شهریور1392

 

 

 

 

چکیده

پیوند کلیه، درمان انتخابی برای بیماران مبتلا به مرحله نهایی بیماری کلیوی یا End Stage Renal Disease (ESRD) است. در بیماران پیوند کلیه “رد حاد پیوند کلیه” جدی­ترین عارضه محسوب می­ شود که در صورت تشخیص سریع، احتمالا برگشت­پذیر خواهد بود. شواهد زیادی وجود دارد مبنی بر اینکه آسیب اکسیداتیو به عنوان فاکتور مهم در پیدایش و پیشرفت تعدادی از بیماری­ها از جمله سرطان، بیماری­های عصبی، دیابت و بیماری مزمن کلیوی نقش دارد. آنزیم­ های NQO1 و کاتالاز ( CAT) از جمله آنزیم­ های آنتی- اکسیدانت هستند، که از سلول­ها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می­ کنند. هدف از این مطالعه، بررسی ارتباط چند شکلی ژنتیکی ژن­های CAT C-262TوNQO1 C609T  با خطر رد حاد پیوند کلیه می­باشد. در این مطالعه مورد-شاهدی 224 فرد سالم به عنوان گروه کنترل و 222 نفر بیماران پیوند کلیه شرکت داشتند. از روش PCR-RFLP جهت تعیین ژنوتیپ چند شکلی­های ژنتیکی استفاده کردیم. با توجه به نتایج بدست آمده ارتباط معنی­داری بین فراوانی ژنوتیپ­ها و آلل­های ژن NQO1 در دو جمعیت سالم و بیماران پیوندی مشاهده نشد درنتیجه می ­تواند حاکی از این باشد که فراوانی ژنوتیپی و آللی ژن NQO1 در بروز بیماری­های کلیوی منجر به پیوند کلیه نقشی ندارد. در مورد ژن CAT از مقایسه ژنوتیپ­های ژن کاتالاز در دو جمعیت سالم و بیمار اختلاف معنی­دار فقط در ژنوتیپ CT این ژن مشاهده شد که این عامل می ­تواند در آسیب­های کلیوی که سبب نارسایی شدید کلیه و در نهایت منجر به پیوند می­گردد نقش داشته باشد. (51/1=OR، 25/2=95%CI، 043/0=P) همچنین مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی این دو ژن بین دو گروه بیماران با رد حاد و فاقد رد حاد پیوند انجام شد که در ژن CAT هیچ ارتباط معنی­داری مشاهده نشد. (05/0<P) و در ژن NQO1 تنها در آلل T این ژن ارتباط در سطح معنی-داری مشاهده گردید. به این معنی که آلل T به میزان 64/1 برابر خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش می­دهد.

(64/1 =OR، 73/2-99/0 = %95 CI، 05/0 =P)

کلید واژه: پیوند کلیه، رد حاد پیوند، CAT, NQO1

 

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

فصل اول: مقدمه

1.1- پیوند کلیه ……………………………………………………………………………………………………………………. 2

2.1- رد پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………………. 4

3.1- رد حاد پیوند ……………………………………………………………………………………………………………….. 4

4.1- DGF ……………………………………………………………………………………………………………………………. 6

5.1- آنتی بادی های ضد HLA …………………………………………………………………………………………. 6

6.1- آنتی بادی علیه آنتی ژن های گروه خونی ……………………………………………………………….. 7

7.1- افزایش سن اهدا کننده و دریافت کننده پیوند ……………………………………………………….. 7

8.1- اهدا کننده بافت ………………………………………………………………………………………………………….. 8

9.1- استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت­ها …………………………………………………………………….. 8

10.1- کاتالاز ………………………………………………………………………………………………………………………… 9

11.1- NAD(P)H کوئینون اکسیدوردوکتاز1 ………………………………………………………………… 11

12.1- هدف…………………………………………………………………………………………………………………………. 12

13.1- فرضیه ……………………………………………………………………………………………………………………… 12

 

 

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

فصل دوم: بر تحقیقات پیشین

1.2- مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالاز …………………………………………………………………….. 14

2.2- مطالعات انجام شده بر روی ژن NQO1 ………………………………………………………………….. 16

3.2- مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کلیه ………………………………………………. 18

 

فصل سوم: مواد و روش ها

1.3- نمونه گیری …………………………………………………………………………………………………………………. 20

2.3- وسایل مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………. 21

3.3- محلول­های استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل ………………….. 21

4.3- محلول­های استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی­کت ………………………. 21

5.3- مواد لازم جهت انجام PCR ……………………………………………………………………………………… 22

6.3- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز ……………………………………………………………………………… 22

7.3- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود­کننده ……………………………………………. 22

8.3- استخراج DNA از خون محیطی …………………………………………………………………………….. 22

9.3- استخراج DNA از بافی­کت با کیت DNP ……………………………………………………………… 23

10.3- PCR ……………………………………………………………………………………………………………………….. 24

11.3- الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 27

12.3- رنگ­آمیزی ژل ………………………………………………………………………………………………………… 28

13.3- تحلیل آماری …………………………………………………………………………………………………………… 29

 

 

 

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

فصل چهارم: نتایج

1.4- مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعه …………………………………………………………. 31

2.4- نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتور­های دخیل در رد پیوند کلیه

و مشخصات بیماران ……………………………………………………………………………………………………………. 31

3.4- نتایج حاصل از بررسی چند­شکلی ژن CAT در افراد سالم

و بیماران پیوند کلیه …………………………………………………………………………………………………………….. 33

4.4- نتایج حاصل از بررسی چند­شکلی ژن NQO1 در افراد سالم

و بیماران پیوند کلیه …………………………………………………………………………………………………………… 34

5.4- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار ……………………………………. 35

6.4- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند

و بیماران فاقد رد حاد پیوند ………………………………………………………………………………………………… 36

7.4- بررسی ارتباط ژنوتیپ­های ژن CAT و NQO1 با ریسک

فاکتور­های رد حاد پیوند کلیه ……………………………………………………………………………………………… 38

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه ­گیری

بحث و نتیجه ­گیری ………………………………………………………………………………………………………………. 40

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

 

فهرست منابع و مأخذ ……………………………………………………………………………………………………………. 46

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

جدول 1.3- ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 20

جدول 2.3- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR ……………………………………………… 24

جدول 3.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن NQO1 …………………….. 25

جدول 4.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ­های

چند­شکلی ژنتیکی NQO1 ……………………………………………………………………………………………………….. 26

جدول 5.3-  برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن CAT ……………………….. 26

جدول 6.3-  قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های

چندشکلی ژنتیکی CAT …………………………………………………………………………………………………………… 27

جدول 1.4-  بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه

و مشخصات بیماران …………………………………………………………………………………………………………………… 32

جدول 2.4-  بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کلیه

و مشخصات بیماران …………………………………………………………………………………………………………………… 33

جدول 3.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن CAT در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه ……………………. 33

جدول 4.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه ……………….. 34

جدول 5.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنCAT  در بین گروه سالم

و بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………………….. 35

جدول 6.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1  در بین گروه سالم

و بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………………….. 35

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

جدول 7.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن CAT

در بین بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………. 37

جدول 8.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1

در بین بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………… 37

جدول 9.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژنCAT ……………………………………… 38

جدول 10.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژن NQO1 ……………………………… 38

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

شکل 1.1- ساختار ژن CAT و چند­شکلی ژنتیکی CAT C-262T …………………………………….. 10

شکل 2.1- ساختار ژن NQO1 و چند­شکلی ژنتیکی NQO1 C609T ………………………………. 11

شکل 1.3- نتایج حاصل از PCR-RFLP چند­شکلی ژنتیکی CAT C-262T

قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ………………………………………………………………………………………………… 28

شکل 2.3- نتایج حاصل از PCR-RFLP چند­شکلی ژنتیکی NQO1 C609T

قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ………………………………………………………………………………………………… 29

مقدمه

 

 

1.1-پیوند کلیه

 

پیوند کلیه به عنوان درمان انتخابی برای بیماران با مرحله نهایی بیماری کلیوی[1] (ESRD) که از عوامل مختلف ناشی می­ شود، تبدیل شده است. ESRD نشانه ای برای پیوند کلیه است که در آن میزان فیلتراسیون گلومرولی کلیه به کمتر از ml/min 15 می­رسد­. پیامد های پیوند در طول سال­های اخیر به طور قابل توجهی بهبود یافته است. (Sayegh MH et al, 2004, Keith DS et al,2005)

پیوند کلیه یک انسان به انسان دیگر بنام Renal allograft نامیده می­ شود که دهنده کلیه، انسان زنده (خویشاوند، غیر خویشاوند) یا جسد (عمومأ دچار مرگ مغزی) می­باشد. (Phadke G et al, 2011) تا سال 1389 جمعیت بیماران دچار نارسایی کلیه در ایران 320 هزار نفر بوده است که 49% این بیماران از روش درمانی پیوند کلیه، 48% از روش دیالیز خونی و 3% از روش دیالیز صفاقی استفاده می­کردند. (Zwieble William J et al, 2000)

برای پیشگیری و درمان پس زدگی عضو پیوندی از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی استفاده می­ شود. این داروها انواع متنوعی دارند که هر کدام با مکانیسم جداگانه­ ای باعث سرکوب سیستم ایمنی می­شوند و با توجه به شرایط بیمار معمولا یک ترکیب سه دارویی یا دو دارویی برای بیمار تجویز می­ شود، معمول­ترین داروهایی که استفاده می­ شود شامل: ساندیمون، سل سپت، پردنیزولون و اف کا می­باشد. به دلیل استفاده از این داروها گیرندگان پیوند کلیه در معرض ابتلا به عفونت و برخی از بدخیمی­ها می­باشند، علاوه بر موارد ذکر شده ممکن است بافت پیوندی دچار پس­زدگی شود برای پیشگیری از عوارض مطرح شده، قبل از پیوند آزمایشات کامل فیزیکی برای تشخیص و درمان مواردی که می ­تواند پس از عمل پیوند باعث بروز مشکلاتی در بیمار شود، انجام می­گیرد. تعیین نوع بافت، گروه خون و آنتی بادی، برای تعیین هماهنگی بین بافت و سلول­های دهنده و گیرنده ضروری است. گیرنده پیوند در زمان پیوند نباید هیچ گونه عفونتی داشته باشد، زیرا پس از عمل به دلیل استفاده از دارو های سرکوب ایمنی در معرض خطر عفونت قرار دارد. (Cornell et al,2008) علم پیوند کلیه در نیم قرن گذشته به طور قابل توجهی پیشرفت کرده است که عمدتأ به