فهرست مطالب

عنوان                                   صفحه

 فصل اول  معرفی.. 1

1- 1- مقدمه. 2

1- 2- اهمیت و ضرورت تحقیق.. 2

1- 3- فرضیات واهداف تحقیق.. 4

 فصل دوم  مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین.. 6

2- 1- کوتین.. 7

2- 1- 1- جداسازی کوتین.. 12

2- 1- 2- دپلیمریزاسیون کوتین.. 12

2- 1- 3- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین.. 13

2- 3- آنزیم کوتیناز 16

2- 3- 1- کلون و بیان کوتیناز 18

2- 3- 2- ساختار کوتیناز 19

2- 3- 3- عملکرد کوتیناز 26

2- 3- 4- کاربردهای کوتیناز 27

2- 3- 5- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول. 29

2- 3- 6- عملکرد کوتیناز در واکنشه­ای هیدرولیزی و سنتزی.. 33

2- 3- 7- ترانس استریفیکاسیون. 35

2- 3- 8- پایداری کوتیناز 36

2- 3- 9- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز 38

2- 3- 10- مکانیسم عمل کوتیناز 39

2- 3- 11- مقایسه­ آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی.. 41

2- 4- نشانگرهای ژنتیکی.. 42

2- 5- نشانگرهای مورفولوژیکی.. 42

2- 6- نشانگرهای مولکولی.. 43

2- 7- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی.. 44

2- 8- نشانگرهای DNA.. 45

2- 8- 1- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR.. 46

2- 8- 2- نشانگرهای مبتنی بر PCR.. 46

2- 9- نشانگرهای غیر اختصاصی.. 47

2- 9- 1- RAPD.. 47

2- 10- نشانگرهای اختصاصی.. 48

2- 10- 1- AFLP. 48

2- 10- 2- SSR.. 48

2- 10- 3- RFLP-PCR.. 50

2- 10- 4- RFLP Based PCR با اتصال ناقص… 51

 فصل سوم  مواد، تجهیزات و روش تحقیق.. 52

3- 1- استخراج کوتین.. 55

3- 2- نمونه برداری.. 55

3- 3- غربالگری و جداسازی گونه­ های تولیدکننده آنزیم کوتیناز 55

3- 4- تهیه slant از سویه­های جدا شده 57

3- 5- نگهداری طولانی مدت سویه­ها 57

3- 6- تهیه گلیسرول. 58

3- 7- تهیه محیط کشتLB.. 58

3- 8- Assay آنزیمی.. 58

3- 9- Assay ویژه آنزیمی.. 60

3- 10- استخراج DNA.. 60

3- 10- 1- استخراج DNA  به روش جوشاندن. 60

3- 10- 2- استخراج DNA به رو ش CTAB.. 61

3- 10- 3- روش استخراج DNA با کیت.. 64

3- 11- اندازه ­گیری کیفیت و غلظت DNA.. 65

 

3- 12- رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید. 69

3- 13- واكنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction. 70

3- 14- راه اندازی واکنش PCR.. 74

3- 15- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD.. 76

3- 16- توالی­یابی سویه­های تولیدکننده آنزیم کوتیناز با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 77

3- 17- الکتروفورز محصولات واکنش PCR.. 78

فصل چهارم. 80

4- 1- بررسی میزان کوتین در میوه­ های مختلف.. 81

4- 2- جداسازی سویه­ها 87

4- 3- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونه­ها 87

4- 4- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج. 88

4- 5- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی 6 سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD.. 89

4- 6- نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس نشانگر RAPD.. 89

4- 7- تجزیه به مختصات اصلی.. 90

4- 8- نتایج تجزیه باندهای حاصل از 8 پرایمر RAPD.. 92

4- 9- ضریب همبستگی کوفنتیک… 93

4- 10- شناسایی و توالی یابی سویه­ها با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 93

 فصل پنجم. 95

5- 1- استخراج کوتین.. 96

5- 2- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز 97

5- 3- استخراج DNA.. 98

5- 4- تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگر RAPD.. 98

پیشنهادات.. 100

6- 1- پیشنهادات.. 101

 

فهرست جدول‌ها

جدول ‏2‑1 مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنی­کهای مختلف… 24

جدول ‏2‑2 فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گستردهای از سوبستراها 29

جدول ‏2‑3 روش­های آماده ­سازی کوتیناز 30

جدول ‏3‑1 مواد مورد استفاده در پایان نامه . 53

جدول ‏3‑2 مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA… 61

جدول ‏3‑3 مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) 68

جدول ‏3‑4 مشخصات پرایمرهای RAPD… 73

جدول ‏3‑5 مواد مورد نیاز PCR.. 75

جدول ‏3‑6 مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده 76

جدول ‏3‑7 برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD… 76

جدول ‏3‑8 برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای 16S rDNA.. 77

جدول ‏3‑9 مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای16S rDNA.. 78

جدول‏3‑10 16S rDNA primer. 78

جدول ‏4‑1بررسی میزان کوتین.. 82

جدول ‏4‑2 بررسی میزان کوتین در خیارسبز. 83

جدول ‏4‑3 بررسی میزان کوتین در سیب زرد. 84

جدول ‏4‑4 بررسی میزان کوتین در سیب قرمز. 85

جدول ‏4‑5 تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه­ ها 85

جدول‏4‑6 مقایسه میانگین میوه­ ها به روش دانکن در سطح احتمال 1% برای صفت وزن کوتین نهایی.. 86

جدول ‏4‑7 فعالیت کوتینازی 6 نمونه. 88

جدول ‏4‑8  نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه­ها 89

فهرست شکل‌ها

شکل ‏2‑1 ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی 51000 برابر. 9

‏2‑2 مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید. 10

شکل ‏2‑3 نمایش شماتیکی از کوتیکول.. 11

شکل ‏2‑4 a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی­های کوتین میوه گوجه­ فرنگی با میکروسکوپ الکترونی.. 11

شکل ‏2‑5 a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز 16

شکل ‏2‑6 هیدرولاز آلفا و بتا 20

شکل ‏2‑7 ساختار کوتیناز 21

شکل ‏2‑8 توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز 28

شکل‏2‑9 مکانیسم عمل کوتیناز 40

‏2‑10 گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41

شکل ‏2‑11نمودار دما و pH… 41

شکل ‏2‑12 دسته­بندی نشانگرهای ژنتیکی.. 44

شکل ‏3‑1 تهیه ژل آگارز 68

شکل ‏4‑1مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه­ فرنگی.. 81

شکل ‏4‑2 مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز. 82

شکل ‏4‑3 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد. 83

شکل ‏4‑4 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز. 84

شکل ‏4‑5 مقایسه میزان کوتین.. 86

شکل ‏4‑6 میزان فعالیت سویه­ها 88

شکل ‏4‑7 دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای 9 پرایمر RAPD با روش UPGMA… 90

شکل ‏4‑8 پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 91

شکل ‏4‑9پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 92

شکل ‏4‑10 ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1% با بهره گرفتن از پرایمرها 93

شکل ‏4‑11ژل الکتروفورز با آگارز 1% با پرایمرهای 16S rDNA.. 94

 

چکیده

کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­ کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیه­ی آنزیمی آن اولین گام در فرایند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه­ آنها در میوه­ های مختلف و غربالگری باکتری­ ها و قارچ­های تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه   16S DNA می­باشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویه­های بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار می­آید. بدین منظور پوست میوه­ های مختلف را جمع­آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شست­و­شو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان می­داد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماری­ها مقاوم­تر است. در مرحله­ بعد جداسازی سویه­ای تولیدکننده آنزیم از نمونه­های مختلف انجام شد. نمونه­ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویه­های غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده