39

1-24-3- واكنش خنثی‌سازی عوامل ضد میكروبی توسط بیوفیلم 39

1-24-5- سازش ژنتیكی…………………………… 40

فصل دوم: مواد و روش ها………………………… 41

2-1- مواد و وسایل…………………………….. 41

2-1-1- دستگاه‌ها و وسایل مورد استفاده……………. 41

2-1-2- مواد ضد میكروبی یا بیوسایدها…………….. 42

 

2-1-3- مواد مورد استفاده………………………. 42

2- 1-4- محیط‌های كشت…………………………… 43

2-2- سویه‌های باكتری مورد استفاده……………….. 44

2-2-1- سویه‌های ایزوله شده‌ی مورد استفاده در این تحقیق 44

2-2-2- مشخصات سویه‌ی استاندارد مورد استفاده در این تحقیق   44

2- 3- مواد و روش‌های به كار رفته برای نمونه‌برداری…. 45

2-3- 1-روش‌های به كار رفته برای نمونه‌برداری………. 45

2-3-1-1- روش نمونه‌برداری از آب سیستم و لایه‌های بیوفیلم موجود در دیواره‌ی برج‌های خنك كننده……………………………… 45

2-3-1- 2- نمونه‌برداری از طریق گذاشتن كوپن‌های فلزی در معرض جریان آب سیستم خنك كننده……………………………………. 47

2-4- روش‌های به كار رفته برای جداسازی و شناسایی باكتری‌های تشكیل دهنده‌ی بیوفیل روی سطح كوپن و یا باكتری‌های موجود در آب نمونه‌برداری شده 48

2-4- 1- روش به كار رفته برای كشت و جداسازی باكتری‌ها. 48

2-4-1-1- روش جداسازی و كشت باكتری‌ها از نمونه‌ی كوپن.. 48

2-4-1-2- روش جداسازی و كشت باكتری‌ها از نمونه‌ی آب سیستم    48

2-4-2- شناسایی باكتری‌های جداسازی شده……………. 49

2-4-2-1- روش به كار رفته برای شناسایی باكتری‌ها…… 49

2-4-2-2- باكتری‌ استاندارد……………………… 49

2-4-2-3-  نمودار های شناسایی باكتری‌ها…………… 49

2-4-2-3-1- شناسایی اولیه‌ی باكتری‌های جنس باسیلوس….. 50

2-4-2-3-2- شناسایی مربوط به باكتری میكروكوكوس لوتئوس 51

2-4-2-3-3- شناسایی اولیه‌ی باكتری‌های جنس آسینتوباكتر و برانهاملا 52

2-4-2-3-4- شناسایی اولیه‌ی باكتری‌ اکتینوباسیلوس…… 53

2-5- روش‌های به كار رفته برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های پلانكتونیك   54

2-5-1- روش به كار رفته برای تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های پلانكتونیك   54

2- 5-1-1- روش MATH برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها     54

2-6- روش‌ به كار رفته برای سنجش هم اتصالی بین سویهء Micrococcus  با سایر باكتری‌های جدا شده از بیوفیلم…………………… 56

2-6-1- روش آزمایش co-adhesion MATH برای تعیین هم اتصالی   57

2-7- روش‌ به كار رفته برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های موجود در بیوفیلم……………………………………………. 58

2-7-1- روش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم……. 58

2-7- 1-1- روش تست لوله‌ای برای سلول‌های موجود در بیوفیلم    58

2-7-1-2- روش انجام آزمایش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم  59

2- 8- روش‌های به كار رفته در ارزیابی قدرت اتصال هر یک از باكتری‌ها به سطوح و بررسی ساختار بیوفیلم………………………….. 59

2-8-1- روش تشكیل بیوفیلم روی اسلایدهای شیشه‌ای به منظور ردیابی تشکیل بیوفیلم……………………………………………. 60

2-8-1-1- روش رنگ‌آمیزی اسلایدهای شیشه‌ای…………… 61

2-8-1-2- روش شمارش و شناسایی باكتری‌های متصل به سطح اسلاید  61

2-8-2- تعیین كمی تشكیل بیوفیلم و مقایسه‌ی بین قدرت باكتری‌های ایزوله شده برای تشكیل بیوفیلم……………………………. 64

2-8-2-1- روش میكروتیتر پلیت برای تعیین كمیت تشكیل بیوفیلم توسط باكتری‌ها 64

2-8-3-بررسی ساختار بیوفیلم ها توسط میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ 67

2-8-3-1-  تهیه نمونه برای میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ 67

2-8-3-2- مکانیسم های تصویر سازی توسط میکروسکوپ الکترونی   67

2-8-3-2-1- مکانیسم SE…………………………. 67

2-8-3-2-2- مکانیسم BSE ……………………….. 68

2-9- روش‌ به كار رفته در ارزیابی قدرت حذف و یا ازبین بردن سلول‌های مولد بیوفیلم توسط عوامل ضد میكروبی………………….. 68

2-9-1- تهیه‌ی بیوسایدها با رقت‌های مورد نظر بر حسب ppm      69

2-9-1-1-  تهیه‌ی رقت از بیوسایدهای مایع………….. 69

2-9-1-2- تهیه‌ی رقت از بیوسایدهای جامد…………… 70

2-9-1-3- روش انجام آزمایش میكروتیتر پلیت برای تعیین پتانسیل حذف بیوفیلم توسط بیوسایدها……………………………….. 70

2-9-2- روش میكروتیتر پلیت برای تعیین پتانسیل كشتن سلول‌های مولد بیوفیلم توسط بیوسایدها……………………………….. 71

2-9-2-1-  تهیه‌ی رنگ تری فنیل تترازولیوم كلراید 2%… 72

2-9-2-2- روش انجام آزمایش میكروتیترپلیت برای تعیین پتانسیل كشتن سلول‌های مولد بیوفیلم و موجود در آن توسط عوامل ضد‌میكروبی….. 73

فصل سوم: نتایج و مشاهدات……………………. 74

3-1- جداول شناسایی و تست های بیوشیمی سویه های ایزوله شده  75

3-1-1- باسیلوس ها…………………………….. 75

3-1-2- میکروکوکوس لوتئوس………………………. 75

3-1-3- اسینتوباکتر ها…………………………. 76

3- 2- نتایج مربوط به تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها 77

3-2-1- نتایج مربوط به تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول های پلانکتونیک   77

3-2-2- نتایج مربوط به سنجش هم اتصالی بین سویه میکروکوکوس لوتئوس با سایر باکتری ها……………………………………. 78

3-2-3- نتایج مربوط به سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول های موجود در بیوفیلم  79

3-3- نتایج حاصل از روش میکروتیتر پلیت برای تعیین کمیت تشکیل بیوفیلم و مقایسه بین قدرت باکتری های ایزوله شده برای تشکیل بیوفیلم  80

3-4- نتایج مربوط به ردیابی تشکیل بیوفیلم توسط میکروسکوپ نوری  81

3-5- نسبت رشد سلول ها درون بیوفیلم در مدت زمان 24 ساعت    84

3-6- نتایج مربوط به مقایسه اتصال باکتری ها در بیوفیلم مخلوط به سطح اسلاید شیشه ای……………………………………… 84

3-7-  نتایج مربوط به بررسی بیوفیلم باکتری ها توسط میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ……………………………………… 86

3-8-  نتایج مربوط به تعیین پتانسیل حذف بیوفیلم و کشتن سلول های درون بیوفیلم توسط بیوساید ها……………………….. 91

3-8-1- اثر حذفی( ستون های CV) و کشندگی(ستون های TTC) هیپوکلریت سدیم در غلظت های مختلف روی بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و روی بیوفیلم مخلوط باکتری ها(سویه های اسینتوباکتر، باسیلوس و میکروکوکوس با هم)   91

3-8-2- اثر حذفی( ستون های CV) و کشندگی(ستون های TTC)H2O2 در غلظت های مختلف روی بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و روی بیوفیلم مخلوط باکتری ها(سویه های اسینتوباکتر، باسیلوس و میکروکوکوس با هم)…….. 95

3-8-3- اثر حذفی( ستون های CV) و کشندگی(ستون های TTC) گلوتار آلدهید در غلظت های مختلف روی بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و روی بیوفیلم مخلوط باکتری ها(سویه های اسینتوباکتر، باسیلوس و میکروکوکوس با هم) 98

3-8-4- اثر حذفی( ستون های CV) و کشندگی(ستون های TTC) سولفاتیازول در غلظت های مختلف روی بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و روی بیوفیلم مخلوط باکتری ها(سویه های اسینتوباکتر، باسیلوس و میکروکوکوس با هم) 101

3-8-5- اثر حذفی( ستون های CV) و کشندگی(ستون های TTC) آلکیل دی متیل بنزیل آمونیوم کلراید در غلظت های مختلف روی بیوفیلم باکتری ها به طور جداگانه و روی بیوفیلم مخلوط باکتری ها(سویه های اسینتوباکتر، باسیلوس و میکروکوکوس با هم)…………………………………………. 104

فصل چهارم: بحث……………………………. 107

4-1- بررسی هیدروفوبیسیتی سطح سلول های پلانکتونیک….. 107

4- 2-بررسی هم اتصالی بین سویه میکروکوکوس لوتئوس با سایر باکتری ها  109

4-3- بررسی هیدروفوبیسیتی سطح سلول های موجود در بیوفیلم    110

4-5- بررسی اتصال باکتری ها به سطوح مورد آزمایش…… 112

4-6- بررسی و ردیابی تشکیل بیوفیلم………………. 113

4-7- بررسی رشد سلول ها درون بیوفیلم…………….. 116

4-8- بحث و بررسی در مورد تعیین پتانسیل حذف بیوفیلم و کشتن سلول های درون بیوفیلم توسط بیوساید ها……………………….. 117

4-9- بررسی مدل نفوذ بیوساید به درون بیوفیلم……… 121

جمع بندی نهایی……………………………….. 123

پیشنهادات……………………………………. 124

فصل پنجم: منابع و مأخذ……………………… 125

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول: مقدمه

شکل 1-1- ……………………………………. 11

فصل دوم: مواد و روش ها

شکل 2-1-…………………………………….. 46

شکل 2-2-…………………………………….. 46

شکل 2-3-…………………………………….. 50

شکل 2-4-…………………………………….. 51

شکل 2-5-…………………………………….. 52

شکل2-6-……………………………………… 53

شکل2-7-……………………………………… 64

فصل سوم: نتایج

شکل 3-1-…………………………………….. 77

شکل 3-2-…………………………………….. 78

شکل 3-3-…………………………………….. 79

شکل 3-4-…………………………………….. 80

شکل 3-5-…………………………………….. 81

شکل 3-6-…………………………………….. 82

شکل 3-7-…………………………………….. 82

شکل 3-8-…………………………………….. 83

شکل 3-9-…………………………………….. 83

شکل 3-10-……………………………………. 84

شکل 3-11-……………………………………. 85

شکل 3-12-……………………………………. 86

شکل 3-13-……………………………………. 87

شکل 3-14-……………………………………. 88

شکل 3-15-……………………………………. 89

شکل 3-16-……………………………………. 89

شکل 3-17-……………………………………. 90

شکل 3-18-……………………………………. 92

شکل 3-19-……………………………………. 93

شکل 3-20-……………………………………. 94

شکل 3-21-……………………………………. 95

شکل 3-22-……………………………………. 96

شکل 3-23-……………………………………. 97

شکل 3-24-……………………………………. 98

شکل 3-25-……………………………………. 99

شکل 3-26-……………………………………. 100

شکل 3-27-……………………………………. 101

شکل 3-28-……………………………………. 102

شکل 3-29-……………………………………. 103

شکل 3-30-……………………………………. 104

شکل 3-31-……………………………………. 105

شکل 3-32-……………………………………. 106

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                                       صفحه

فصل اول: مقدمه

جدول 1-1-……………………………………. 17

جدول  1-2-…………………………………… 18

جدول 1-3-……………………………………. 23

جدول 1-4-……………………………………. 24

جدول 1-5-……………………………………. 25

جدول 1-6-……………………………………. 37

فصل سوم: نتایج

جدول 3- 1-…………………………………… 75

جدول 3- 2-…………………………………… 76

جدول 3- 3-…………………………………… 76

جدول 3-4-……………………………………. 80

جدول 3-5-……………………………………. 85

مقدمه

1-1- جوامع میكروبی