فصل اول

1- مقدمه. 2

1-1- فرایند تخمیر. 3

1-1-1- مخمرها 4

1-1-2- باکتری های اسید استیکی.. 5

1-2- باکتری های اسید استیکی در سرکه. 7

1-2-1- فرآورده تخمیری سرکه. 7

1-2-1-1- خرما 7

1-2-1-2- ترکیبات تشکیل دهنده خرما 8

1-2-1-3- فرآورده های تخمیری حاصل از خرما 9

1-2-2- تولید سرکه توسط باکتری های اسید استیکی.. 10

1-3- طبقه بندی باکتری های اسید استیکی.. 11

1-4- شمارش، جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 13

1-5- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 15

1-6- پی سی آر (PCR). 15

1-6-1- تاریخچه. 16

1-6-2- اساس و روش کار. 18

1-6-3- مراحل PCR.. 19

1-6-4- پارامترهای مؤثر در PCR.. 20

1-7- مدل سازی.. 21

1-8- فرضیات پژوهش…. 25

1-9- اهداف پژوهش…. 25

فصل دوم

2-1- شناسایی باکتری های اسید استیک با بهره گرفتن از روش های مدرن.. 27

2-2- تولید سرکه زردآلو با بهره گرفتن از Acetobacter جدا شده از زردآلوی ایرانی.. 34

2-3- تولید سرکه آناناس و بررسی تاثیر متقابل بین مخمر و باکتری اسید استیکی.. 34

2-4- جداسازی و شناسایی نژاد Acetobacter از گیلاس سفید- قرمز ایرانی به عنوان نژادی با قابلیت تولید اسید بالا در تولید سرکه  36

2-5- بهینه سازی عوامل موثر در فرایند تولید سرکه با بهره گرفتن از تخمیر موز. 36

2-6- روش های مدل سازی میکروبی.. 37

فصل سوم

3-1-زمان و مکان تحقیق.. 42

3-2- مواد مصرفی.. 42

3-2-1- خارک خرمای هلیله ای.. 42

3-2-2- سرکه خرما 42

3-2-3- مواد شیمیایی.. 43

3-2-4- مواد ژنتیکی.. 43

3-3- تجهیزات… 44

3-4- اندازه گیری ترکیبات خارک خرما 45

3-4-1- اندازه گیری قند. 45

3-4-2- اندازه گیری فیبر. 46

3-4-3- اندازه گیری فسفر. 46

3-4-4- اندازه گیری کلسیم. 47

3-4-5- اندازه گیری پتاسیم. 48

3-4-6- اندازه گیری رطوبت.. 48

3-4-7- اندازه گیری خاکستر. 49

3-4-8- اندازه گیری پروتئین.. 49

3-4- مرحله جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی و شناسایی آن ها 50

3-4-1- روش کشت.. 50

3-4-2- خالص سازی باکتری های استیکی.. 51

3-4-2-1- نگهداری جدایه های باکتری های اسید استیک…. 52

3-5-آزمون های تاییدی باکتری های استیکی.. 52

3-5-1-آزمون کاتالاز. 52

3-5-2- آزمون گرم. 53

3-6- استخراج DNA از جدایه های باکتریایی.. 54

3-7- انجام PCR و تکثیر ناحیه s rDNA16. 55

3-7-1- واکنش PCR. 55

3-7-2- تعیین توالی و مقایسه توالی ها 56

3-8- مرحله تولید الکل با بهره گرفتن از مخمر. 57

3-8-1-تهیه سوسپانسیون مخمر. 57

3-9- مرحله تهیه سرکه از محلول الکلی تهیه شده از تخمیر الکلی.. 59

3-9-1- انتخاب ایزوله های باکتری اسید استیک… 59

3-9-2- تهیه سوسپانسیون باکتری ها 59

3-10- آزمون های میکروبی و شیمیایی سرکه. 61

3-10-1- آزمون میکروبی.. 61

3-10-2- آزمون اندازه گیری pH.. 61

 

3-10-3- آزمون اسیدیته. 62

3-10-4- آزمون مواد جامد محلول. 62

3-10-5- آزمون اندازه گیری الکل. 62

3-11- مدل سازی.. 64

3-12- روش آماری تحلیلی داده ها 64

فصل چهارم

4-1- اندازه گیری ترکیبات خارک… 66

4-2- جداسازی وشناسایی فلور اسید استیکی نمونه های سرکه. 67

4-2-1- بررسی خصوصیات ظاهری پرگنه ها 67

4-2-2- آزمون های ابتدایی شناسایی (تایید اسید استیک باکتریایی بودن جدایه ها) 67

4-2-3- شناسایی جدایه ها در سطح جنس و گونه. 68

4-3- انتخاب جدایه های باکتری اسید استیک…. 70

4-3- تکنولوژی تولید سرکه. 73

4-3-1- آزمون های میکروبی.. 73

4-3-1-1- تغییرات رشد سلولی مخمر Saccharomyces cerevisiae. 73

4-3-1-2- تغییرات رشد سلولی باکتری های اسید استیکی.. 77

4-3-2- آزمون های شیمیایی.. 82

4-3-2-1-تغییرات pH نمونه های سرکه. 82

4-3-2-2-تغییرات اسیدیته نمونه های سرکه. 86

4-3-2-3- تغییرات مواد جامد محلول نمونه های سرکه. 90

4-3-2-4-تغییرات الکل نمونه های سرکه. 92

4-4- مدل سازی.. 97

4-4-1- مدل سازی رشد میکروبی.. 97

4-4-2- مدل سازی عوامل موثر بر تخمیر. 100

فصل پنجم

5-1- نتیجه گیری.. 111

5-2- پیشنهادات… 114

منابع.. 115

پیوست… 127

 

جدول 1-1- واکنش مخمرها طی فرایند تخمیر الکلی.. 5

جدول 1-2- ترکیبات تشکیل دهنده خرما 8

جدول 1-3- طبقه بندی دوازده جنس خانواده Acetobacteriacea. 11

جدول 1-4- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 16

جدول 1- 5- مدل های پیشبینی رشد میکروبی.. 23

جدول 2-1- شناسایی جدایه های باکتری اسید استیکی طی اسیدیفیکاسیون سرکه توسط تکنیک های متفاوت    29

جدول2-2- مدل های آزمایشی برای تخمیر سرکه آناناس با بهره گرفتن از yeast-S. cerevisiae M30  و AAB-A. aceti WK.. 34

جدول 3-1- لیست مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش…. 41

جدول 3-2- لیست مواد ژنتیکی مورد استفاده در این پژوهش…. 42

جدول 3-3- لیست تجهیزات مورد استفاده در این پژوهش…. 42

جدول 3-4- میزان مواد استفاده شده در واکنش PCR.. 55

جدول3-5- مراحل انجام واکنش PCR.. 56

جدول 3-6- نحوه تیماربندی جهت افزودن سوسپانسیون های مخمر و باکتری.. 61

جدول 4-1- ترکیبات اصلی خارک خرما رقم “هلیله ای”. 67

جدول 4-2 جدایه های مورد استفاده در واکنش PCR.. 69

جدول 4-3- مقایسه میزان اسیدیته و pH 30 جدایه اسید استیکی.. 71

جدول 4-4- مقایسه میزان رشد، مصرف الکل، اسیدیته و pH 12 جدایه اسید استیکی.. 72

جدول 4-5- نتایج حاصل از توالی یابی جدایه ها 73

جدول 4-6- مقایسه میانگین شمارش مخمر در طول 15 روز نگهداری.. 75

جدول 4-7- مدل سازی رشد مخمر طی تخمیر الکلی سرکه خارک خرما 98

جدول 4-8- مدل سازی رشد باکتری های اسید استیکی طی تخمیر استیکی سرکه خارک خرما 99

جدول 4-9- مدل های ارائه شده برای تغییرات بریکس با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 104

جدول 4-10- مدل های ارائه شده برای تغییرات pH با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 105

جدول 4-11- مدل های ارائه شده برای تغییرات اسیدیته با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 106

جدول 4-12- مدل های ارائه شده برای تغییرات الکل با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 107

جدول 4- 13- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات بریکس…. 108

جدول 4- 14- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات pH.. 108

جدول 4- 15- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات اسیدیته. 109

جدول 4- 16- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات الکل.. 109

شکل 3-1- روش کشت سطحی.. 51

شکل 3-2- مراحل جداسازی جدایه های باکتریایی.. 53

شکل 3-3- مرحله تخمیر الکلی تولید سرکه خارک خرما 58

شکل 3-4- مرحله اسیدیفیکاسیون تولید سرکه خارک خرما 60

شکل 3-5- اندازه گیری الکل نمونه ها 63

شکل 4-1- تصویر محصولات PCR در ژل الکتروفورز. 70

شکل 4-2- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 20 درصد خارک خرما طی 15 روز  79

شکل 4-3- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 30 درصد خارک خرما طی 15 روز  80

شکل 4-4- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 40 درصد خارک خرما طی 15 روز  80

شکل 4-5- تغییرات pH در مرحله تخمیر الکلی.. 82

شکل 4-6- تغییرات pH در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 84

شکل 4-7- تغییرات اسیدیته در مرحله تخمیر الکلی.. 86

شکل 4-8- تغییرات اسیدیته در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 88

شکل 4-9- تغییرات مواد جامد محلول طی تخمیر الکلی و استیکی در غلظت 20 درصد خارک خرما طی 15 روز  90

شکل 4-10- تغییرات مواد جامد محلول با بهره گرفتن از جدایه های استیکی در غلظت 30 درصد خرما طی 15 روز  91

شکل 4-11- تغییرات مواد جامد محلول با بهره گرفتن از جدایه های استیکی در غلظت 40 درصد خرما طی 15 روز  91

 

شکل 4-12- تغییرات الکل در مرحله تخمیر الکلی.. 93

شکل 4-8- تغییرات الکل در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 94

 

پیوست “الف”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان مواد جامد محلول (TSS)  128

پیوست “ب”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان pH.. 129

پیوست “ج”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان اسیدیته. 130

پیوند “د”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان الکل.. 131

پیوست “ه”- مقایسه میانگین شمارش باکتری های استیکی در طول 15 روز نگهداری.. 132

پیوست “و”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter pasteurianus در NCBI منطبق با توالی جدایه FR22  133

پیوست “ز”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR22 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 134

پیوست “ح”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter aceti در NCBI منطبق با توالی جدایه FR43  135

پیوست “ط”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR43 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 136

پیوست “ی”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter tropicalis در NCBI منطبق با توالی جدایه FR61  137

پیوست “ک”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR61 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 138

فصل اول

 

مقدمه و کلیات

 

 

     1- مقدمه

سرکه فرآورده­ای است که از مواد مختلف قندی و نشاسته­ای از طریق تخمیر الکلی و استیکی تهیه می­ شود. سرکه می ­تواند از مواد خام مختلف و با روش­های متفاوت تولید گردد. در گذشته از سرکه به­عنوان نگهدارنده استفاده می­شد به­ طوری که یا به­صورت طبیعی در ماده غذایی تولید می­گردید و یا به آن اضافه می­شد تا از رشد میکروبی نامطلوب در ماده غذایی جلوگیری کرده و ویژگی­های حسی آن را حفظ نماید (دی اوری و همکاران، 2002). استیک اسید یک طعم­دهنده و ترکیب ضد­میکروبی در سرکه می­باشد. همچنین مطالعاتی در زمینه اهمیت اسید استیک به­عنوان یک افزودنی غذایی جهت کمک به فرایندهای غذایی به­منظور از بین بردن آلودگی قبل از توزیع و مصرف انجام گرفته است (مارشال و همکاران، 2000).

فرایندهای مورد استفاده برای تولید سرکه، شامل فرایند اورلئانز[1] (به­عنوان فرایند آهسته شناخته        می­ شود)، فرایند سریع (به نام فرایند ژنراتور نیز شناخته می­ شود) و فرایند کشت غرقابی[2] می­باشد. فرایندهای سریع و غرقابی توسعه یافته­اند و جهت تولید صنعتی و تجاری سرکه مورد استفاده می­باشند.

تولید اسید استیک طی چهار مرحله انجام می­ شود: تبدیل نشاسته به ساکارز توسط آنزیم آمیلاز، تبدیل بی­هوازی ساکارز به اتانول از طریق تخمیر الکلی توسط مخمر، تبدیل اتانول به استالدهید هیدراته و دهیدروژناسیون توسط آلدهید دهیدروژناز و تولید اسید استیک. دو مرحله آخر به­صورت هوازی وتوسط باکتری­ های اسید استیکی انجام می­گیرد (تان، 2003). باکتری­ های اسید استیکی که به­عنوان باکتری سرکه نیز شناخته می­شوند، از باکتری­ های هوازی مطلق هستند که دارای قابلیت اکسیداسیون الکل به اسید استیک می­باشند. باکتری­ های اسید استیکی به خانواده Acetobacteriacea و جنس Acetobacter تعلق دارند و برای تولید صنعتی سرکه مناسب می­باشند. باکتری­ های اسید استیکی به دلیل مقاومت بالا در برابر اسید و همچنین تنوع سوبسترای مصرفی جهت تولید انرژی، در طبیعت دیده می­شوند. این باکتری­ ها تاکنون از منابع مختلفی از جمله نوشیدنی­های الکلی،‌ سرکه، میوه­ ها، گل­ها، عسل، خاک و آب جداسازی شده ­اند. جداسازی باکتری­ های اسید استیکی با توان بالای تولید اسید و مقاوم در برابر اسید توسط محققین مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. با این وجود به دلیل دانش کمتر در زمینه فیلوژنتیکی باکتری­ های اسید استیکی همچنان نیاز به جداسازی و شناسایی این گروه باکتریایی احساس می­ شود (برگی، 1957). امروزه از آنالیز ناحیه S rDNA16 در ژن باکتری به منظور شناخت روابط فیلوژنتیکی میان باکتری­ های اسید استیکی و شناسایی آن­ها در محصولات مختلف به­ طور گسترده استفاده می­گردد. بنابراین تکثیر این ناحیه در باکتری­ های اسید استیکی توسط واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز (PCR)[3]، به­عنوان روش شناسایی سریع و دقیق، مورد استفاده قرار می­گیرد. هدف از این پژوهش در مرحله اول جداسازی و شناسایی باکتری­ های اسید استیکی موجود در سرکه خرما و در مرحله دوم استفاده از جدایه­های شناسایی شده جهت تولید سرکه خارک خرما و مدل­سازی عوامل موثر بر تخمیر این فرآورده می­باشد.

 

1-1- فرایند تخمیر

تخمیر یک فرایند متابولیک می­باشد که در سلول به­عنوان یک مسیر برای تولید انرژی به شمار می ­آید و طی آن مولکولی چون گلوگز در شرایط بی­هوازی شکسته می­ شود. در بیشتر سلول­ها این عمل در بخش حاوی مایع سیتوپلاسمی صورت می­گیرد. علم مطالعه فرایندهای تخمیری را زیمولوژی[4] می­نامند. از سال­ها پیش، فرایند تخمیر جهت تولید مواد غذایی و نوشیدنی­ها مورد استفاده قرار گرفته است. به­عنوان مثال، در محصولاتی مانند ترشی­ها، خیار شور، کیمچی، ماست، سرکه و نوشیدنی­های نخمیری فرایند تخمیر جهت تولید اسید استیک و اسید لاکتیک استفاده می­ شود. همچنین اسید موجود در این محصولات منجر به حفظ محصول در مدت زمان طولانی­تری می­ شود. فرایند تخمیر صنعتی توسط میکروارگانیسم­های مناسب و در شرایط تعریف­شده مانند غلظت مشخصی از مواد مغذی انجام می­گیرد. محصولات تولیدی حاصل از تخمیر متنوع می­باشد: الکل، گلیسرول و دی­اکسید کربن از تخمیر قندهای مختلف توسط مخمرها ؛ بوتیل الکل، استون،‌ لاکتیک اسید، مونوسدیم گلوتامات و اسید استیک توسط انواع مختلفی از باکتری­ ها و مقدار اندکی آنتی­بیوتیک، ویتامین 12B و ریبوفلاوین (ویتامین 2B) از تخمیر قارچ­ها تولید می­ شود (لیو و همکاران، 2004).

 

1-1-1- مخمرها

تخمیر الکلی یا به­صورت طبیعی و یا کشت خالص انجام می­گیرد. در تخمیر طبیعی، مخمرهای موجود در ماده اولیه فرایند تخمیر را پیش می­برند. در تخمیر به­صورت کشت خالص، نژادهای مشخصی از مخمر که معمولاSaccharomyces cerevisiae  می­باشد، انتخاب شده و با جمعیتی حدود cfu/ml107-106 به محصول تلقیح می­گردد. به­ طور کلی، تخمیر کشت خالص فرایند تخمیر سریع­تر و قابل پیش­بینی­تری محسوب می­ شود. تخمیر طبیعی متابولیت­های نهایی بیشتری تولید می­ کند و به دلیل حضور محدوده وسیع­تری از مخمرها، این نوع تخمیر جهت تولید نوشیدنی­های الکلی مورد توجه می­باشد (بوردیکون و همکاران، 2012).

در طول تخمیر الکلی، مخمرها میکروارگانیسم­های غالب را تشکیل می­دهند. ترکیب محیط تخمیر، خصوصا محتوای اسیدها و قندها، و pH محیط برای رشد مخمرها و تولید اتانول مناسب می­باشد اما از رشد و تکثیر باکتری­ ها و قارچ­ها جلوگیری می­ کند. در تخمیر طبیعی، الگوی مشخصی برای رشد مخمرها وجود دارد که در جدول 1-1 ارائه شده است. فرایند تخمیر با رشد مخمرهای مختلفی شامل Kloeckera ، Hanseniaspora ، Candida ، Metschnikowia و ساکارومایسز سرویزیه آغاز می­گردد. در برخی موارد رشد Pichia و Kluyveromyces نیز دیده می­ شود. رشد مخمرها به جز جنس ساکارومایسز، در مدت 4-2 روز اول تخمیر وجود خواهد داشت و پس از آن مخمرها از بین می­روند. با این وجود در مرحله رشد به جمعیتی در حدود cfu/ml107-106 افزایش می­یابند. علت مرگ سلول­های مخمر عدم توانایی تحمل غلظت­های بالای اتانول می­باشد که بخش عمده آن توسط ساکارومایسر سرویزیه تولید می­گردد. تحقیقاتی که در