تابستان 1392

 

 

 

 

 

عنوان                                                  شماره صفحه

چکیده.. 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه.. 3

1-2- بیان مسئله.. 4

1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق.. 5

1-4- ادبیات تحقیق.. 6

1-5- اهداف تحقیق.. 10

1-5-1 اهدف کلی.. 10

1-5-2 اهداف جزئی.. 10

1-5-3 اهداف کاربردی.. 11

1-6- سؤالات تحقیق.. 11

فصل دوم: بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- خلیج فارس.. 13

2-2- استان بوشهر.. 14

2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی.. 15

2-4- ورود نفت به آب دریا.. 17

2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا.. 17

2-5-1 پراکنده شدن.. 18

2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب.. 18

2-5-3 حل شدن.. 18

2-5-4 تبخیر شدن.. 18

2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی.. 18

2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن.. 19

2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی.. 19

2-5-8 ته نشین شدن.. 19

2-6- تجزیه‌زیستی.. 20

2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک.. 20

2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک.. 20

2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک.. 21

2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی.. 22

2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک.. 23

2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده.. 27

2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان.. 27

2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا می‌کند؟.. 27

2-8- فنل.. 28

2-8-1 کلیات ترکیب فنل.. 28

2-8-2 نام‌گذاری.. 28

2-8-3 فنول‌های طبیعی.. 29

2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی.. 29

2-8-5 خواص فیزیکی.. 29

2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده.. 30

2-8-7 کاربردها.. 30

2-9- تجزیه‌زیستی.. 30

2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی.. 31

2-9-2 مبانی زیست‌درمانی.. 32

2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی.. 32

2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی.. 32

2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها.. 33

2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها.. 33

2-9-7 کو‌متابولیسم.. 34

2-9-8 دی‌نیتریفیکاسیون.. 34

2-9-9 کمپوست کردن.. 34

2-9-10 درمان بیولوژیکی.. 34

2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک.. 35

2-11- مسیر های تجزیه زیستی.. 36

2-11-1 تجزیه میکروبی فنل.. 36

2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین.. 39

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده.. 44

3-1-1 محیط ONR7a. 44

3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار.. 45

3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار.. 45

3-1-4 محیط مارین براث (MB).. 45

3-1-5 محیط مارین آگار (MA).. 46

3-1-6 محیط نوترینت براث (NB).. 46

 

3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA).. 46

3-2- محلول‌ها.. 47

3-2-1 سرم فیزیولوژی.. 47

3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA).. 47

3-2-3 محلول Tris-Base. 48

3-2-4 محلول TBE.. 48

3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE) 48

3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید.. 48

3-3- مواد مصرف شده در PCR.. 49

3-4- دستگاه‌های مورد استفاده.. 49

3-5- روش عملی.. 50

3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده   50

3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط.. 51

3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف.. 51

3-5-2-2 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده نفتالین.. 51

3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل.. 51

3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده.. 51

3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده.. 51

3-5-3-2 تست های تکمیلی.. 52

3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری.. 52

3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24) 52

3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل.. 52

3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین.. 52

3-5-4 شناسایی باکتری ها.. 53

3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم.. 53

3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده.. 54

3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.. 54

3-5-4-4 بررسی محصول PCR.. 54

3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 55

 

 

فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- نمونه برداری.. 57

4-2- شمارش باکتری ها.. 58

4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها.. 58

4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها.. 60

4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین.. 61

4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده.. 62

4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل.. 62

4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین.. 62

4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین.. 63

4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین   63

4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24).. 67

4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک.. 71

4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین.. 71

4-5-3-2 سنجش حذف فنل.. 73

4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک   75

4-6-1 بررسی محصول PCR.. 75

4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 76

4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها.. 92

4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها.. 94

 

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 97

5-2- پیشنهادات.. 100

منابع و مآخذ.. 101

فهرست منابع فارسی.. 101

فهرست منابع انگلیسی.. 103

چکیده انگلیسی.. 108

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

عنوان                                                  شماره صفحه

جدول 2-1: 28 ترکیبات آروماتیک به ترتیب میزان سمیت. 23

جدول 3-1: ترکیبات محیط کشت ONR7a. 44

جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت مارین براث (MB) 45

جدول 3-3: ترکیبات محیط کشت نوترینت براث. 46

جدول 3-4: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

جدول 3-5: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47

جدول 3-6: توالی و خصوصیات پرایمر‌های مورد استفاده جهت شناسایی ژن 16 SrRNA.. 49

جدول 3-7: دستگاه های مورد استفاده و مدل آنها. 49

جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در  PCR با پرایمرهایAlk  54

جدول 4-1: نامگذاری و معرفی نقاط نمونه گیری بر حسب مشخصات جغرافیایی  57

جدول 4-2: نتایج شمارش باکتری‌های هتروتروف. 59

جدول 4-3: نتایج شمارش کل باکتری های تجزیه کننده. 60

جدول 4-4: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل در طول موج 600 نانومتر. 64

جدول 4-5: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین در طول موج 600 نانومتر. 65

جدول 4-6: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین  68

جدول 4-7: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل. 70

جدول 4-8: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف نفتالین. 72

جدول 4-9: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف فنل. 74

جدول 4-10: برنامه رسم درخت فیلوژنی سویه ها. 92

جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله های ژنتیکی سویه ها. 94

جدول 4-12: فاصله ژنتیکی سویه ها. 94

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                    شماره صفحه

نمودار 2-1: مسیر تجزیه میکروبی فنل. 36

نمودار 2-2: مسیر تجزیه میکروبی نفتالین. 39

نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب   73

نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب   74

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                   شماره صفحه

شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن. 21

شکل 2-2: فرمول ساختاری بنزن. 21

شکل 2-3: نمایش موقعیت جانشینی روی حلقه دی متیل بنزن. 21

شکل 2-4: برخی از آروماتیک های چند هسته ای فشرده. 22

شکل 2-5: فرمول تترالین یا تتراهیدرونفتالن. 22

شکل 2-6: مکانیسم های بروز سرطان. 26

شکل 2-7: فرمول ساختاری فنل. 28

شکل 4-1: پوشش کارشناس و نحوه قرار گیری صحیح در حین انجام کار با ترکیبات آروماتیک زیر هود. 62

شکل 4-2: نمونه‌های کشت داده شده در محیط اختصاصی به اضافه فنل و نفتالین. 63

شکل 4-3: نتایج تست E24 فعالیت امولسیون کنندگی. 67

شکل 4-4: فاز آلی و آبی تفکیک شده در دکانتور, فاز آلی در قسمت بالا شامل هگزان و نفتالین و فاز آبی در پایین شامل ترکیبات محیط کشت اختصاصی و باکتری می باشد.. 71

شکل 4-5: بررسی محصول PCR بر روی ژل آگارز. 75

شکل 4-6: درخت فیلوژنی نمونه‌ها. 92

شکل 4-7: درخت فیلوژنی نمونه‌های جداسازی شده با مشخص بودن نتایج BLAST.. 93

 

 

 

چکیده

ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌ های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این