فهرست مطالب                                                                     عنوان

خلاصه فارسی1. .. ..

مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

(1-1 تاریخچه پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

(2-1 تقسیم بندی پیکورنا ویورس ها ……………………………………………………………………………………………………………………………….  4

(3-1 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ………………………………………………………………………………………………………………………………… 8

(4-1 ساختمان پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

(5-1 ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………..  13.

(6-1 سیکل تکثیر پیکورنا ویورس ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 16.

(7-1 ترجمه ژنوم پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………… 23

(8-1 پردازش پلی پروتئین در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………. 23

(1-8-1 پروتئین L …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 24

(2-8-1 پروتئین 2A ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24

(3-8-1 پروتئین 3C ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24.

(9-1 تکثیر ژنوم و سنتز mRNA ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 25.

(1-9-1 RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی …………………………………………………………………………………………………………. 26

(2-9-1 پروتئین 3D  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26

(10-1 نقش پروتئین های کمکی در تکثیر ژنوم ……………………………………………………………………………………………………………. 27

(1-10-1 پروتئین 2B ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27

(2-10-1 پروتئین 2C ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27

(3-10-1 پروتئین 3AB ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 27.

(4-10-1 پروتئین فرعی سلول ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28.

(5-10-1 پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA …………………………………………………………………………………………….. 28.

(11-1 محل سنتز RNA در سلول ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 29

(12-1 چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر ……………………………………………………………………………………….. 31

(13-1 مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی …………………………………………………………………………………………………………………….. 32

(14-1 پاراکوویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33

(1-14-1 جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروس ………………………………………………………………………………………………………. 33

(2-14-1 پروتئین های پاراکوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

(3-14-1 پردازش پروتئین در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………… 35

(4-14-1 توالی 5´-UTR در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………….. 36

(5-14-1 ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها با پیکورنا ویروس های دیگر …………………………………………………………………………… 38

(6-14-1 تداخلات بین HPeV1-2 با سطح سلولهای حساس  ………………………………………………………………………………………39

(7-14-1 عوارض کلینیکی و اپیدومیولوژی پاراکوویروس ها ……………………………………………………………………………………………. 41

(8-14-1 ویروس های مرتبط با پاراکوویروس ها در حیوانات …………………………………………………………………………………………. 41

جداول:

جدول 1) اعضای خانواده پیکورنا ویریده ………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس …………………………………………………………………… 19

جدول 3) میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بینHPEV-1  وHPEV-2   …………………………………………………………..43 .

جدول 4)  تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55

جدول 5) تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………….57

جدول 6) توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه5´ UTR ……………………………………………………………………….. 59

جدول 7) نتیجه مقایسه سکانس توالی های 5UTR  با بانک ژنی به روش blast…………………………………………………………………. 65

جدول 8 )نتایج blast محصول PCR ………………………………………………………………………………………. …………………………………………….73

 

جدول 9- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR……………….76

جدول10 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب جنس . …76

جدول11- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب سن.. . …76

جدول 12- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب فصل .. ….76

نمودار:

نمودار1- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR .. ….77

نمودار-2 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب جنس …77

نمودار-3 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب سن .. …..78.

نمودار4 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت  برحسب فصل .. …78

 اشکال:

شکل 1) نمای شماتیک کپسید ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 9 ..

شکل 2) دیاگرام شماتیک 8 زنجیره β .. ……………………………………………………. 11

شکل 3) مدلی از پولیوویروس تیپ 1 . . ………………………… 11

شکل 4) تداخلات میریستات با پروتئین های سطح ویروس  …………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 5) تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 13

شکل 6) دو تیپ اصلی از IRES در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………… 15

شکل 7) چرخه تکثیر پیکورناویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………… 17

شکل 8) تصویر شماتیکی از Canyon …………………….20

شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP1 ……………………………………………………………………………………………… 20

شکل 10) مدل دخول پیکورنا ویروسها به درون سلول ………………………………………………………………………………………………………. 22

شکل 11) مکانیسم فرضی برای عبور RNA پیکورنا ویروس ها از عرض غشا ……………………………………………………………….. 22

شکل 12) تصویر سه بعدی از 3C pro ویروس هپاتیت A ، 2A pro رینو ویروس و  FMDV Lpro …………………………… 25 ..

شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتدای ژنوم پیکورنا ویروسها، محل کلیواژ vpg………………………………………………………….. 29 …

شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئین …………………………………………………………………… ………………………………………………….. 30

شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………… 31

شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD pro در این مرحله ……………………………………………….. 32

شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویرس ها ……………………………………………………………………………………………………………………… 33

شکل 18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………… 36

شکل 19) دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه ………………………………………………………………………………………………………………………… 37

شکل 20) دندروگرافی براساس پروتئین  VP3 در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………… 38

شکل 21) مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوسیلی از VP1 در بین پاراکوویروس ها و CAV ………………………. 39.

شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکوویروس انسانی تیپ 1 ……………………………………………………………………………………….. 40

شکل 23) ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروس ها و ایزوله های تازه جداشده از ویروس L jungan درحیوانات……………..42

 فصل اول

کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44

• بیان مساله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45

(2-1 فرضیه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46                                                            (3-1اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

1-4)ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47                                                               

فصل دوم

مروری بر متون گذشته………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48

                                                                 فصل سوم 

مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51

(1-3آماده سازی میكروتیوب و سرسمپلرها…………………………………………………………………………………………………………………………52

(2-3  مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون ……………………………………………………………………………………………………………………………..52

(3-3 جداسازی RNA و ساخت cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………….53

(4-3سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-5) Compatent……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55

3-6) ترا نسفورم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56

Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید)……………………………………………………………………………………………………………58

PCR (8-3……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

(9-3 روش تهیه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60

(10-3 روش آماده سازی مارکر 1kb……………………………………………………………………………………………………………………………………60

11-3)تکنیک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61

(12-3تهیه بافر الكتروفورز 1x………………………………………………………………………………………………………………………………………………61

(13-3روش استخراج DNA‌از ژل …………………………………………………………………………………………………………………………………….61

فصل چهارم

نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

مقایسه blast برخی توالی های مثبت با توالی موجود در بانک ژنی…………………………………………………………………………………..66

                                                                 فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….80

نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84

توصیه ها و پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………..85

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86

خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………….100.          

خلاصه:

پار اکو ویروس انسانی که به خانواده پیکورنا ویروس ها تعلق دارد, بدون غشا بوده و دارای ژنوم   RNAتک رشته با قطبیت مثبت می باشد . اندازه ژنوم این ویروسKb 4/8 – 2 /7می باشد. این ویروس با بروز عفونت های گوارشی و تنفسی و گاهی عفونت های سیستم اعصاب مرکزی مرتبط است. از آنجا یی که هیچ اطلاعات درستی در مورد ژنوتایپ این ویروس در ایران وجود نداشته است این مطالعه  به منظور تشخیص سریع , تعیین ژنوتایپ این ویروس در نمونه های مدفوع کودکان  ایرانی زیر چهار سال مبتلا به گاستروآنتریت طراحی شده است. RNA از سوسپانسیون مدفوع استخراج شده وcDNA  تهیه  گردید و nested PCR  با پرایمرهای اختصاصی انجام شد و محصول  PCRاز ژل آگارز استخراج و تعیین توالی گردید . نتایج نشان داد که تکنیک RT-PCR برای تشخیص مستقیم HPeV  در نمونه های کلینیکی کاربردی تر, حساس تر , سریعتر از  روش کشت سلولی می باشد. این موضوع تایید میکند که روش RT-PCR روشی برتر برای تشخیص این ویروس درزمانی کوتاهتر و با هزینه کمتر می باشد. همچنین تشخیص سریع می تواند مانع مصرف بی رویه آنتی بیوتیک گردد.

کلمات کلیدی :  پیکورناویروس- پاراکوویروس انسانی- گاستروآنتریت

مقدمه

 

1-1 )تاریخچه پیکورنا ویروس:                                                                                                                                                                                                                                       

پیکورنا ویروس ها دلیل نام آنها کوچکی آنهاست که پیکو(Pico) به زبان آلمانی به معنای کوچک است یعنی  ویروسهای کوچک RNA دار, و پاراکوویروس از خانواده پیکورنا ویروس ها می باشد.

پیکورنا ویروس ها، ویروس های کروی شکلی هستند که دارای ژنوم RNA ی تک زنجیره با قطبیت مثبت  (+ssRNA)  می باشند.اندازه این ویروس ها از kb 7.2 در (ردیف ویروس انسانی) تا Kb 7.4 در (پولیوویروس، هپاتیتA) و تا kb8.4 در (آفتو ویروس ها) متغیر است (1).

پیکورنا ویروس ها نقش شگرفی در پیشرفت ویروس شناسی مدرن داشته اند، به طوریکه FMDV[1] اولین ویروس حیوانی بود که در سال 1898 توسط Frosch , Loeffler کشف گردیده. ده سال بعد در اواخر قرن بیستم، با ظهور اپیدمی پولیومیلیت شاهد ایزوله شدن عامل این عفونت (پولیوویروس) توسط popper , landsteinerk بودیم. 40سال بعد دریافتند که پولیوویروس قادر است در کشت سلولی رشد نماید. این یافته آغاز راهی برای مطالعه تکثیر ویروسها بود.

چکیده

خسارات ناشی از دما های سرد بحرانی بویژه در اکوسیستم های طبیعی و مناطق پرجمعیت شهری در حال افزایش است. ایران مرکزی سرزمینی خشک و مستعد رخداد سرما بویژه طی زمستان است و فاقد منابع تعدیل کننده تنش های دما مانند منابع آب و پوشش گیاهی انبوه است. در تحقیق حاضر برای تعیین امواج سرمای ایران مرکزی، داده های دمای بیشینه روزانه مربوط به مجموع هشت شهر شامل شاهرود، تهران، سمنان، کاشان، اصفهان، یزد، کرمان و بم تهیه و دماهای صفر و زیرصفر آنها به عنوان امواج سرما استخراج شد. بر این اساس، تعداد 47 موج سرما در بازه آماری (1980-2012) شناسایی شد و در دومین مرحله بر پایه 2 معیار زمانی و مکانی یعنی به ترتیب دو روز دوام و درگیری دو ایستگاه و بیشتر، 17 مورد سرمای بحرانی تعیین شد. گشایش پرونده های داده های ترازی هوا تهیه شده از بایگانی NCEP/NCAR، تبدیل آنها به پوشه های متنی طی تاریخ های سرماهای بحرانی و رسم نقشه های هوای روزانه و ترکیبی با بهره گرفتن از نرم افزار Surfer سه مرحله از کار بود که به طراحی الگوهای همدید برای تعیین تراز و سمت غالب فرارفت هوای سرد سیبری انجامید. نتایج نشان داد که فرارفت سرما بسوی ایران مرکزی طی 70 درصد مواقع در پایین ترین ترازها (ترازهای دریا و 1000 هکتوپاسکال) و در قالب زبانه های پرفشار سیبری رخ داده است و تنها در 12 درصد اثر پرفشار ارتفاعی تبت و 17 درصد اثر پرفشارهای سرد مهاجر (غربی) آشکار شد.

     تحلیل الگوهای های بردار باد و دما در تراز 1000 ه. پ برای آزمون سمت فرارفت هوای سرد طی روزهای رخداد سرماهای بحرانی نشان داد که بردارهای باد در 70 درصد مواقع (12 مورد از 17 مورد)، از سمت جنوب شرق به عنوان دنباله بادهای شرقی از روی افغانستان و پاکستان و گاهی هم از سمت شمال شرق و شرق بر گستره ایران مرکزی راه یافته اند.

کلیدواژه ها: ایران مرکزی، سرمای بحرانی، فرارفت شرقی.

 چکیده فارسی.. n

تشکر. n

تقدیم.. n

فهرست مطالب… ………الف

فهرست شکل ها ح

فهرست جدول ها د

1-1. بیان مسأله. 2

n توده هوای عموما گرم وخشک ناشی از پرفشاره جنب حاره 2

nتوده های هوای سرد و خشک ناشی از پرفشار سیبری.. 2

n توده های هوای اقیانوسی مدیترانه ای ناشی از ورود بادهای غربی  2

n توده هوای نسبتا گرم و مرطوب ناشی از ورود زبانه های کم فشار سودانی  3

1-1-1. اهمیت سرماهای بحرانی از نظر محققان.. 3

n به لحاظ مفهومی.. 3

n به لحاظ کمی.. 3

n به لحاظ پیامدها و زیان ها 4

1-1-2. اهداف تحقیق.. 5

1-2. پیشینه تحقیق.. 5

n تحقیقات مربوط به شرایط و چگونگی تشکیل پرفشار سیبری  6

n تحقیقات مربوط به روابط پویشی پرفشار سیبری با دیگر سامانه های دور در قالب پیوند از دور 6

n تحقیقات مربوط به قلمرو گسترش زبانه های هوای سرد پرفشار سیبری  7

n تحقیقات مربوط به شرایط زمانی و مکانی پرفشار سیبری در سرزمین ایران  8

2-1. بنیادهای پژوهش…. 10

2-1-1. هوا 10

2-1-2. آب وهوا 11

2-1-3. دما 11

2-1-4. تغییرات دمایی.. 11

2-1-5. آستانه. 12

2-1-6. حداکثر دمای روزانه. 12

2-1-7. حداقل دمای روزانه. 12

2-1-8. روز سرد. 12

2-1-9. دمای بحرانی.. 12

2-1-10. وزش هوا 12

2-1-11. فرارفت هوای سرد. 12

2-1-12. فشار 13

2-1-13. شیب تغییرات فشار 13

2-1-14. توده های هوا 13

2-1-15. مفهوم همدید. 13

2-1-16. نقشه های هوا 13

2-1-17. ایستگاه همدید. 14

2-1-18. آب و هواشناسی همدید. 14

2-1-19. ناوه (زبانه کم فشار) 14

2-1-20. پشته (زبانه پرفشار) 15

2-1-21. پرفشارها (آنتی سیکلون) 15

2-1-22. پرفشارهای گرمایی.. 15

2-1-23. پرفشار های پویشی.. 16

2-1-24. نقشه سطح متوسط دریا 16

2-1-25. نقشه های ترازهای بالای جو. 16

2-1-26. نقشه های هم ارتفاع ژئوپتانسیل.. 16

2-1-27. پرفشار سیبری.. 17

2-1-28. عامل اصلی تشکیل پرفشار سیبری.. 18

2-1-29. گسترش پرفشار سیبری روی ایران.. 19

2-1-30. پرفشار جنب حاره 19

2-1-31. بادهای غربی.. 19

2-1-32. کم فشار سودان.. 19

2-1-33. واچرخند عربستان.. 20

2-2. سرزمین پژوهش…. 20

 

 

2-2-1. سیمای طبیعی ایران مرکزی.. 20

2-2-2. پهنه های آبی اثر گذار بر ایران مرکزی.. 22

< دریای مدیترانه. 22

<دریای سرخ و خلیج عدن.. 22

<دریای سیاه 22

2-2-3. پراکنش دما 23

2-2-4. میانگین دمای ماهانه. 24

2-2-5. دمای بیشینه مطلق ماهانه. 25

2-2-6. دمای کمینه مطلق ماهانه. 26

2-2-7. بارش سالانه. 27

2-2-8. میانگین ماهانه بارش…. 28

2-2-9. پراکنش فشار 30

2-2-10. میانگین ماهانه سمت و سرعت باد غالب در هشت ایستگاه نمونه  32

3-1. پرسش‌های پژوهش…. 36

3-2. فرضیات پژوهش…. 36

3-3. گزینش سرزمین پژوهش و ایستگاه های داده سنجی.. 36

3-4. منابع داده ها 38

3-5. تعیین ویژگی های عمومی آب‌وهوایی سرزمین پژوهش…. 38

3-6. مراحل شناسایی و استخراج موج های سرما 39

3-7. معیار تعیین موج های سرما 42

3-8. معیار تعیین موج سرمای بحرانی.. 42

3-9. معیار تعیین روز اوج سرمای بحرانی.. 42

3-10. مراحل آزمون فرضیه نخست تحقیق.. 43

3-10-1. تهیه داده های ترازی.. 43

3-10-2. تبدیل داده های فشرده به متن.. 43

3-9-3. تعیین محدوده طراحی الگوهای همدید. 43

3-10-4. تبدیل داده های رقومی به نقشه. 44

3-10-5. ترسیم نقشه های ارتفاعی.. 45

3-10-6. تعیین بیرونی ترین پربند بسته برای هر سرما 46

3-10-7. تعیین پربند پشتیبان پرارتفاع سیبری.. 47

3-11. مراحل آزمون فرضیه دوم. 47

3-11-1. رسم نقشه های بردار باد. 47

3-11-2. رسم نقشه های خطوط جریان باد. 48

3-11-3. رسم نقشه های دما 48

3-11-4. کمی کردن نقشه های بردار باد. 48

3-11-5. اسکریپت نویسی میانگین بردارهای باد. 48

3-11-6. اسکریپت نویسی تعیین جهت و سمت غالب بردارهای باد 49

3-11-7. فراخوانی اسکریپت dat.gs به محیط GrADS. 50

3-11-8. کارتوگرافی و تکنیک رسم نقشه ها 52

4-1. تحلیل آماری 47 موج سرماهای بحرانی 53

4-1-1. سه ویژگی سرماهای بحرانی.. 55

<دوام. 55

<شدت… 56

<گسترش مکانی.. 56

4-1-2. نتایج آماری سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 57

4-2. نتایج همدید سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

4-2-1. نقش پرفشار سیبری در سرماهای بحرانی ایران مرکزی.. 58

<تراز دریا 65

<تراز 1000 ه.پ… 67

<ترازهای 750 و 500 ه.پ… 69

<تحلیل موقعیت پربند پشتیبان.. 73

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 1000 ه.پ… 74

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 750 ه.پ… 75

<تحلیل الگوهای همدید- تراز 500 ه.پ… 76

4-2-2. نقش فرارفت های شرقی در سرماهای بحرانی ایران مرکزی  77

<سمت باد، دما و خطوط جریان در ترازهای بالا. 77

<تحلیل سرعت و سمت میانگین باد. 87

<تحلیل الگوهای بردار باد در تراز 1000 ه.پ… 88

5-1. آزمون فرض…. 90

5-2. نتیجه گیری.. 91

5-3. پیشنهادها 92

5-4. تنگناهای تحقیق.. 92

<سرچشمه ها 93

<چکیده لاتین.. 97

تغییر در بسامد بلایای آب و هوایی مانند موج های سرما یکی از مهمترین جنبه های تغییر آب و هوا است (کنکال و همکاران؛ 1999). همه ساله افراد زیادی با گسترش و وقوع موج های گرم و یا بوران های سرمایی هلاک می شوند (علیجانی،1390). در این میان دماهای بسیار سرد به عنوان خطر یا بحران برای انسان تعریف شده اند. اساسا عنصر دما از دیرباز مورد توجه آب وهواشناسان بوده (عساکره؛ 1388)، تغییرات کوتاه مدت و درازمدت آن می ­تواند ساختار آب و هوای هر محل را دگرگون سازد.

     بر اساس گزارش هیأت بین الدول آب وهوا (IPPC. 2001)دمای سطح کره زمین در فاصله زمانی 1861-2001 میلادی حدود 0.6 درجه سانتی گراد افزایش یافته است. این درحالی است که رفتار فراسنج دمای حداقل و حداکثر با یکدیگر متفاوت بوده، دمای حداقل به طور آشکاری نرخ افزایشی داشته است. با وجود افزایش دمای حداکثر، نرخ آن از نرخ دمای حداقل کمتر بوده است (کارل و همکاران،1993).

     از این رو بنا به قول شعبانی و همکاران (1392: 896)، مدلسازی متغیرهای حدی دمای هوا و پیش بینی دماهای حداکثر و حداقل به عنوان یکی از مهمترین پارامترهای آب وهوای با توجه به تغییرات آب وهوایی، گرمایش جهانی و خشکسالی­ها، قطعاً فرصت بیشتری را جهت برنامه ریزی و ارائه تمهیدات لازم به خصوص در آب و هواهای خشک و نیمه خشک در اختیار برنامه ریزان قرار می دهد.

1-1). بیان مساله

ایران به دلیل گستردگی زیاد در طول و عرض جغرافیایی، پیچیدگی در پیکربندی ناهمواری ها و یورش توده های هوا با خاستگاه های گوناگون، از نظر دمایی شرایط ویژه ای دارد. تکرار توده های هوایی که به وسیله سامانه های چرخندی و واچرخندی و یا گسترش زبانه های آنها به ایران می رسند و شرایط رطوبتی و دمایی هوای روزمره را تعیین می کنند؛ در درازمدت، شرایط آب و هوایی ایران را به وجود می آورد (علیجانی،1383: 37).

   سرزمین ما به دلیل شرایط جغرافیایی خاص، یعنی موقعیت آن در رابطه با گردش عمومی جو و قرار گرفتن آن در عرضهای جغرافیایی میانه، در فصول مختلف سال تحت تاثیر آنتی سیکلونهایی با منشاهای مختلف و خصوصیات فیزیکی گوناگون قرار می گیرد، از جمله این آنتی سیکلون ها، پرفشار سیبری است که مهم ترین مرکز کنش جوی اوراسیا طی زمستان است و اثر محسوسی بر آب وهوای ایران دارد (لشکری 1375: 4).

   از جمله سامانه های موثر بر توده هوای وارد شونده به سرزمین ایران می توان به موارد زیر اشاره کرد؛

n توده هوای عموما گرم و خشک ناشی از پرفشاره جنب حاره: پرفشاره جنب حاره، سامانه پویشی (دینامیکی) بزرگی در مقیاس سیاره ای است که کانونی روی اقیانوس اتلس شمالی دارد. در دوره گرم سال زبانه ای از پرفشار جنب حاره روی ایران است. قلمرو این زبانه از تراز 700 تا 1000 ه.پ گسترش دارد و سبب حاکمیت هوایی گرم و خشک بر بخش بزرگی از ایران (شبانکار و جلبیان، 1389: ص 48)، بویژه در سرزمین های دور از ساحل می شود. با حرکت پرفشارجنب حاره و رودباد همراه با آن به عرض های پایین تر، از ماه دسامبر و ورود بادهای غربی به ایران در دوره سرد سال (امام هادی، 1383: 36) می توان شاهد ورود توده های هوایی دیگری بود.

n توده های هوای سرد و خشک ناشی از پرفشار سیبری: پرفشار سیبری از میانه ی مهر تا میانه ی فروردین بر آسیا حاکم است. این سامانه نقش دمایی مهمی در ایران بازی می کند و چنانکه پیش از این براتی و علیجانی (1378: 55)، تحقیق کرده اند، طی فصل بهار زبانه های سرمای آن از شمال شمال شرق و گاهی شمال غرب به ایران نفوذ می کنند. مسعودیان (1386: 22) نیز به گسترش این هوای بسیار سرد و خشک بر بخش هایی از کشور اشاره دارد.

n توده های هوای اقیانوسی مدیترانه ای ناشی از ورود بادهای غربی: دریای مدیترانه در مسیر بادهای غربی قرار دارد و اثرات آن از طریق این باد ها به ایران گسترش می یابد. در دورۀ سرد سال بر اثر استقرار فرود بلند مدیترانه، سامانه های غربی فشار هوا اعم از موج های سطح بالا و چرخندهای روی زمین به طرف ایران می آیند. از این رو رطوبت بارندگی ها در دورۀ سرد سال به وسیلۀ سامانه های مهاجر دریای مدیترانه تأمین می شود (علیجانی؛1391).

n  توده هوای نسبتا گرم و مرطوب ناشی از ورود زبانه های کم فشار سودانی: کم فشار سودانی که در شمال آفریقا تشکیل می شود و در فصل تابستان به صورت یک کم فشار حرارتی عمل می کند و در زمستان رفتار پویشی دارد .هر گاه کم فشار سودانی و مدیترانه ای با هم مرتبط شوند، ناوۀ عمیق در شرق مدیترانه به وجود  می آید و موجب ورود توده های نسبتاً گرم و مرطوب و بارش های سنگین در اغلب نقاط ایران می شود (جوانمرد و همکاران،1382).

1-1-1). اهمیت سرماهای بحرانی از نظر محققان

دما از مهمترین عناصر آب وهوایی است و تغییرات ناگهانی آن به ویژه افت دما به مقادیر زیر صفر درجه، منشأ بسیاری از تحولات فیزیکی، شیمیایی و زیست محیطی است. به همین دلیل، بررسی روند دما در مقیاس های مختلف زمانی و مکانی مورد توجه محققان بوده، بخش بزرگی از ادبیات آب وهوا شناسی را به خود اختصاص داده است. در این مجال به بیان اهمیت موضوع دماهای بحرانی سرد از سه جهت می پردازیم:

<به لحاظ مفهومی : هن و همکاران (2009)، در تحقیق خود یک موج سرد را با عنوان یک کاهش دمای سریع و غیرمتعارف برای یک دوره کوتاه مدت 24 ساعته روزانه تعریف کرده اند البته نه سرد مطلق بلکه سردی نسبی معادل انکه انسان کاهش درجه حرارت را احساس کند.

مشکلاتی که هر ساله دماهای بحرانی سرد در مناطق مختلف جغرافیایی و بخصوص منطقه ایران مرکزی به وجود می آورند باعث شده که موضوع مطالعه این دماها اهمیت علمی و کاربردی پیدا کرده، اثرات مختلف این دماها بررسی شود. این اثرات از جمله شامل ترکیدن لوله های آب، دیواره استخرها و حوض ها، بروز بیماری های واگیردار زمستانی مانند سرماخوردگی آنفلوانزایی، سارس و آلودگی هوا و مصرف زیاده از حد سوخت، مرگ و میر حیوانات وحشی و هجوم آنها به مراکز زیست انسانی، وقوع اینورژن های حرارتی و تشعشعی است (قویدل رحیمی و خوشحال دستجردی، 1389: 180).

<به لحاظ کمی : گاوس و همکاران (2014)، اندازه گیری هوای سرد بحرانی را از طریق شاخص های مختلف آب و هوایی از جمله آستانه های بحرانی (دمای زیر 15- درجه)، سرمازدگی (تعداد روزهایی که دمای حداقل زیر صفر باشد)، یخبندان (تعداد روزهایی که دمای حداکثر روزانه زیر صفر درجه باشد) و شاخص مدت زمان دوام سرما (مثلاً، شش روز متوالی دمای حداکثر روزانه پایین تر از صدک دهم باشد) می داند.

<به لحاظ پیامدها و زیان ها : بسیاری از بحران های ایجاد شده به طور کلی خطر نامیده می شوند و بیشتر از شرایط آب و هوای نشأت می گیرند (علیجانی،1390). مشکلاتی که هر ساله دماهای بحرانی سرد در مناطق مختلف جغرافیایی و بخصوص منطقه ایران مرکزی به وجود می آورند باعث شده که موضوع مطالعه این دماها اهمیت علمی و کاربردی پیدا کند. اثرات مختلف این دماها، در مواقع افت قابل بحث است مانند مسایلی که برای جوامع به وجود می آورد (مثل ترکیدن لوله های آب، دیواره استخرها و حوض ها، بروز بیماری های واگیردار زمستانی مانند سرماخوردگی آنفلوانزایی، سارس، آلودگی هوا با مصرف زیاده از حد سوخت، مرگ و میر حیوانات وحشی و هجوم آنها به مراکز زیست انسانی، وقوع اینورژن های حرارتی و تشعشعی مورد بررسی قرار داده شود (قویدل رحیمی و خوشحال دستجردی، 1389: 180).

       از نمونه این خسارات می توان به وقوع موج سرمای دی ماه 1386 اشاره کرد که همه ایران را در بر گرفت و به تبع آن استان های مورد پژوهش این تحقیق نیز طی چندین روز متوالی از 15 تا 20 دی 1386 شاهد دمای شدید سرد و یخبندان بودند. از خسارات این سرما می توان به تعطیلی تمام مقاطع تحصیلی و دانشگاه های استانهای تهران، سمنان و یزد به مدت دو روز، قطع و افت فشار گاز در اغلب شهرهای تهران، شاهرود، کاشان، یزد و کرمان، لغو اکثر پروازهای مسافرتی بعلت برودت و سردی هوا اشاره کرد (سایت خبر گذاری تابناک؛ در تاریخ 16/10/1386) همچنین کاهش دما به زیر صفر درجه در تمام ایستگاه ها، از جمله در استان سمنان کاهش دما تا منفی 13 درجه، شاهرود منفی 12 (سایت خبر گذاری فارس؛ 18/10/1386). اعلام وضعیت حاد برای هشت استان كشور، سرگردانی بیش از سه هزار تن در راه های یزد اشاره کرد . این امواج سرد که با کاهش شدید دما و ریزش برف سنگین (100سانتی متر در اطراف قمصر) همراه بود، باعث مسدود شدن اکثر راه های ارتباطی شهری و روستایی کاشان، تهران به قم و دیگر شهرها شد (سایت سازمان مدیریت بحران کشور؛ در تاریخ 17/10/1386).

       مرتبط با دماهای بحرانی سرد، رزنویک (1996) و ساکاموتو (1997) اشاره می کنند که قرار گرفتن در معرض دماهای بسیار پایین در فصل سرد سال برای سلامت کودکان، سالمندان، بی خانمان ها و افرادی که بیماریهای تنفسی، قلبی

فهرست مطالب

چکیده فارسی…………………………………………………………………………………………………

فصل اول:مقدمه(اهداف تحقیق)………………………………………………………………………..

1- 1 طبقه بندی بروسلا…………………………………………………………………………………..

1-2  بیماری زایی و فاکتورهای بیماری زایی……………………………………………………..

1-2-1 ژن کد کننده آنزیم گلوکان حلقوی سنتتاز (cgs)…………………………..

1-2-2 ژن های aroc و  purE …………………………………………………………..

1-2-3 پروتئینهای شوک حرارتی…………………………………………………………….

1-2-4 ژن sod…………………………………………………………………………………….

1-3 اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………

1-4 خصوصیات بیوشیمیایی……………………………………………………………………………

1-5 علایم بیماری………………………………………………………………………………………….

    1-5-1 ناخوشى تحت بالینى (ساب كلینیكال)………………………………………….

        1-5-2 بروسلوز حاد و تحت حاد……………………………………………………………

        1-5-3 بروسلوز موضعى ( لوكالیزه):……………………………………………………….

         1-5-4 عود بروسلوز:…………………………………………………………………………..

        1-5-5 بروسلوز مزمن……………………………………………………………………………

        1-5-6 بیمارى شبه بروسلوز………………………………………………………………….

        1-5-7 بروسلوز ناشى از تلقیح واكسن حیوانى………………………………………..

1-6 انتقال بیماری………………………………………………………………………………………….

1-7 پاسخ های ایمنی میزبان به بروسلا…………………………………………………………….

1-8 روش های تشخیص…………………………………………………………………………………..

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب  Omp31…………………………………………….

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

1-10-3 استفاده از بروسلا ملیتنسیس سویه WR201……………………………………..

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24  در هر دو سویه بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس  

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

1-10-7 استفاده از LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس……………………………………

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانی بروسلا ملیتنسیس…

1-10-10 مجوز استفاده از واکسن بروسلا   ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در گاوها…

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

        1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

        1-11-2 ساختمان LPS ………………………………………………………………………

        1-11-3  عملکرد LPS………………………………………………………………………..

        1-11-4 تاثیرات LPS………………………………………………………………………….

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

       1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

       1-12-2  PorA…………………………………………………………………………………..

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

فصل سوم: (مواد و روشها)

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

3-4 رنگ آمیزی گرم …………………………………………………………………………………….

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

3-6 روش استخراج DNA پلاسمیدی …………………………………………………………..

      3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

 

      3-6-2 مراحل استخراج DNA پلاسمیدی……………………………………………….

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

      3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

      3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

3-8  بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

3-9  نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

3-11 روش تهیه بافر جداکننده ……………………………………………………………….

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

       3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

       3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

        3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

        3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیب E.coli………………………………………………..

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

        3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

        3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

3-19 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

          3-19-1 پروتکل جدا سازی LPS……………………………………………………

          3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

3-20 سنجش غلضت  LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

         3-20-1 تهیه LPS منحنی استاندارد………………………………………………….

3-21 روش کونژوگاسیون LPS با  PorA…………………………………………………..

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

فصل چهارم:(نتایج )

4-1 احیا باکتری نوترکیب PorA……………………………………………………………….

4-2 استخراج DNA پلاسمیدی ……………………………………………………………….

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیب PorA………………………………………………..

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

4-6 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

4-7 سنجش غلظت LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………

4-8 کونژوگاسیون LPS باPorA………………………………………………………………

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

 فهرست جدول ها

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

 

فهرست شکل ها

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتری بروسلا آبورتوس در میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتری بروسلا آبورتوس با ماکروفاژ……………………………………

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

شکل 4-2 DNA  پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

شکل4-3SDS-PAGE,PorA ………………………………………………………………………………………..

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شده PorA………..

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

چکیده

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنس بروسلا به وجود می آید . بروسلاها ، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند . بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس عمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند. واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولی بروسلا محسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPS بروسلا به دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است  وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد.  علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخل E.coli کلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی   انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین  بدست آمد.در مرحله ی بعد LPS بروسلا ملیتنسیس جداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPS بروسلا ملیتنسیس  با porA نیسریا کونژوگه گردید.

بیشترین بیان پروتئین porA  در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS  مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ،  97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

فصل اول

مقدمه

 1-1-طبقه بندی بروسلا:

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست  (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جمله بارتونلا و ریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

جنس بروسلا بر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابه DNA به هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار در بروسلا آبورتوس ، 3 بیووار در بروسلا ملی تنسیس و 5 بیوار در بروسلا سویس را مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)  

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست مطالب

فصل اول

1- مقدمه. 1

1-2 پنیر. 3

1-3 نقش میکروارگانیسم ها در مراحل رسیدن پنیر. 11

1-4 پروتئولیز. 12

1-5 گلیكولیز. 13

1-6 لیپولیز بر روی پنیر. 15

1-7  فلور میكروبی روده 19

1-8 پروبیوتیك‌ها 20

1-8-1 مکانیسم اثر پروبیوتیک ها 24

1-8-2 اثرات مفید پروبیوتیك‌ها بر سلامت انسان. 24

1-9 پری بیوتیك‌ها 29

1-10  لاکتوباسیلوس… 32

1-11 بیفیدوباکتریوم. 33

1-12 اسید لاکتیک… 35

1-12-1 عملکرد اسید لاکتیک… 36

1-12-1 ساختار ژنتیکی باکتریسین ها 43

1-13 اسید استیک… 44

فصل دوم

2- پیشینه پژوهش… 46

فصل سوم

3- مواد و روش ها 50

3-1 تهیه نمونه های پنیر. 52

3-2 بررسی باکتری شناسی نمونه های پنیر. 53

3-3 بررسی خواص ضد میکروبی جدایه ها 53

3-4 تست تعیین حساسیت میکروبی جدایه ها 54

3-5 تست تعیین حساسیت در برابر اسید و صفرا 55

 

3-6 تجزیه و تحلیل آماری داده ها 56

فصل چهارم

4- نتایج.. 57

4-1 نتایج آزمون تعیین حساسیت میکروبی جدایه ها 63

4-2 نتایج آزمون تحمل صفرا 65

4-3 نتایج مربوط به تحمل اسید. 67

فصل پنجم

5- بحث… 70

5-1 نتیجه گیری.. 78

5-2 پیشنهادات… 79

منابع. 80

فهرست جداول

جدول 1-1: نمونه‌ای از سوشهای پروبیوتیک… 31

جدول 1-2: باکتریوسین های تولید شده توسط  برخی گونه های لاکتوباسیلوس ها 42

جدول 4-1. بررسی میکروبیولوژیک 100 گرم از نمونه پنیرهای مختلف پس از کشت بر روی محیط MRS آگار. 58

جداسازی شده از 15 نمونه پنیر لورک. 58

جداسازی شده از 15 نمونه پنیر کوزه. 59

جداسازی شده از نمونه های پنیر لورک، کوزه و چدار. 59

جدول 4-5: نتایج بدست آمده از خاصیت ضد میکروبی باکتری های جده شده از نمونه پنیرهای مختلف. 61

جدول 4-6. نتایج آزمون تعیین حساسیت ضد میکروبی باکتری های جدا شده از پنیر لورک. 63

جدول 4-7. نتایج آزمون تعیین حساسیت ضد میکروبی باکتری های جدا شده از پنیر کوزه. 64

های جدا شده از پنیر لورک در برابر محلول 3/0 درصد اکسگال. 65

های جدا شده از پنیر کوزه در برابر محلول 3/0 درصد اکسگال. 66

جدول 4-10 نتایج حاصل از آزمون تعیین حساسیت در برابر اسید باکتری های جدا شده از نمونه های پنیر لورک. 67

جدول 4-11 نتایج حاصل از آزمون تعیین حساسیت در برابر اسید باکتری های جدا شده از نمونه های پنیر کوزه. 67

فهرست اشکال

شکل 1-1: فرایند تشکیل اسید لاکتیک… 38

تصویر 4-1. منطقه مهار رشد لاکتوباسیلوس روتری جدا شده از پنیر لورک (الف)، منطقه مهار رشد لاکتوباسیلوس کازئی جدا شده از پنیر کوزه (ب) علیه لیستریا منوسیتوژنز. 63

چکیده

پروبیوتیک­ها مکمل غذایی از میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که وقتی در مقادیر مناسب در دستگاه گوارشی وجود داشته باشند، تأثیرات سودمندی بر میزبان برجای می‌گذارند.  از میان باکتری‌ها، باکتری‌های اسیدلاکتیک، متداول‌ترین نوع باکتری‌هایی هستند که به‌عنوان پروبیوتیک معرفی شده‌اند. هدف از این پروژه، جداسازی و شناسایی باکتری‌های با پتانسیل پروبیوتیکی از انواع مختلف پنیر سنتی شامل لورک، کوزه و چدار و ارزیابی خواص مهاری آن‌ ها بر رشد اشریشیا کلی و لیستریا منوسیتوژنز بود. برای رسیدن به این هدف، باکتری‌های اسیدلاکتیک توسط روش‌های فنوتیپی (رنگ‌آمیزی گرم، تست‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژی) جداسازی شدند و شاخص‌های اولیه پروبیوتیکی آن‌ ها (مقاومت به اسید، نمک‌های صفراوی) مورد ارزیابی قرار گرفت. در پایان تحقیق، 5 سویه لاکتوباسیلوس و یک سویه بیفیدوباکتریوم به‌عنوان فلور میکروبی طبیعی از نمونه‌های لورک، 4 سویه لاکتوباسیلوس از نمونه‌های پنیر کوزه و یک سویه لاکتوباسیلوس از پنیر چدار مورد شناسایی قرار گرفتند. نتایج حاصل از بررسی‌های گزینشی شامل تست آنتی بیوگرام، مقاومت در برابر صفرا  و اسید و آزمون مهاری نشان داد که لاکتوباسیلوس روتری و لاکتوباسیلوس کازئی پتانسیل کاربرد به‌ عنوان پروبیوتیک را در محصولات لبنی دارند.

لغات کلیدی: لاکتوباسیل، اشریشیا کلی، لیستریا منوسیتوژنز، پنیر سنتی، لورک، کوزه، چدار

                                                   فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                   صفحه

فصل اول: (مقدمه و اهداف تحقیق)

چکیده فارسی                                                                                                 1

1-1-مقدمه……………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2-اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………. 3

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)

2-1-گیاه­شناسی گندم و اهمیت آن…………………………………………………………………………….. 4

2-1-1- بیماری زنگ  …………………………………………………………………………………………… 5

2-1-2- بیماری سیاهک…………………………………………………………………………………………..   6

2-1-3- بیماری پاخوره یا پوسیدگی­ریشه یا از­پای­افتادن………………………………………………….. 7

2-1-4- بیماری سوختگی­زرد یا لک­خرمایی…………………………………………………………………. 8

2-1-5- بیماری لکه­چشمی………………………………………………………………………………………. 9

2-1-6- بیماری ارگوت                                                                                     9

2-1-7- بیماری­های فوزاریومی…………………………………………………………………………………. 10

2-1-7-1- قارچFusarium graminarum…………………………………………………………………………………………..   12

2-1-7-2- قارچ Fusarium culmurum ……………………………………………………………………………………………. 13

2-1-7-3- قارچ Fusarium avenaceum……………………………………………………………………………………………   13

2-1-7-4- قارچFusarium equiseta      ……………………………………………………………………………………………. 14

2-1-7-5- قارچFusarium nivale                                                                                          15

2-2- میکروارگانیسم­های ریزوسفر                                                                         15

2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون   ………………………………………………………………………………… 18

2-4- باکتری­ های اندوفتیک و کاربرد آن­ها…………………………………………………………………….   21

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی…………………………………………………………………….   21

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن………………………………………………………………………………   25

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن…………………………………………………………………………………………..   28

2-4-4- انحلال فسفات……………………………………………………………………………………………   39

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

2-5- باکتری­ های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

فصل سوم (مواد و روش­ها)

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

3-1-2-1- نمونه و نمونه گیری …………………………………………………………………………………….. 59

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

3-2-8- تستMR/VP…………………………………………………………………………………………………. 63

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

3-3- شناسایی باکتری­ های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA………………………………………………… 64

3-3-2- روش استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………………………… 65

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

فصل چهارم (نتایج و بحث)

 

 

4-1- جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک                                                               68

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­ های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
 گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- بررسی فعالیت آنزیم β-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

4-4-3- ترکیبات محیط CMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ ها……………………………………………………………… 77

4-5-1- آنالیز کیفی محصولات PCR…………………………………………………………………………… 78

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

فهرست جداول

عنوان جدول                                                                                                          صفحه

جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ…………………………………………………………………………………………5

جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک……………………………………………………………………………………..6

جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی……………………………………………………………………………………….12

جدول2-4. انواع ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………………18

جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن………………………………………………………………………………..28

جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی………………………………………………………………………………….32

جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت………………………………………………………………………..33

جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین………………………………………………………………………….34

جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده…………………………………………………………………..35

جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن……………………………………………………………….39

جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور…………………………………………………………………………….43

جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها……………………………………………………………..50

جدول3-1. شرایطPCR……………………………………………………………………………………………………………….66

جدول3-2. چرخهPCR………………………………………………………………………………………………………………..66

جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA………………………………………………………………………66

جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………68

جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون………………………………………………………………………………………..71

جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium moniliforme………………………………………………………..72

جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium graminearum……………………………………………………..72

جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum…………………………………………………………..72

جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium culmorum…………………………………………………………..72

جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma virida………………………………………………………………73

جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma harizanum……………………………………………………….73

جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum………………………………………………………73

جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Macrophomina phaseolina………………………………………………73

جدول4-11. ترکیبات محیط CMCآگار1%……………………………………………………………………………………..76

جدول4-12. نتایج Blast……………………………………………………………………………………………………………..79

 

فهرست شکل­ها

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل2-1. انواع زنگ­ها…………………………………………………………………………………………………………………6

شکل2-2. انواع سیاهک­ها……………………………………………………………………………………………………………..7

شکل2-3. بیماری پاخوره………………………………………………………………………………………………………………8

شکل2-4. بیماری سوختگی­زرد­برگ……………………………………………………………………………………………….8

شکل2-5. بیماری لکه­چشمی…………………………………………………………………………………………………………9

شکل2-6. بیماری ارگوت……………………………………………………………………………………………………………10

شکل2-7. بیماری جرب و پوسیدگی فوزاریومی…………………………………………………………………………….11

شکل2-8. ماکروکنیدی فوزاریوم­گرامیناروم…………………………………………………………………………………….13

شکل2-9. ماکروکنیدی فوزاریوم­کلموروم………………………………………………………………………………………13

شکل2-10. ماکروکنیدی فوزاریوم­اوناسئوم…………………………………………………………………………………….14

شکل2-11. ماکروکنیدی فوزاریوم­اکوئیست……………………………………………………………………………………14

شکل2-12. عملکرد PGPR………………………………………………………………………………………………………..17

شکل2-13. عملکردPGPB………………………………………………………………………………………………………….24

شکل2-14. متانوتروف­های اندوفتیک……………………………………………………………………………………………38

شکل2-15. متابولیت­های ثانویه اکتینوباکتر­ها…………………………………………………………………………………44

شکل2-16. کلونیزاسیون اندوفیت­ها……………………………………………………………………………………………..54

شکل3-1. کیت استخراج DNA شرکت سیناژن………………………………………………………………………………64

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل4-1. رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………………………..67

شکل4-2. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 2g51 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-3. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 1g61 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-4. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G13 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….75

شکل4-5. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G14 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….76

شکل4-6. محصول PCR…………………………………………………………………………………………………………….78

شکل4-7. هم­تراز­سازی توالی نمونه 2g51………………………………………………………………………………….. 80

شکل4-8. سکانس­ژنی16srRNA نمونه 2g51……………………………………………………………………………….81

شکل4-9. هم­تراز­سازی توالی نمونه 1g61……………………………………………………………………………………83

شکل4-10. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه 1g61……………………………………………………………………………84

شکل4-11. هم­تراز­سازی توالی نمونه G13…………………………………………………………………………………..86

شکل4-12. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G13……………………………………………………………………………..87

شکل4-13. هم­تراز­سازی توالی نمونه G14.…………………………………………………………………………………..89

شکل4-14. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G14……………………………………………………………………………..90

 

چکیده:

باکتری­ های اندوفتیک به باکتری­ های اطلاق می­ شود که در درون بافت گیاهی بدون ایجاد آسیب ظاهر­ی زندگی می­ کنند. امروزه بسیاری از محققین گیاهان را برای جداسازی و شناسایی اندوفیت­ها مورد ارزیابی قرار می­ دهند زیرا برخی از آن­ها قادر به تولید ترکیبات ضد­قارچی و ضد­باکتریایی می­باشند و برخی به عنوان بارور­کننده به رشد گیاهان کمک می­ کنند و ممکن است منفعت­هایی نیز برای گیاه به همراه داشته باشند که از آن جمله می­توان به داشتن اثر ضد­باکتری و ضد­قارچی آن ها اشاره کرد و اخیرا توجه بسیاری را به خود معطوف کردند زیرا استفاده و به کارگیری اندوفتیک­ها به جای استفاده از بارورکننده­ها و مواد میکروب­کش شیمیایی کمک به سزایی را به حفظ سلامت و محیط­زیست می­نماید بر همین اساس در تحقیق حاظر ابتدا جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از ریشه و ساقه گیاه گندم بر روی محیط کشت NA صورت گردید و سپس نمونه­ها از نظر توانایی تولید اثر آنتاگونیسمی علیه 5 پاتوژن قارچی :

Fusarium moniliforme، Fusarium graminearum، Fusarium oxysporum، Macrophomina phaseolina، Fusarium culmorom (LM 2091) و 3 قارچ بیوکنترلی: Tricoderma virida (222-35) Tricoderma harizanum (115)، Tricoderma asperellum (Fyt222.2) در شرایط آزمایشگاهی با روش کشت­متقابل مورد مطالعه قرار گرفتند. در مجموع 69 باکتری از ریشه و ساقه گیاه گندم جداسازی گردید که از بین تمامی باکتری­ های جداشده تنها 5 باکتری اثر آنتاگونیسمی نشان دادند بعضی از سویه­ها پس از تعیین توالی16srRNA تحت عنوان باسیلوس­سوبتلیسM.CH.V، باسیلوس­سوبتلیس IRI، باسیلوس­سوبتلیس Khazar و لیزنی­باسیلوس­ماکروئیدس Tethys شناسایی شدند. بنابراین مطالعه حاظر نشان داد که گیاه گندم حاوی باکتری­ های اندوفیتیکی می­باشد که اثر ممانعتی علیه پاتوژن­های گیاه داشته است.

کلمات کلیدی : اندوفتیک، گندم، آنتاگونیست، بیوکنترل، 16srRNA

 فصل اول

 

مقدمه واهداف تحقیق

1-1. مقدمه

تازه ترین تعریف اندوفیت­ها « باکتری یا قارچی» است که برای تمام یا بخشی از زندگی خود به بافت­های گیاهان زنده حمله می­ کنند. درمعنای تجربی، اندوفتیک­ها باکتری­ های جدا شده از درون گیاه هستند که هیچ مشخصه یا نشانه­ای از بیماری ایجاد نمی­ کنند .(Wilson; 1995)باکتری­ های اندوفیتیک در یک جایگاه اکولوژیکی شبیه به پاتوژن­ها کلونیزه می­شوند اما با میکروارگانیسم­های پاتوژن گیاه تفاوت دارند، چون در گیاه بیماری ایجاد نمی­ کنند و با میکروارگانیسم­های