چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1

فصل اول : مقدمه

1-1-بیان مسئله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………2

1-2-اهمیت و ضرورت تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………3

1-3-اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4

1-4-فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..4

1-5-تاریخچه اشرشیا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5

1-5-1-خانواده انتروباکتریاسه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5

1-5-2-اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….6

1-5-3-طبقه بندی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6

1-5-3-1-ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………7

1-5-3-2-ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O…………………………………………………………………………………………………………………………………….7

1-5-3-3-ساختار آن کپسولی یا آنتی ژن K………………………………………………………………………………………………………………………………………………….8

1-5-3-4-ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H………………………………………………………………………………………………………….9

1-5-3-5-ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F……………………………………………………………………………………………………………………………………9

1-6-خصوصیات مورفولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..10

1-6-1-خصوصیات کشت و بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………11

1-6-2-مقاومت……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………12

1-6-3-ژنتیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13

1-7-بیماری زایی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13

1-7-1-فاکتورهای حدت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14

1-7-1-1-کپسول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14

1-7-1-2-آندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………14

1-7-1-3-پروتئین های اتصالی فیمبریه ای………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14

1-7-1-4-اگزوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15

1-7-2-1-انتروتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

1-7-2-2-سیتوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

1-7-2-3-وروتوکسین ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………17

1-7-2-4-آلفاهمولیزین ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17

1-7-2-5-سیدروفورها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17

عنوان                                                                                                                                         صفحه

1-7-3-تغییر فاز آنتی ژنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18

1-7-3-1-سیستم ترشحی نوع III …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..18

1-7-3-2-بیماری در انسان…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18

1-7-4-1-پاتوتیپ اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………19

1-7-4-2-پاتوتیپ اشرشیا کلی توکسین زای روده ای(ETEC)………………………………………………………………………………………………………………19

1-7-4-3-پاتوتیپ اشرشیا کلی بیماری زای روده ای (EPEC)………………………………………………………………………………………………………………20

1-7-4-4-پاتوتیپ اشرشیاکلی انترواگرگتیو(EAggEC)……………………………………………………………………………………………………………………………21

1-7-4-5-پاتوتیپ اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC)……………………………………………………………………………………………………………………….21

1-7-4-6-پاتوتیپاشرشیا کلی انترواینواسیو(EIEC)……………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1-8-عفونت های اشرشیا کلی های خارج روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………….22

1-8-1-1-باکتریولوژی و مننژیت اشرشیا کلی (MAEC)………………………………………………………………………………………………………………………….23

1-8-1-2-سپسیس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-8-1-3-التهاب مثانه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23

1-8-1-4-سپتی سمی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24

1-8-2-عفونت مجاریادراری(UTI)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….24

1-8-2-1-مقاومت های آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..25

1-8-2-2-مقاومت در اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26

1-8-2-3-فیلوژنتیک اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..26

1-9-عوامل بیماری زایی(ویرولانس در اشرشیا)……………………………………………………………………………………………………………………………………………27

1-9-1-ژن aer (آئروباکتین)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28

1-9-1-2-اتصال دهنده ها (Adhesions)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….29

1-9-1-3-مکانیسم بیماری زاییUPEC در ارتباط با افمبریال ادهسین………………………………………………………………………………………………….30

1-9-1-5-مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با همولیزین (HlyA)……………………………………………………………………………………………..33

1-10-تعاریف واژه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..34

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- بررسی  تحقیقات انجام شده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-نوع مطالعه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38

3-2-جامعه مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………38

3-3-روش انجام طرح………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38

3-3-1-مواد وتجهیزات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38

3-3-1-1-دستگاه ها و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38

3-3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-3-1-3-محیط های کشت مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-4-ترکیبات و محلول های مورد استفاده در تحقیق و فرمول ساخت آنها……………………………………………………………………………………………..41

3-5-روش اجرا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43

3-5-1-جمع آوری اطلاعات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..43

3-5-2-انجام امور باکتریولوژیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43

3-5-3-نمونه برداری، کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتری ها……………………………………………………………………………………………………………43

3-5-3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43

3-5-3-2-طرز تهییه محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43

3-5-3-3-نگه داری نمونه های عفونت ادراری………………………………………………………………………………………………………………………………………………45

3-5-3-4-نگه داری سویه باکتری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

3-5-4-استخراج، تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………………….46

3-5-4-1-استخراج DNA………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………..46

3-5-4-2-کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………..46

3-5-5-انجام آزمایشات مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

3-5-5-1-پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

3-5-5-2-رقیق سازی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….49

3-5-6-انجام PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49

3-5-6-1-بهینه سازی اجزاء واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..50

3-5-6-2-بهینه سازی تهیه Master Mix ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50

3-5-7-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………50

3-5-7-1-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن  HlyA…………………………………………………………………………………..51

3-5-7-2- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Pap ……………………………………………………………………………………..51

3-5-7-3- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن  Cnf ………………………………………………………………………………… 52

3-5-7-4- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Afa ………………………………………………………………………………….. 53

3-5-7-5-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژنFim  ………………………………………………………………………………… 53

3-6-مراحل انجام PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-6-1-بهینه سازی PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-6-2-بررسی محصول PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55

3-7-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56

3-7-1-ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

3-7-1-1-طرز تهییه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….56

3-7-1-3-بافر سنگین کننده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

3-7-1-4-رنگ آمیزی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57

3-8-توالی یابی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………57

3-9-1-روش گردآوری اطلاعات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57

3-9-2-روش تجزیه و تحلیل اطلاعات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….58

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1-فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59

4-2-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………..60

4-3-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن آئروباکتین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………………………………………………..61

4-3-1-بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….61

4-3-1-1-انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….62

4-3-2-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن سایتوتوکسیک نکروز دهنده در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………..64

4-3-2-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64

4-3-2-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64

4-3-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن همولیزین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………..65

4-3-3-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..65

4-4-4- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنP – فیمبریه در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………66

4-4-4-1- بهینه سازی دمای اتصال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66

4-4-4-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

4-5-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Afaدر سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………..68

4-5-5-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..68

4-5-5-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..69

4-6-6- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنFim  در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………70

4-6-6-1- بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70

4-7-ژن های ویرولانس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72

4-8-نتایج ویرولوتایپینگ سویه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77

4-9-نتایج تایید محصولات PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………79

فصل پنجم: نتیجه گیری

5-1-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….91

5-2-مقایسه نتایج بدست آمده با یافته های دیگر محققین…………………………………………………………………………………………………………………………..91

5-3-نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….95

5-4- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..95

فهرست منابع

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………97

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..102زمون آ

جدول 1-1: ژن های ویرولانس در اشرشیا کلی و عملکرد ژن ها………………………………………………………………………………………………………………….30

جدول3-1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48

جدول 3-2: اجزاء و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………..49

جدول 3-3: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………………………………………………….50

جدول 3-4: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن HlyA………………………………………………………………………………………………………………………………………51

جدول 3-5:  برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن   Pap  ………………………………………………………………………………………………………………………………. 52

جدول 3-6: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن   Cnf ……………………………………………………………………………………………………………………………………..52 جدول 3-7: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Afa …………………………………………………………………………………………………………………………………………53

جدول 3-8:  برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………………………………………..54

جدول 4-1: مشخصات ایزوله های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران……………………………………………………………………………………………………………73

جدول 4-2: نتایج ویرولوتایپینگ درکل سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………77

جدول4-3: نتایج ویرولوتایپینگ در سویه های اشرشیا کلی، سویه های مشابه در هر ژن……………………………………………………………………….78

اشرشیا کلی                                                    Escherichia coli     E.coli                                        

واکنش زنجیره ای پلیمراز                              PCR                                           Polymerase chain reaction

عفونت مجاری ادراری Infectios                               UTI                                         Urinary Tract        

اشرشیا کلی یوروپاتوژن                        UPEC                                 Uropathogenic Escherichia coli

شکل1-1: شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………..10

شکل1-2: شکل شماتیک از نحوه اتصال باکتریE.coli  به سطح سلول های اپیتلیال سطحی بدن………………………………………………………..31

شکل1-3: شکل شماتیک از فاکتورهای ویرولانس در اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………..33

شکل1-4: شکل شماتیک از مکانیسم بیماری زاییUPEC ……………………………………………………………………………………………………………………………….34

شکل 3-1: کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….47

شکل 4-1: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن aer……………………………………………………………………………………………………………62

شکل4-1-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………….63

شکل4-1-2: نتایج PCR ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………63

شکل4-2: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Cnf ………………………………………………………………………………………………………….64

شکل4-2-1: نتایج PCR ژن Cnf در سایر ایزوله ها………………………………………………………………………………………………………………………………………….65

شکل4-3: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن HlyA ……………………………………………………………………………………………………..66

شکل4-4: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژنPap……………………………………………………………………………………………………………67

شکل4-4-1: نتایج PCR ژن Pap در سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………68

شکل 4-5: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Afa  ……………………………………………………………………………………………………..69

شکل 4-5-1: نتایج PCR ژن Afa  در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..70

شکل4-6: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………..71

شکل4-7: ژن های ویرولانس در کنار هم. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72

شکل4-8-1: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس  aer…………………………………………………………………………..79

شکل4-8-2: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس  HlyA……………………………………………………………………..81

شکل4-8-3: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس  Cnf…………………………………………………………………………83

شکل4-8-4: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Afa  …………………………………………………………………………86

شکل4-8-5: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Fim…………………………………………………………………………..88

شکل4-8-6: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانسPap…………………………………………………………………………….89

نمودار4-1: فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59

نمودار4-2: فراوانی بیماران براساس سن (سال)…………………………………………………………………………………………………………………………………………..60

نمودار4-3: نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی……………………………………………………………61