چکیده فارسی

ناشنوایی یکی از شایع ترین بیماری های حسی است که 1 در 1000  نوزاد به آن مبتلا می شوند. 60% از ناشنوایی هاژنتیکی بوده که 70% از موارد غیر سندرومی و دارای توارث اتوزومال مغلوب می باشد. تا به امروز بیش از 50 ژن برای ناشنوایی غیر سندرومی اتوزومال شناسایی شده است. در ایران، ناشنوایی به دلیل ازدواج های خویشاوندی یکی از شایع ترین بیماری های ارثی است.

هدف از این مطالعه بررسی شیوع هفت ژن(GJB4, GJC3, SLITRK6, SERPINB6, NESP4, CABP2, and OTOGL)   شناخته شده برای  ناشنوایی مغلوب غیرسندرومی در صد خانواده ایرانی که دارای ازدواج خویشاوندی و بیش از دو فرد مبتلا می باشند است.

روش انجام مطالعه فوق، بررسی آنالیز پیوستگی بااستفاده از مارکرهای  STR که در مجاورت ژن مذکور قرار دارند می باشند. در صورت مشاهده الگوی پیوستگی، آنالیز توالی یابی و مطالعات تکمیلی صورت خواهد پذیرفت.

نتایج مطالعه، دو خانواده به ژن GJB4 پیوستگی نشان دادند، شش خانواده به ژن GJC3 پیوستگی نشان دادند، یک خانواده به ژن SLITRK6 پیوستگی نشان داد، یک خانواده به ژن SERPINB6 پیوستگی نشان داد، هشت خانواده به ژن NESP4 پیوستگی نشان دادند، دو خانواده به ژن CABP2 پیوستگی نشان دادند، و شش خانواده به ژن OTOGL پیوستگی نشان دادند که با بررسی توالی یابی اگزون های ژن مربوطه تغییری در ژن مذکور مشاهده نگردید. این نتایج بیانگر شیوع بسیار کم جهش در این هفت ژن در جمعیت ایرانی می باشد.

واژه های کلیدی: ناشنوایی غیر سندرمی، توارث مغلوب اتوزومی ، نقشه کشی هموزیگوسیتی، توالی یابی به روش سنگر، ایران.

 

فهرست مطالب

 

 

فصل اول کلیات تحقیق

مقدمه    ……………………………………………………………………………………………………………………………….  1

بیان مسئله   ………………………………………………………………………………………………………………………… 3

اهمیت و ضرورت تحقیق   ……………………………………………………………………………………………………… 4

اهداف   ………………………………………………………………………………………………………………………………… 6

هدف کلی   …………………………………………………………………………………………………………………………. 6

اهداف اختصاصی   ………………………………………………………………………………………………………………. 6

اهداف کاربردی   ……………………………………………………………………………………………………….. 6

سؤالات و فرضیه ها   …………………………………………………………………………………………………………….. 7

فصل دوم پیشینه تحقیق

آناتومی گوش   ……………………………………………………………………………………………………………………… 8

گوش خارجی   ……………………………………………………………………………………………………………………. 8

گوش میانی   ………………………………………………………………………………………………………………………. 9

گوش داخلی   …………………………………………………………………………………………………………………….. 9

طبقه بندی ناشنوایی   …………………………………………………………………………………………………………. 11

طبقه بندی بر اساس سن شروع   ……………………………………………………………………………………….. 11

طبقه بندی بر اساس شدت   ………………………………………………………………………………………………. 12

طبقه بندی بر اساس علت فیزیولوژیکی   ……………………………………………………………………………. 12

ژن های شناخته شده مرتبط با ناشنوایی   …………………………………………………………………………….. 13

بررسی ژن ها   ……………………………………………………………………………………………………………………. 22

ژن  GJB4  ……………………………………………………………………………………………………………. 22

ژنGJC3   ……………………………………………………………………………………………………………… 25

ژن SLITRK6 ………………………………………………………………………………………………………. 26

ژن SERPINB6   ……………………………………………………………………………………………………. 28

ژنNESP4  ……………………………………………………………………………………………………………. 29

ژن CABP2   …………………………………………………………………………………………………………. 30

ژن OTOGL  …………………………………………………………………………………………………………. 31

فصل سوم روش شناسی تحقیق

نوع مطالعه   ………………………………………………………………………………………………………………………… 34

جامعه، نمونه آماری و روش نمونه گیری   ………………………………………………………………………………. 34

روش جمع آوری داده ها   …………………………………………………………………………………………………….. 34

متغیره ها   ………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

روش شناسی تحقیق   …………………………………………………………………………………………………………. 35

ملاحظات اخلاقی   ………………………………………………………………………………………………………………. 36

مواد و روش ها   …………………………………………………………………………………………………………………   37

            استخراج DNA   …………………………………………………………………………………………………….. 37          چگونگی استخراج DNA ……………………………………………………………………………………….. 38

لیز سلول ……………………………………………………………………………………………………………….. 39

هیدراسیون  DNA………………………………………………………………………………………………. 40

تعیین غلظت DNA استخراج شده   ……………………………………………………………………………….. 41

روش تعیین غلظت  …………………………………………………………………………………………………………. 42

 نحوه خالص سازی نمونه های آلوده به پروتئین   .……………………………………………………………… 42

آنالیز پیوستگی برای بررسی 7 جایگاه ژنی مرتبط با ناشنوایی اتوزومی مغلوب غیرسندرومی   .. 43

انتخاب مارکرهای   STR ………………………………………………………………………………………. 44

ژن  GJB4   ……………………………………………………………………………………………………….. 45

ژنGJC3   …………………………………………………………………………………………………………. 46

ژن SLITRK6   ………………………………………………………………………………………………….. 47

ژن SERPINB6   ………………………………………………………………………………………………. 48

ژنNESP4   ………………………………………………………………………………………………………. 49

ژن CABP2   …………………………………………………………………………………………………….. 50

ژن OTOGL   ……………………………………………………………………………………………………. 51

تعیین هتروزیگوسیتی مارکرهای STR در جمعیت ایران   ……………………………………….. 52

 

واکنش زنجیره ای پلیمراز   ……………………………………………………………………………………………….. 53

مواد لازم برای واکنش PCR   …………………………………………………………………………………………… 54

روش انجام PCR   …………………………………………………………………………………………. 57

الکتروفورز   ……………………………………………………………………………………………………………. 60

          الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید   ……………………………………………………………….. 61

مواد لازم جهت الكتروفورز ژل پلی آكریل امید   ……………………………………………. 62

طرز تهیه ژل اكریل امید 8 درصد   ……………………………………………………………….. 63

رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره   …………………………………………………………… 65

          مواد لازم جهت رنگ آمیزی نقره   …………………………………………………….. 65

          روش رنگ آمیزی نیترات نقره   ………………………………………………………… 66

          بررسی ژل های پلی آکریل آمید   …………………………………………………….. 67

پیدا کردن جهش به روش مستقیم تعیین توالی   ……………………………………………………… 68

          الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز   …………………………………………….. 70

            مواد لازم جهت انجام الكتروفورز DNA  برروی ژل آگارز   ………………… 70

روش كار   ……………………………………………………………………………………….. 71

توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر   ………………………………………………….. 72

روش آنالیز نتایج حاصل از Sequencing   …………………………………………………… 74

فصل چهارم تجزیه و تحلیل و بیان نتایج حاصل از تحقیق

نتایج حاصل از مطالعات  آنالیز پیوستگی    ………………………………………………………………………….. 75

        مارکرهای دارای فركانس آللی بالاتر   ………………………………………………………………………. 75           

نتایج آنالیز پیوستگی در خانوادهای ناشنوا با توارث مغلوب   …………………………………….. 77

خانواده L-3082  و ژن  GJB4  ………………………………………………………………………………. 78

خانواده L-1902  و ژن  GJC3  ……………………………………………………………………………… 81

خانواده L-346  و ژن  SLITRK6   …………………………………………………………………………. 84

خانواده L-346  و ژن  NESP4  ……………………………………………………………………………… 86

خانواده L-1731  و ژن  SERPINB6  …………………………………………………………………….. 88

خانواده L-346  و ژن  CABP2  ……………………………………………………………………………… 91

خانواده L-346  و ژن  OTOGL  ……………………………………………………………………………. 94

فصل پنجم­ بحث ونتیجه گیری وپیشنهادات

بحث ونتیجه گیری   …………………………………………………………………………………………………………… 97

تحقیقیات اضافه   …………………………………………………………………………………………………………….. 101

پیشنهادات   ……………………………………………………………………………………………………………………. 103

منابع   …………………………………………………………………………………………………………………………….. 105

 

فهرست جداول

 

 

جدول 1-1 نام ژن ها و جایگاه ژن هایی که تاکنون به عنوان عامل بیماری ناشنوایی اتوزومی مغلوب در جمعیت ایران شناسایی شده است   …………………………………………………………………………………. 4

جدول 2-1 ناشنوایی بر اساس شدت   …………………………………………………………………………………. 12

جدول 2-2 جایگاه ها و ژن های شناسایی شده در ناشنوایی غیر سندرمی با توارث مغلوب اتوزومی  به همراه خصوصیات خاص فنوتیپی برای هر کدام   ……………………………………………………………….. 14

جدول 2-3 جزِِِییات جهش های ژن های Cx   ………………………………………………………………………. 24

جدول 3-1 متغیره ها   ……………………………………………………………………………………………………….. 34

جدول 3-2 مواد لازم جهت استخراج DNA به روش نمک اشباع   …………………………………………. 36

جدول 3-3 مارکر های ژن GJB4   ………………………………………………………………………………………. 45

جدول 3-4 مارکر های ژن GJC3   ………………………………………………………………………………………. 46

جدول 3-5 مارکر های ژن SLITRK6   …………………………………………………………………………………. 47

جدول 3-6 مارکر های ژن SERPINB6   ……………………………………………………………………………… 48

جدول 3-7 مارکر های ژن NESP4   …………………………………………………………………………………… 49

جدول 3-8 مارکر های ژن CABP2   …………………………………………………………………………………… 50

جدول 3-9 مارکر های ژن OTOGL    …………………………………………………………………………………. 51

جدول 3-10 مواد لازم برای ساخت Master Mix   ………………………………………………………………. 57

جدول 3-11 مواد لازم برای انجام واکنش PCR   …………………………………………………………………. 58

جدول 3-12 لیست پرایمر های مورداستفاده در این تحقیق   ……………………………………………….. 59

جدول 3-13 برنامه PCR  استفاده شده   ……………………………………………………………………………. 60

جدول 3-14 مواد سازنده بافر بارگذاری   …………………………………………………………………………….. 70

جدول 3-15 توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر اگزون های ژن GJB4, GJC3,SLITRK6, NESP4   …………………………………………………………………………………………………………………………. 73

جدول5-1 مقایسه چگونگی توزیع علل ژنتیکی ناشنوایی در آمریکا و ترکیه …………………………. 98

جدول5-2 لیست ژن های جهش یافته در خانواده ها ………………………………………………………….. 101

فهرست تصاویر

 

 

 

شکل 2-1 سه بخش گوش   …………………………………………………………………………………………………. 9

شکل 2-2 گوش داخلی   ……………………………………………………………………………………………………. 11

شکل 2-3 تفاوت بیان ژن OTOGL در دوران نوزادی و بزرگسالی  ……………………………………….. 33

شکل 3-1 موقعیت مارکرهای ژن GJB4   ……………………………………………………………………………. 46

شکل 3-2 موقعیت مارکرهای ژن GJC3   …………………………………………………………………………… 47

شکل 3-3 موقعیت مارکرهای ژن SLITRK6   ……………………………………………………………………… 48

شکل 3-4 موقعیت مارکرهای ژن SERPINB6   ………………………………………………………………….. 49

شکل 3-5 موقعیت مارکرهای ژن NESP4   ………………………………………………………………………… 50

شکل 3-6 موقعیت مارکرهای ژن CABP2    ……………………………………………………………………….. 51

شکل 3-7 موقعیت مارکرهای ژن OTOGL   ……………………………………………………………………….. 52

شکل 4-1 ژل پلی آکریل آمید مربوط به تعیین هتروزیگوسیتی مارکرD1S1570   ……………….. 76

شکل 4-2 شجره خانواده L-3082   ……………………………………………………………………………………. 79

شکل 4-3 مارکرD1S1570  که به این ژن پیوستگی نشان داد   ………………………………………….. 79

شکل 4-4 مارکرD1S496  که به این ژن پیوستگی نشان داد   ……………………………………………. 80

شکل 4-5 مارکرD1S195  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد  …………….. 80

شکل 4-6 موقعیت مارکرهایی که پیوستگی نشان دادند، خانواده L-3082   ………………………… 81

شکل 4-7 شجره خانواده L-1902   …………………………………………………………………………………… 81

شکل 4-8 مارکرD7S2498  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ………………………………………… 82

شکل 4-9 مارکرD7S477  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   …………………………………………… 82

شکل 4-10 مارکرD7S2480  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ……………………………………….. 83

شکل 4-11 موقعیت مارکرهایی که پیوستگی نشان دادند، خانواده L-3082   ………………………. 83

شکل 4-12 شجره خانواده L-346      …. .. …    84       شکل 4-13 مارکرD13S251  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ………………………………………. 84

شکل 4-14 مارکرD13S253  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   ……….. 85

شکل 4-15 مارکرD13S282  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   ……….. 85

شکل 4-16 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-346   …………………………………. 86

شکل 4-17 شجره خانواده L-346   ……………………………………………………………………………………. 86

شکل 4-18 مارکرD19S909  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ………………………………………. 87

شکل 4-19 مارکرD19S876  که به این ژن پیوستگی نشان داد.  ………………………………………… 87

شکل 4-20 مارکرATA57C01  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   …… 88

شکل 4-21 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-346   …………………………………. 88

شکل 4-22 شجره خانواده L-1731   ………………………………………………………………………………….. 89

شکل 4-23 مارکرD6S1617  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ………………………………………. 89

شکل 4-24 مارکرD6S1713  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ……………………………………….. 90

شکل 4-25 مارکرD6S344  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   …………………………………………. 90

شکل 4-26 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-1731   ………………………………. 91

شکل 4-27 شجره خانواده L-3163   …………………………………………………………………………………. 91

شکل 4-28 مارکرD11S1889  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ……………………………………. 92

شکل 4-29 مارکرD11S1296  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   …….. 92

شکل 4-30 مارکرD11S4155  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   …….. 93

شکل 4- 31 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-3163   ……………………………… 93

شکل 4-32 شجره خانواده L-8700187   ………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-33 مارکرD12S1297  که به این ژن پیوستگی نشان داد   .   ………………………………… 94

شکل 4- 34مارکرD12S824  که به این ژن پیوستگی حاوی اطلاعات مفید نشان نداد.   ……… 95

شکل 4-35 مارکرD12S64  که به این ژن پیوستگی نشان داد.   ………………………………………… 95

شکل 4-36 موقعیت مارکری که پیوستگی نشان داد، خانواده L-8700187   ………………………. 96

• مقدمه

ناشنوایی یکی از ناتوانایی های حسی می باشد که تعداد زیادی در دنیا به آن مبتلا هستند.  خطر خاصی مبتلایان ناشنوایی را تهدید نمی کند ولی زندگی روزمره آن ها را تحت تاثیر قرار می دهد. در کشورهای پیشرفته یک در هر هزار کودک، دچار ناشنوایی شدید در زمان بدو تولد و یا دوران پیش زبانی می شوند. ناشنوایی که قبل از حرف زدن اتفاق می افتد راناشنوایی پیش زبانی[1] و ناشنوایی بعد از صحبت کردن کودک راناشنوایی پس زبانی [2]می گویند. ناشنوایی پس کلامی، بسیار رایج تر از ناشنوایی پیش کلامی بوده و4 در صد از جمعیت زیر 45 سال، 10 درصد از جمعیت بالای 65 سال و 50 در صد از جمعیت بالای 80 سال را در بر می گیرد. اغلب بیماران با ناشنوا یی  پس کلامی، توارث چند عاملی دارند ولی  در موارد تک ژنی  به طور عمده از توارث اتوزومی غالب پیروی می کنند[1].

درحدود 60 در صد علل ناشنوایی ژنتیکی، 30 در صد اکتسابی و 10 در صد آن ادیوپاتیک است.[1] ناشنوایی می تواند به روش های مختلفی طبقه بندی شود:  پیش زبانی یا پس زبانی، سندرمی (%30-20) یا غیرسندرمی (%80-70) و بر اساس وجود یا عدم وجود علایم بالینی یا آزمایشگاهی مشخص شده، طبقه بندی شود. انواع ناشنوایی سندرمی همراه با علائم بالینی دیگری  می باشد، در حالیکه در ناشنوایی غیر سندرمی تنها علامت بالینی بیمار، همان ناشنوایی وی می باشد .[2] ناشنوایی سندرمی در مقایسه با نوع غیر سندرمی از هتروژنیتی کمتری برخوردار می باشد.همچنین ناشنوایی می تواند به صورت تعادلی در گوش میانی و خارجی یا به صورت عصبی در گوش درونی ایجاد شود.

توارث ناشنوایی می تواند به صورت اتوزومیال مغلوب (%80)، اتوزومی غالب (%20)، وابسته به ایکس و یامیتوکندریایی (%1>) باشد .[3]

در اغلب موارد، ناشنوایی ژنتیکی به علت اختلال در یک ژن ایجاد می گردد. در حدود 70% از کودکان ناشنوایی که متولد می شوند، دارای ناشنوایی ژنتیکی غیر سندرمی هستند که در آنها هیچ علامت فیزیکی دیگری دیده نمی شود. در30% باقیمانده، ناشنوایی همراه با علائم دیگر بوده و ناشنوایی سندرمی خوانده می شود .[4]

ناشنوایی تک ژنی به طریق مختلف می تواند به ارث برسد. ناشنوایی غیر سندرمی با توارث مغلوب اتوزومی[3] در 80% موارد رخ داده و معمولا به صورت پیش کلامی بروز می کند. در حالیکه، ناشنوایی غیر سندرمی با توارث غالب [4] حدودا در 20% موارد رخ داده واغلب به صورت پس کلامی بروز می کند. در کمتر از یک درصد موارد، توارث به صورت وابسته به جنس یا میتوکندریایی می باشد .[4]

در ایران ناشنوایی بعد از عقب ماندگی ذهنی دومین معلولیت رایج است که 1 در 166 نفر به آن مبتلا می باشد[5] و به دلیل میزان بالای ازدواج های خویشاوندی در ایران ناشنوایی اتوزومی مغلوب از بقیه انواع توارث نرخ بالاتری دارد.[4]