فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                   صفحه

فصل اول: (مقدمه و اهداف تحقیق)

چکیده فارسی                                                                                                 1

1-1-مقدمه……………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2-اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………. 3

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)

2-1-گیاه­شناسی گندم و اهمیت آن…………………………………………………………………………….. 4

2-1-1- بیماری زنگ  …………………………………………………………………………………………… 5

2-1-2- بیماری سیاهک…………………………………………………………………………………………..   6

2-1-3- بیماری پاخوره یا پوسیدگی­ریشه یا از­پای­افتادن………………………………………………….. 7

2-1-4- بیماری سوختگی­زرد یا لک­خرمایی…………………………………………………………………. 8

2-1-5- بیماری لکه­چشمی………………………………………………………………………………………. 9

2-1-6- بیماری ارگوت                                                                                     9

2-1-7- بیماری­های فوزاریومی…………………………………………………………………………………. 10

2-1-7-1- قارچFusarium graminarum…………………………………………………………………………………………..   12

2-1-7-2- قارچ Fusarium culmurum ……………………………………………………………………………………………. 13

2-1-7-3- قارچ Fusarium avenaceum……………………………………………………………………………………………   13

2-1-7-4- قارچFusarium equiseta      ……………………………………………………………………………………………. 14

2-1-7-5- قارچFusarium nivale                                                                                          15

2-2- میکروارگانیسم­های ریزوسفر                                                                         15

2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون   ………………………………………………………………………………… 18

2-4- باکتری­ های اندوفتیک و کاربرد آن­ها…………………………………………………………………….   21

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی…………………………………………………………………….   21

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن………………………………………………………………………………   25

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن…………………………………………………………………………………………..   28

2-4-4- انحلال فسفات……………………………………………………………………………………………   39

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

2-5- باکتری­ های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

فصل سوم (مواد و روش­ها)

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

3-1-2-1- نمونه و نمونه گیری …………………………………………………………………………………….. 59

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

3-2-8- تستMR/VP…………………………………………………………………………………………………. 63

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

3-3- شناسایی باکتری­ های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA………………………………………………… 64

3-3-2- روش استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………………………… 65

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

فصل چهارم (نتایج و بحث)

4-1- جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­ های اندوفتیک                                                               68

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­ های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
 گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- بررسی فعالیت آنزیم β-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

4-4-3- ترکیبات محیط CMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ ها……………………………………………………………… 77

4-5-1- آنالیز کیفی محصولات PCR…………………………………………………………………………… 78

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

فهرست جداول

فهرست شکل­ها

چکیده:

باکتری­ های اندوفتیک به باکتری­ های اطلاق می­ شود که در درون بافت گیاهی بدون ایجاد آسیب ظاهر­ی زندگی می­ کنند. امروزه بسیاری از محققین گیاهان را برای جداسازی و شناسایی اندوفیت­ها مورد ارزیابی قرار می­ دهند زیرا برخی از آن­ها قادر به تولید ترکیبات ضد­قارچی و ضد­باکتریایی می­باشند و برخی به عنوان بارور­کننده به رشد گیاهان کمک می­ کنند و ممکن است منفعت­هایی نیز برای گیاه به همراه داشته باشند که از آن جمله می­توان به داشتن اثر ضد­باکتری و ضد­قارچی آن ها اشاره کرد و اخیرا توجه بسیاری را به خود معطوف کردند زیرا استفاده و به کارگیری اندوفتیک­ها به جای استفاده از بارورکننده­ها و مواد میکروب­کش شیمیایی کمک به سزایی را به حفظ سلامت و محیط­زیست می­نماید بر همین اساس در تحقیق حاظر ابتدا جداسازی باکتری­ های اندوفتیک از ریشه و ساقه گیاه گندم بر روی محیط کشت NA صورت گردید و سپس نمونه­ها از نظر توانایی تولید اثر آنتاگونیسمی علیه 5 پاتوژن قارچی :

Fusarium moniliforme، Fusarium graminearum، Fusarium oxysporum، Macrophomina phaseolina، Fusarium culmorom (LM 2091) و 3 قارچ بیوکنترلی: Tricoderma virida (222-35) Tricoderma harizanum (115)، Tricoderma asperellum (Fyt222.2) در شرایط آزمایشگاهی با روش کشت­متقابل مورد مطالعه قرار گرفتند. در مجموع 69 باکتری از ریشه و ساقه گیاه گندم جداسازی گردید که از بین تمامی باکتری­ های جداشده تنها 5 باکتری اثر آنتاگونیسمی نشان دادند بعضی از سویه­ها پس از تعیین توالی16srRNA تحت عنوان باسیلوس­سوبتلیسM.CH.V، باسیلوس­سوبتلیس IRI، باسیلوس­سوبتلیس Khazar و لیزنی­باسیلوس­ماکروئیدس Tethys شناسایی شدند. بنابراین مطالعه حاظر نشان داد که گیاه گندم حاوی باکتری­ های اندوفیتیکی می­باشد که اثر ممانعتی علیه پاتوژن­های گیاه داشته است.

کلمات کلیدی : اندوفتیک، گندم، آنتاگونیست، بیوکنترل، 16srRNA

 فصل اول

مقدمه واهداف تحقیق

1-1. مقدمه

تازه ترین تعریف اندوفیت­ها « باکتری یا قارچی» است که برای تمام یا بخشی از زندگی خود به بافت­های گیاهان زنده حمله می­ کنند. درمعنای تجربی، اندوفتیک­ها باکتری­ های جدا شده از درون گیاه هستند که هیچ مشخصه یا نشانه­ای از بیماری ایجاد نمی­ کنند .(Wilson; 1995)باکتری­ های اندوفیتیک در یک جایگاه اکولوژیکی شبیه به پاتوژن­ها کلونیزه می­شوند اما با میکروارگانیسم­های پاتوژن گیاه تفاوت دارند، چون در گیاه بیماری ایجاد نمی­ کنند و با میکروارگانیسم­های