چکیده

 

بهینه سازی تولید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR

 

در پژوهش حاضر ترشح و بررسی خصوصیات آلفا آمیلاز خارج سلولی از باکتری بومی باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR مد نظر بود. سویه 1390BR در محیط حاوی عصاره مخمر 5/0%، پپتون 5/0% و کلرید سدیم 5/0% و آب شهر 5% در دمای ˚C30 و 7~pH کشت داده شد و پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت، توسط نشاسته 1/0 % القا گردید. نتایج بیشترین میزان ترشح را 18 ساعت پس از القا نشان داد. آنزیم توسط روش رسوب­دهی با استن (v/v)70% و ستون کروماتوگرافی تعویض یونیDEAE-Cellulose  تا حد امکان تخلیص گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تخلیص شده در حضور 5/0% نشاسته نشان داد pH و دمای بهینه آنزیم به ترتیب 0/6 و ˚C 70 می­باشد و در دمای ˚C 85 پس از گذشت یک ساعت کمتر از 25% فعالیت خود را از دست می­دهد. این آنزیم در محدوده وسیعی از pH (5-12) بیش از 60% فعالیت خود را حفظ می­ کند. پارامترهای سینتیکی Vmax و Km آلفا آمیلاز سویه 1390BR به ترتیب برابر µM/s 42/0 و mg/ml 02/1 محاسبه شد. فعالیت آنزیم در حضور یون­های Mn2+ و Ca2+ بمدت یک ساعت به میزان 105 و 107% افزایش می­یابد و در حضورFe3+ بطور کامل مهار گردید. فعالیت آمیلولیتیک آنزیم در حضور  mM5EDTA  سبب کاسته شدن تنها 27% از فعالیت اولیه آنزیم گردید. پایداری آنزیم در محدوده وسیع دما و pH و عدم وابستگی شدید فعالیت آنزیم به حضور یون Ca2+ در محیط، این آنزیم را یک کاندید مناسب برای جایگزینی بعضی از آمیلازهای صنعتی امروزی می­نماید.

کلمات کلیدی: آلفا آمیلاز، باسیلوس لیکنیفورمیس، پایداری دمایی، صنعت نشاسته

 

 

 

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان                                                                                                    صفحه

فصل اول.. 1

(مقدمه) 1

1- مقدمه. 2

1-1- آنزیمها 2

1-2- منابع بیوکاتالیزوری.. 2

1-2-1- کاربردهای صنعتی بیوکاتالیزورها 4

1-3- نشاسته. 5

1-4- آمیلازها 6

1-4-1- منابع آلفا آمیلازها 7

1-4-1-1- آمیلازهای باکتریایی.. 7

1-4-1-2- آمیلازهای قارچی.. 7

1-4-2- طبقه بندی آمیلازها 8

آنزیمهای هیدرولیز کننده نشاسته به چهار گروه عمومی تقسیم میشوند: 8

الف) اندو آمیلازها 8

ب) اگزو آمیلازها 8

ج) آنزیمهای شاخه شکن.. 8

د) تراسفرازها 8

1-4-2-1- اندو آمیلازها 8

1-4-2-2- اگزو آمیلازها 9

1-4-2-3- آنزیمهای شاخه شکن.. 9

1-4-3- ساختار آمیلازها 11

1-4-4- مکانیسم عمل آلفا-آمیلاز. 13

1-4-5- کاربردهای آلفا-آمیلازها 14

1-4-5-1- تولید اتانل زیستی.. 15

1-4-5-2- صنایع شوینده. 16

1-4-5-3- صنایع نساجی.. 16

1-4-5-4- کاغذ سازی.. 17

1-4-5-5- صنایع غذایی.. 17

1-5-4-6- تولید نان و شیرینی پزی.. 17

1-4-5-7- تولید شربت گلوکز و فروکتوز. 18

فصل دوم. 20

 

بر پژوهش های پیشین.. 21

فصل سوم. 25

3- ابزار، مواد و روش­های تحقیق.. 26

3-1- ابزار. 27

3-2- مواد. 28

3-2-1- بافرها 28

3-2-2- مواد شیمیایی.. 28

3-2-3- محیطهای کشت مورد نیاز. 28

3-1-4-کشت باکتری مولد آلفا آمیلاز و تشخیص کیفی تولید آنزیم خارج سلولی.. 30

3-2- بررسی سینتیک رشد و فعالیت آلفا آمیلازی باکتری در محیط کشت پایه. 30

3-3- روش های استفاده شده در مراحل سنجش و تخلیص آلفا آمیلاز. 31

3-3-1- تخلیص آنزیم آلفا آمیلاز. 31

3-3-2- تخلیص بر روی ستون DEAE-Cellulose. 31

3-3-3- سنجش فعالیت آنزیمی.. 32

3-3-3-1-روش سنجش فعالیت آنزیم.. 33

3-3-3-2-واحد آنزیمی.. 33

3-3-4- سنجش پروتئین.. 34

3-3-4-1- سنجش کمی پروتئین به روش برادفورد. 34

3-4- روش های بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز با خلوص نسبی.. 35

) 35

3-4-2- اثر دما بر فعالیت آلفا آمیلاز با خلوص نسبی.. 37

3-4-3- اثر pH بر فعالیت آلفا آمیلاز. 37

3-4-4- بررسی پایداری حرارتی آنزیم دارای خلوص نسبی.. 37

3-4-5- اثر pH بر پایداری آنزیم دارای خلوص نسبی.. 37

3-4-6- روش بررسی اثر یونهای فلزی و EDTA بر فعالیت آنزیمی.. 38

4- نتایج.. 40

سویه 1390BR.. 40

4-2- سینتیک رشد و تولید آنزیم آلفا آمیلاز. 41

1390BR.. 42

4-4- خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز. 43

4-4-1- اثر pH و دما بر فعالیت آلفا امیلاز. 43

4-4-2- اثر دما بر پایداری آلفا آمیلاز سویه 1390 BR.. 44

4-4-3- اثر pH بر پایداری آنزیم آلفا آمیلاز. 45

) 46

4-7- اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم.. 47

5- بحث و نتیجه گیری.. 50

پیشنهادات.. 54

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان                                                                                                    صفحه

جدول 1- 1. کاربردهای مختلف آنزیم­ها. 4

جدول 1-3) ترکیبات بافر Mix. 28

جدول 3-2) نام و اجزاء محیط کشت­های مورد استفاده. 29

جدول 3-2) اجزاء محیط کشت جامد. 29

جدول 3-3. موادلازم در تهیه محلول برادفورد. 35

جدول 4-1) اثر یون­های فلزی بر فعالیت آنزیم. 48

 

 

فهرست شکل­ها

 

 

عنوان                                                                                                 صفحه

شکل 1-1) منابع تجاری آنزیم­ها. 3

شکل 1-2) گرانول نشاسته در گیاهان مختلف (الف: نشاسته سیب زمینی شیرین، ب: نشاسته سیب زمینی، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج) 5

شکل 1-3) ساختار آمیلوز (الف) و آمیلوپکتین(ب). 6

شکل 1-4) انواع آمیلازها و عملکرد و محصول آنها. 10

     12

شکل 1-6) یون­های کلسیم در ساختار آلفا آمیلاز. 13

شکل 4-1) کلنی باکتری 1390BR در محیط نشاسته- آگار. هاله تشکیل شده اطراف کلنی­ها نشان دهنده فعالیت آلفا آمیلازی می­باشد. 40

 

فهرست نمودار­ها

 

 

عنوان                                                                                                         صفحه

نمودار 3-1) منحنی استاندارد غلظت­های مختلف D-مالتوز در طول موج nm 540.. 34

نمودار 4-1) رشد باکتری 1390BR.. 41

نمودار 4-2) تولید آنزیم برحسب زمان پس از القا نشاسته 1/0%. 41

نمودار 4-3) کروماتوگرام ستون DEAE Cellulose. 42

نمودار 4-4( اثر pH بر فعالیت آلفا آمیلاز در دمای ˚C 70. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در0/6 ~pH می­باشد که 100% در نظر گرفته شده است. 43

نمودار 4-5( اثر دما بر فعالیت آنزیم در0/ 7~pH. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در دمای ˚C 70 می­باشد که 100% در نظر گرفته شده است. 44

نمودار 4-6) پایداری فعالیت آنزیمی در دماهای مختلف در طی زمان.. 45

نمودار 4-7) پایداری آلفا آمیلاز در pH مختلف پس از یک ساعت انکوباسیون.. 45

نمودار 4-8) نمودار میکائیلیس- منتن 46

نمودار 4-9) نمودار هانس- ولف… 47

مقدمه

1-1- آنزیم­ها

آنزیم­ها، پروتئین­های کروی و مسئول بسیاری از واکنش­های ضروری بیوشیمیایی در میکروارگانیسم­ها، گیاهان و جانوران هستند. آنزیم­ها نقش­های مختلفی ایفا می­ کنند و بدون اینکه خودشان تغییر یابند، توانایی منحصر به فردی در تسـهیل و تسـریع واکنش شیمیایی دارند (Mojsov et al., 2012).

در سیستم طبقه بندی بین المللی آنزیم­ها[1] براساس عملکرد به شش دسته تقسیم می­شوند:

EC1: اکسیدوردوکتاز­ها؛ کاتالیز واکنش­های اکسیداسیون- احیا

EC2: ترانسفراز­ها؛ کاتالیز انتقال گروه­های عاملی