فهرست مطالب

عنوان                                                                                    صفحه

چکیده فارسی                                                                                          1

فصل اول :کلیات تحقیق                                                                              2

• بیان مسئله 3

1-2- کلیات                                                                                         5

1-2-1، تاریخچه                                                                                     5

1-2-2، باکتریولوژی سالمونلا                                                                      6

1-2-3، تست ها و خواص بیوشیمیایی                                                            6

1-2-4، طبقه بندی سالمونلا                                                                        7

1-2-5، آنتی ژن های سالمونلا                                                                     9

1-2-6، عوامل دخیل در بیماریزایی در سالمونلا                                                  12

1-2-7. بیماری های ناشی از سالمونلا                                                             13

1-2-8. اپیدمیولوژی سالمونلا                                                                       16

1-2-9، تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا                                                           16

1-2-10. پیشگیری و کنترل                                                                        19

1-2-11، ایمنی                                                                                                19

1-2-12، درمان                                                                                                19

1-3 – مروری بر روش های تایپینگ باکتری ها                                                  20

1-3-1- اصول و مبانی روش MLVA                                                                    22

1-2-3- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA                                           24

1-3-3- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ                                26

1-4- اهداف پایان نامه                                                                              31

1-4-1- هدف علمی پایان نامه                                                                     31

1-4-2- اهداف جزئی                                                                               31

1-4-3- اهداف کاربردی                                                                                     31

1-5- فرضیه ها                                                                                       31

1-6- سئوالات                                                                                        31

1-7- ضرورت انجام تحقیق                                                                        32

1-8- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق                                                          32

1-9- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی                                                              32

فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق                                                         34

بررسی متون:                                                                                           35

فصل سوم :مواد وروشها                                                                              39

3-1-مواد و تجهیزات                                                                                40

3-1-1-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز:                                                              40

3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز:                                                                     41

3-1-3- محیطهای کشت مورد استفاده:                                                            41

3-2-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها                                                42

3-2-1-تهیه محلول(%25) SDS:                                                                 42

3-2-2- محلول  EDTA(5/0 مولار):                                                           42

3-2-3-تامپون لیز کننده سلول                                                                      42

3-2-4- تامپون TE حاوی RNase                                                             42

3-2-5- بافر(5X)TBE:                                                                          42

3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI):                                                43

3-3- روش انجام طرح:                                                                             44

3-3-1- نوع مطالعه:                                                                                 44

3-3-2-جامعه مورد مطالعه:                                                                         44

3-3-3- جمع آوری اطلاعات:                                                                     44

3-3-4- انجام امور باکتریولوژیک:                                                                44

3-4- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با بهره گرفتن از روش MLVA                                     46

 

3-4-1- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR                                      46

3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR                                                                  50

3-4-3- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR                                         52

3-4-4-تجزیه و تحلیل داده های VNTR                                                       52

فصل چهارم یافته ها                                                                                  54

4-1- نمتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها                                                       55

4-2- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی                                                    57

4-3- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR                      58

4-4- میزان تنوع الل های VNTR                                                                74

4-5- آنالیز داده ها با بهره گرفتن از الگوریتم Minimum Spanning Tree                           74

4-6- آنالیز داده های VNTR با بهره گرفتن از روش NJ                                          75

فصل پنجم :بحث ونتیجه گیری                                                                      77

5-1- بحث                                                                                           78

5-2- نتیجه گیری و جمع بندی                                                                     91

منابع:                                                                                                    92

چکیده انگلسی                                                                                        96

فهرست جداول و نمودارها

عنوان                                                                                     صفحه

جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا                                                     8

جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه ها                            9

جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی                                             47

جدول 3-2،مقادیرموردنیازجهت انجام واکنش هایPCRبرای تکثیرلوکوس­هایVNTR    48

جدول 3-3، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2،

SENTR3 و SE-7                                                                               49

جدول3-4،برنامه ریزی دستگاه­ترموسایکلرجهت تکثیرلوکوس­هایENTR6وSE-8                  49

جدول 3-5، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4                       49

جدول 3-6،  برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-10                            50

جدول 3-7، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس  SE-6                    50

جدول 4-1، در فایل EXCEL                                                                    73

جدول 4-2، ضریب تنوع هانتر- گاتسون برای هر لوکوس محاسبه شده                        74

نمودار 4-1، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر            56

نمودار 4-2، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر              56

فهرست اشکال

عنوان                                                                                    صفحه

شکل 1-1 تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی.                                              5

شکل1-2 باکتری سالمونلا                                                                           6

شکل 1-4مای شماتیک از VNTR ها                                                            23

شکل 1-5 پروفایل اللی                                                                                       24

شکل 1-6 آنالیز MLVA بوسیله MST                                                                   25

شکل 1-7، مزایای  MLVA                                                                       26

شکل 1-8، مراحل انجام MLVA                                                                 27

شکل 4-1، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 53                                        57

شکل 4-2، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 24                                        57

شکل 4-3، لوکوس ENTR6                                                                      58

شکل 4-4، لوکوس SE4                                                                           59

شکل 4-5، لوکوس SE4                                                                           60

شکل  4-6، لوکوسSE6                                                                           61

شکل 4-7، لوکوس SE6                                                                           62

شکل 4-8، لوکوسSE7                                                                            63

شکل 4-9، لوکوسSE7                                                                             64

شکل 4-10، لوکوسSE8                                                                          65

شکل 4-11، لوکوسSE8                                                                          66

شکل 4-12، لوکوسSE10                                                                        67

شکل 4-13، لوکوسSE10                                                                        68

شکل 4-14، لوکوسSENTR2                                                                   69

شکل 4-15، لوکوسSENTR2                                                                   70

شکل 4-16، لوکوسSENTR3                                                                   71

شکل 4-17، لوکوسSENTR3                                                                   72

شکل 4-18، آنالیز داده های VNTR با بهره گرفتن از الگوریتم MST.                          75

شکل  4-22، درختچه ی NJ                                                                      76  

 

چکیده فارسی :

مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود. سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی  در تهران  بر پایه ی روش MLVA.

مواد و روش ها: در این پژوهش، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با بهره گرفتن از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.

نتایج: 10 ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با بهره گرفتن از روش MST، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریتیدیس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با بهره گرفتن از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.

بحث و نتیجه گیری: نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تکنیک MLVA، یک روش قدرتمند و آسان می باشد و می توان از این تکنیک در اپیدمی ها ی ناشی از سالمونلا انتریتیدیس استفاده نمود.

کلمات کلیدی: سالمونلا، MLVA، VNTR

کلیات تحقیق

 

• بیان مسئله

سالمونلا[1] باسیل گرم منفی،واجدتاژک پری تریش وجزءخانواده­ی­انتروباکتریاسه­می­باشد.گروه سالمونلا شامل یک جنس منفرد به نام سالمونلا است. این جنس شامل ارگانیسم هایی است که قبلا تحت عنوان سالمونلا و آریزونا شناخته می شدند. وقتی سالمونلا ها از طریق مسیر خوراکی به انسان و حیوانات منتقل شوند، بیماریزا هستند. این باکتری از طریق حیوان و فروارده های حیوانی به انسان سرایت     می کنند و موجب تب روده ای، مسمومیت های غذایی و گاستروانتریت در انسان می شوند(7).

طبقه بندی سالمونلا در طی سالیان متمادی دچار تغییرات زیادی شده است. سالمونلا گروه بزرگی از باکتری های روده ای شامل تقریبا 2200 سروتایپ می باشد. بر مبنای مدل اخیر طبقه بندی CDC تنها یک گروه منفرد از سالمونلا وجود دارد که به هفت زیر گروه(1،2،،a3،b3،4،5،6) طبقه بندی می شوند. طبقه بندی اخیر بر مبنای شباهت ژنتیکی ایزوله های سالمونلا) 16S r RNA) است. سیستم های طبقه بندی قدیمی تر شامل 1) طبقه بندی کافمن_وایت: که هر سروتایپ را به صورت یک گونه منفرد سالمونلا شناسایی می کند. 2) سیستم ادواردز_اوینگ: که سالمونلاها را به سه گونه( سالمونلا کلراسوئیس، سالمونلا تایفی، سالمونلا انتریتیدیس) و صدها سروتایپ تقسیم بندی می کند. 3) مدل هیبریداسیون DNA: که سالمونلا ها را به یک گونه به نام سالمونلا انتریتیدیس و زیر گونه های اریزونه[2]، بونگوری[3]، دی اریزونه[4]، انتریکا[5]، سالاما[6]،هاتنا[7]، تقسیم می نمایند که طبقه بندی CDC        با کمی تغییر از همین طبقه بندی استفاده می کند (4-6).

روش های مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه های محیطی وجود دارند که شامل: روش های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژی و مولکولی می باشد. در کشت سنتی از محیط های پیش انتخابی و اختصاصی نظیر S.S Agarو XLD Agar استفاده می شود. روش های سرولوژی براساس واکنش انتی بادی با انتی ژن تولیدی توسط باکتری می باشد.

استفاده از روش های سرولوژیک بدلیل تنوع گسترده خصوصیات آنتی ژنتیکی باکتریایی و نیاز به طیف گسترده و وسیعی از آنتی بادی ها و همچنین هزینه گزاف تولید و مصرف آن، به مرور جایگاه خود را از دست داده اند. تا کنون از روش های مولکولی متنوعی جهت ژنوتایپینگ گونه های مختلف سالمونلا استفاده شده است. به کارگیری این روش ها، اهمیت ویژه ای در پژوهش های اپیدمیولوژیکی دارد . با شروع عصر مولکولی دانشمندان رویکرد خود را از فنوتیپ به ژنوتیپ تغییر داده اند.

عنوان                                                         فهرست مطالب                                   صفحه

1  فصل اول:  مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………. 1

1- 1  بیماری های قلبی………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2  تعریف آترواسکلروزیس………………………………………………………………………………………………….. 2

1-3  عواملی که در ایجاد آترواسکلروزیس حضور دارند………………………………………………………. 3

1-3-1  سلول های درگیر در آترواسکلروزیس………………………………………………………………… 3

1-3-2  اکسیداسیون و آترواسکلروزیس…………………………………………………………………………. 6

1-3-3  التهاب و استرس های اکسیداتیو……………………………………………………………………….. 7

1-3-4  شکل گیری پلاک ها…………………………………………………………………………………………… 9

1-3-5  آشفتگی در مکانیسم های حفاظتی…………………………………………………………………… 9

1-4  عواملی که خطر بیماری آترواسکلروزیس را افزایش می دهد…………………………………….. 10

1-4-1  کاهش غلظت HDL-C  …………………………………………………………………………………. 10

1-4-1-1  ژنتیک های HDL – C…………………………………………………………………………. 11

1-4-1-2  نقش های متفاوت HDL – C………………………………………………………………. 11

1-4-2  افزایش فشارخون………………………………………………………………………………………………… 16

1-4-2-1  سیستم های درگیر در فشارخون……………………………………………………………. 16

1-4-3  سیگارکشیدن……………………………………………………………………………………………………….. 17

1-4-4  ژنتیک و آترواسکلروزیس……………………………………………………………………………………. 17

1-4-4-1  ژنتیک های Dyslipidemia……………………………………………………………….. 17

1-4-4-2  پلی مورفیسم های ژنتیکی در نیتریک اکسیدسنتاز اندوتلیالی…………….. 18

1-4-4- 3  پلی مورفیسم هادر گلوتاتیون پراکسیداز ( GPx )…………………………….. 18

1-4- 4-4  پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین…………………………………………….. 19

1-4-4-5  پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن……………………………………………………………. 19

1-4-4-6  واریانت های میتوکندریایی………………………………………………………………………. 20

1-4-5  نقش آلودگی………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5  عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند………………………………………………………. 21

1-5-1  استروژن ها…………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5- 2  آنتی اکسیدان ها  و عمکرد آنها………………………………………………………………………… 21

1-5-3  پرهیزهای غذایی………………………………………………………………………………………………….. 22

1-5-4  ورزش……………………………………………………………………………………………………………………. 23

1-6  سیستم RAAS و عملکرد آن……………………………………………………………………………………. 23

1-7  طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان…………………………………………………………….. 25

1-7-1  رنین……………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-7-2  آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2…………………………………………………………………. 25

1-7-3  آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2.  26

1-7-4  رسپتورهای 1 و 2………………………………………………………………………………………………. 27

1-8  التهاب و سیستمRAAS…………………………………………………………………………………………….. 29

1-9  واریانت ها در ژن AGT……………………………………………………………………………………………….. 30

1-10 RAAS  موضعی……………………………………………………………………………………………………….. 30

1-10-1 RAAS  موضعی در قلب……………………………………………………………………………….. 31

1-11  تولید آنژیوتانسین بافتی……………………………………………………………………………………………… 31

1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف )……………………………………….. 31

1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی……………………………………………………………………. 32

1-11-3  تولید آنژیوتانسین در داخل سلول…………………………………………………………………… 32

1-12  تاثیرات RAAS  روی سلول های قلبی………………………………………………………………….. 33

1-13  تاثیرات RAAS روی جریان کرونری………………………………………………………………………. 34

1-14  تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان……………………………………………………………… 34

1-15  جداسازی و خالص سازی DNA……………………………………………………………………………… 36

1-16 واکنش زنجیره پلی مراز  ……………………………………………………………………………………………. 38

1-16-1  مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز………………………………………………………. 39

1-16-2 طراحی پرایمر  ………………………………………………………………………………………………….. 40

 

1-16-3 دمای اتصال پرایمر  ……………………………………………………………………………………………. 41

1-17  الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-18  روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک………………………………………………………………………………… 43

1-19  یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP………………………………………………………………. 44

1-20 تعیین توالی بازهای DNA ………………………………………………………………………………………. 46

1-21 مروری بر مطالعات گذشته…………………………………………………………………………………………… 48

1-22 اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2   فصل دوم : مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-1  مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………… 54

2-2  بافرها و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………… 55

2-2-1  روش تهیه EDTA……………………………………………………………………………………………. 55

2-2-2  روش تهیه الکل 75/…………………………………………………………………………………………… 55

2-2-3  روش تهیه پرایمرها………………………………………………………………………………………………. 55

2-2-4  روش تهیه اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………………….. 55

2-2-5  روش تهیه بافر TBE 10X……………………………………………………………………………… 56

2-2-6  روش تهیه بافر TBE ./5X……………………………………………………………………………… 56

2-2-7  روش تهیه لودینگ بافر PCR…………………………………………………………………………… 56

2-2-8  روش تهیه لودینگ بافر SSCP………………………………………………………………………… 57

2-2-9  روش تهیه محلول NAOH………………………………………………………………………………. 57

2-2-10  روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/………………………………………………………………….. 57

2-3  کیت استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 57

2-4  تکنیک PCR………………………………………………………………………………………………………………… 59

2-4-1  شرایط تکثیر قطعه مورد نظر……………………………………………………………………………… 60

2-4-2  مراحل PCR………………………………………………………………………………………………………. 61

2-5  الکتروفورز ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………… 61

2-6  آنالیز ژل SSCP…………………………………………………………………………………………………………… 62

2-7  آماده سازی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………………………………………… 62

2-8  مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP…………………………………………………………………………………… 63

3  فصل سوم : نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4  فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………… 72

4-1  نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………. 76

4- 3  پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………… 77

4-4  مراجع……………………………………………………………………………………………………………………………… 78

عنوان                                                   فهرست شکل ها                                      صفحه

شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس……………………………………………………………….. 10

شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C………………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS………………………………………………………………………………………. 24

شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS ………………………………………………………………….. 28

شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS …………………………………………………….. 29

شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب……………………………………………………….. 33

شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب………………………………………………………………………………….. 35

شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز…………………………………………………………………………………………………. 40

شکل 1-9 : ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 43

شکل 1-10 : روش SSCP …………………………………………………………………………………………………………….. 46

شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز…. 65

شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………… 66

شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T  با بهره گرفتن از تکنیک SSCP  و تعیین توالی………… 67

شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C  با بهره گرفتن از تکنیک SSCP  و تعیین توالی………… 67

شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T……………………………………………………………. 68

شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C…………………………………………………………….. 65

شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M …………………………………………………………………. 66

شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T …………………………………………………………………. 66

شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus… 67

شکل 3-10 : نتیجه Blastn  برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus…..  67

عنوان                                                      فهرست جداول                                       صفحه

جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2…………………………………………………….. 28

جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف……………………………………………. 45

جدول 2-1 : مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه………………………………………………………………………………….. 59

جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25………………………………….. 60

چکیده :

آترواسکلروزیس “بیماری اصلی عروق کرونر قلب”  بیماری است که بر روی شریان های بزرگ و متوسط بدن تاثیر می گذارد.  انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری از فرایندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS  یک سیستم مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGT  نخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.

این مطالعه بر روی دومین اگزون ژن AGT  (آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر شده با روش SSCP 5 برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و 4360C>T  مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین (M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M) تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسمایی AGT  و افزایش فشارخون را به همراه دارند.

کلمات کلیدی:آترواسکلروزیس، آنژیوتانسینوژن،  PCR-SSCP، موتاسیون، آنژیوتانسین 2، فشار خون  بالا

فصل اول:

 

مقدمه

 

• 1 بیماری­های قلبی:

بر طبق آمار منتشر شده بیماری های قلبی در سال 2012، هر ساله در آمریکا حدود 795000 نفر با حمله قلبی مجدد (عود کننده) مشاهده می شوند، و در هر 40 ثانیه یک نفر از هر 18 نفر در نتیجه حمله  قلبی دچار مرگ می شود. سالانه میلیون ها دلار صرف هزینه های درمان بیماری های قلبی می گردد. اگرچه میزان مرگ و میر در بیماران قلبی کاهش یافته است، اما ظرفیت باقی مانده هنوز هم بالا است (1).

• 2 تعریف آترواسکلروزیس[1]:

تصلب شرایین یا سختی رگ ها (آترواسکلروزیس)، یک بیماری عروقی است و نوعی از آرتریواسکلروزیس  (Arteriosclerosis) است که با رسوب لیپید و مواد دیگر بر روی دیواره داخلی برخی رگ ها مشخص می گردد. نتیجه این فرایند

فهرست مطالب

فصل اول

کلیات

1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………..2

1-2 اجزاء نفت خام……………………………………………………………………………………………………..4

1-3 اهداف کلی و جزئی………………………………………………………………………………………………7

1-4 اهمیت شناسایی و بررسی منابع نفتی………………………………………………………………………….9

1-5 فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………..10

1-6 سوالات تحقیق……………………………………………………………………………………………………11

فصل دوم

پیشینه پژوهش

2-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………13

2-2 نظریه منشاء آلی نفت………………………………………………………………………………………….15

2-3 میکروبیولوژی نفت………………………………………………………………………………………………17

2-3-1 ارتقاء کیفی…………………………………………………………………………………………………….19

2-3-2 ارتقاء کمی…………………………………………………………………………………………………….20

2-4 ارتقاء زیستی یا Bio upgrading ……………………………………………………………………….21

2-5 تولید اولیه نفت…………………………………………………………………………………………………..21

2-5-1 تولید اسید آلی که منجر به انحلال سنگهای کربناتی و توسعه کانال ها می شود………….21

2-5-2 احیای گوگرد ونیترات در ترکیبات گچی و انیدریدی و مواد معدنی سولفاتی که نفت

به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22

2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای

مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22

2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23

2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23

2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23

2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24

2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم

روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26

3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27

3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27

3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28

3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29

3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31

3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32

3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33

3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34

3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34

3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35

3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35

3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37

3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37

3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38

3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39

فصل چهارم

 

 

نتایج

4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41

4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41

4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42

4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42

4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43

4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44

4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45

فصل پنجم

بحث و نتیجه گیری

5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48

5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48

5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52

5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55

5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58

فهرست جداول

جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3

جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44

جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45

فهرست نمودار

نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

چکیده

حضور وسیع باكتریهای بی‌هوازی و آركی‌ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است.  فرایندهای آرام بی‌هوازی در زیر زمین فراوان می‌باشد كه به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروكربن‌ها كه در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میكروارگانیزم‌هایی كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و كربن می‌باشند، با تولید یكسری محصولات جانبی و یا با شكستن تركیبات هیدروكربنی سنگین كمك شایانی در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.

در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده از هیدروکربن های ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با بهره گرفتن از   serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها  به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB  )  اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با بهره گرفتن از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.

کلمات کلیدی :  نفت خام ، باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

فصل اول

 

کلیات

 

• مقدمه

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) به منظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرایندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن  در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی  Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک  با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده.  از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S )  و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است.  در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی  و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس  و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

 

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنصر	حداقل درصد وزنی	حداکثر درصد وزنی
کربن	2/82	1/87
هیدروژن	8/11	7 / 14
گوگرد	1/0	5/5
اکسیژن	1/0	5/4
نیتروژن	1/0	5/1

 

 جهت مقایسه ی انواع نفت خام نمی توان از آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده ی آن استفاده کرد. بدین منظور از آزمایشات استانداردی استفاده میشود که تعیین کننده ی قیمت نفت خام خواهد بود ( 7 ).

کلمه ی نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده می شود از دو کلمه ی petra و oleum که در زبان یونانی به ترتیب به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن می باشند تشکیل شده است . منابع انرژی در طبیعت شامل نفت، زغال سنگ، انرژی هسته ای، انرژی الکتریکی و غیره می باشد. با توجه به محدودیت منابع انرژی و اهمیت صرفه جویی در مصرف و آلودگی های زیستی ناشی از ان تحقیقاتی در زمینه ی علوم مختلف جهت مصرف بهینه و کاهش آلودگی های محیط زیست انجام شده است. به مجموعه تست هایی که شناسه ی نفت خام را مشخص میکنند crude assay گفته میشود. از جمله این خواص : اندازه گیری وزن مخصوص ، گوگرد ، نمک ، آب و مواد رسوبی ، گرانروی ، نقطه ی ریزش ، محدوده ی تقطیر ، ناخالصی های فلزی  و کربن باقی مانده میباشند. درجه ی API نفت خام در اکثر موارد بین10 تا 45 می باشد و به ندرت کمتر از 10 یا بالاتر از 50 میباشد.

نفت خام سنگین: با درجه API 10 الی 20

نفت خام متوسط: با درجه API 20 الی 30

نفت خام سبک: با درجه API بیش از 30

در یک دسته بندی کلی محصولات حاصل از نفت خام ایران شامل:

1-سوخت های گرمایشی

2-سوخت ماشین های درون سوز

 

فهرست مطالب

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………..1

فصل اول (کلیات تحقیق و مقدمه)…………………………………………………………………………………………………….2

1-1-بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………..5

فصل دوم (مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه آن)……………………………………………………………………………….7

2-1-کلیات (تاریخچه سابقه مطالعه و تحقیق کفزیان در ایران و جهان ………………………………………………….8

2-2-معرفی استان سمنان…………………………………………………………………………………………………………………9

2-3-چشمه های استان سمنان ……………………………………………………………………………………………………….11

2-4-معرفی مهم ترین راسته ها و خانواده های ماکروبنتوزهای آبهای شیرین ایران………………………………….12

2-5-راسته بهاره ها (پلکوپترا)……………………………………………………………………………………………………….12

2-6-راسته یکروزه ها(افموپترا)………………………………………………………………………………………………………16

2-7-راسته دوبالان (دیپترا)…………………………………………………………………………………………………………….23

2-8-بال موداران(تریکوپترا)…………………………………………………………………………………………………………..32

2-9-راسته ناجورپایان(آمفی پودا)…………………………………………………………………………………………………..37

2-10-رده تورکیان……………………………………………………………………………………………………………………….38

فصل سوم (مواد و روش کار)………………………………………………………………………………………………………….40

3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………..41

3-2-وسایل نمونه برداری کفزیان…………………………………………………………………………………………………..41

3-3-نگهداری نمونه ها ………………………………………………………………………………………………………………..43

3-4-شناسایی ماکروبنتوزها……………………………………………………………………………………………………………43

3-5-دانه بندی رسوبات و تعیین موادآلی………………………………………………………………………………………….43

3-6-تعیین موقعیت ایستگاه های مطالعاتی………………………………………………………………………………………..44

3-7-منطقه مورد بررسی………………………………………………………………………………………………………………..47

3-8-عملیات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………………………………..52

3-9-سنجه یا معیار جمعیتی………………………………………………………………………………………………………….52

3-10-شاخص ها…………………………………………………………………………………………………………………………53

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………….56

4-1-رده بندی نمونه های موجود……………………………………………………………………………………………………57

فصل پنجم (بحث)………………………………………………………………………………………………………………………99

5-1-بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………..100

5-2-پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………..107

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………10 9

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………109

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………………….113

چکیده انگلیسی …………………………………………………………………………………………………………………………121

 

چكیده

تنوع و فراوانی بی مهرگان آبزی بر حسب شرایط محیطی متفاوت می باشند، بنابراین با توجه به حساسیت آنها نسبت به آلاینده های مختلف می توان شرایط آب از نظر آلودگی را ارزیابی نمود.  در این مطالعه تركیب و تنوع ماکروینتوزهای استان سمنان  در سال 1391-92 در چهار ایستگاه(چشمه های باداب سورت،چشمه قل قل وزرابه)،مورد بررسی و شناسایی قرار گرفت.

در این بررسی به منظور شناسایی ماکروبنتوزهای چشمه های باداب سورت قل قل زرابه و کورچشمه استان سمنان بدین منظور از بهمن ماه سال  1391لغایت مرداد ماه 1392 چهار ایستگاه(چشمه های باداب سورت قل قل زرابه و کورچشمه) انتخاب و بصورت فصلی و با بهره گرفتن از قاب توری ((Surber sampler 50×50 سانتی متر به مدت هفت ماه مورد نمونه برداری قرار گرفت و نمونه های جمع آوری شده را با فرمالین 4% تثبیت و جهت بررسی به آزمایشگاه منتقل گردیدند.  برخی شاخص های تعیین كیفیت آب كه بر فیزیولوژی موجودات بنتوزی و نیز كیفیت آب اثر گذار هستند از قبیل(اكسیژن محلول، دما،pH، TDS کل جامدات محلول، EC هدایت الكتریكی ، O2، دبی آب) مورد سنجش قرار گرفتند.  شاخص مارگالف، سیمپسون و شانون نیز برای تمامی ایستگاه ها در طول دوره نمونه برداری محاسبه گردید. براساس نتایج به دست آمده از این بررسی 25 خانواده از 13 راسته ،شامل:, Simuliidae, Tipulidae, Veliidae, Batidae, Stratiomyiidae, Tubificidae ,Anthomyiidae, Gomphidae Lestidae ,Glossiphonidae, Erpobdellidae, Corduliidae Dreissensiidae, Physidae, , Ancylidae, Tabanidae, Chironomidae, Argyronetidae, Gammaridae, Potamidae, Asellidae,Hydropsychidae Ceratopogonidae, Platycnemididae, ,Coenagrionidae, , در مجموع چهار ایستگاه شناسایی شد
واژگان كلیدی: آلودگی، سوربر، پارامترهای فیزیكوشیمیایی، ماكرو بنتوز، شاخص مارگالف, شاخص شانون،شاخص سیمپسون

فصل اول

 

کلیات تحقیق

مقدمه
آب های شیرین زیستگاه طبیعی گونه های فراوانی ازآبزیان است که هر یک تا حدودی دارای فون وفلور مخصوص به خود می باشد. بنا به عقیده روزنبرگ(Rosenberg,1999)  مهمترین ذخایر آبزی آب های شیرین، بی مهره گان کفزی ساکن آنها می باشند که در شبکه ی غذایی و تولیدات رودخانه نقش اساسی دارند. همچنین برای تعیین کیفیت محیطی رودخانه ها و پایش بیولوژیکی آنها به کار می روند. در این راستا، موجودات شاخص و عکس العمل های آنها را نسبت به شرایط محیطی در نظر می گیرند. بطورکل محققین، اندازه گیری پارامترهای فیزیکی و شیمیایی  آب را به مانند برداشت عکس و بررسی بیولوژیکی (بخصوص ماکرو بنتوزها) را مشابه تهیه فیلم ویدیویی از یک اکوسیستم می دانند(Rosenberg,1999). در واقع تنها راه عملی و به صرفه اقتصادی برای تعیین سلامت اکولوژیکی آب ها و تعیین اینکه آیا فعالیتهای انسانی موجب کاهش کیفیت آنها می شود، ارزیابی و پایش بیولوژیکی است(Lenat,1993). ایده اصلی فرابینی زیستی بسیار ساده است زیرا انواع جانداران آب های شیرین در شرایط معین کیفیت آب قادر به حیاتند. زمانی که شرایط تغییر می کند؛ مثلاً وقتی که یک چشمه مقادیر قابل توجهی از آلودگی دریافت می نماید، فراوانی، توزیع و ترکیب جمعیت موجودات آبزی در منطقه مورد اثر تغییر میکند و بی مهره گان کفزی از رایج ترین ارگانیزم های بکار رفته در این مقوله اند.
تعداد شاخص۵ برابر تمام شاخص هایی است که در ارتباط با سایر گروه ها  (جلبک ها وماهیان) وجود دارد. همچنین رینولدسون بیان می دارد که بی مهره گان کفزی، مؤثرترین گروه بوده و امروزه از اساسی ترین اجزای بیولوژی آب های شیرین هستند که به کمک آنها و با بهره گرفتن از ترکیب جمعیتشان و تکیه بر گروه های شاخص، شرایط کیفی آب ها مشخص می شود(Reynoldson,1992). در واقع  ماکروبتنوزها، موجوداتی هستند از جوامع جانوری که در داخل و یا روی بستر زندگی می کنند. بی مهره گان کفزی جانوری یا زئو بنتوزها ساکنان رایج در محیط های آبی بوده و حدأقل بخشی از چرخه زندگی خود را در بستر آبگیرها سپری می کنند. و بر روی الک های با منافذ ۵۰۰ میکرون (نیم میلیمتر) باقی می مانند(Rosenberg,1999). چندین ویژگی موجب شده که این موجودات بیشتر مورد توجه متخصصان پایش بوم سازه های آبی باشند.از جمله این ویژگی ها میتوان به این موارد اشاره نمود:

۱- آنها در همه آبگیرها حضور دارند.۲- تنوع گونه ای بالایی دارند  و با تعداد زیاد گونه ها اغلب دارای محدوده وسیعی از حساسیت نسبت به آلاینده ها بوده که پاسخهای وسیعی به تغییر شرایط مهیا می نمایند.۳- ساکن بستر بوده، جابجایی و حرکت مشخص ندارند.۴- چرخه زندگی طولانی داشته به طوری که امکان بررسی وتعیین حدود و وسعت مکانی و زمانی آشفتگی ها را فراهم می آورند.۵- تغییرات کیفی آب را برخلاف اندازه گیری پارامترهای فیزیکی وشیمیایی،

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

خلاصه فارسی………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………………………………….. 2

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1. بیان مسئله ……………………………………………………………………………………………………….. 5

1-2.ضرورت اهمیت موضوع ………………………………………………………………………………………. 5

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2.اصول تئوری …………………………………………………………………………………………………………. 7

2-1. مروری بر روش‌های استخراج مایع- مایع و میکرواستخراج مایع- مایع ………………………… 10

2-1-1.میکرو استخراج فاز مایع ………………………………………………………………………………… 11

2-1-1-1.میکرو استخراج فاز مایع با تک قطره …………………………………………………………….. 11

2-1-1-2.میکرو استخراج فاز مایع با فیبر تو خالی (HF-LPME)……………………………………… 13

2-1-1-2-1. اصول استخراج و سیستم‌های مختلف در استفاده از HF-LPME………………………. 14

2-1-1-2-2. جنبه‌های عملی و پیکر بندی‌های مختلف HF-LPME…………………………………… 16

2-1-1-2-3.میکرو استخراج فاز مایع از فضای فوقانی با فیبر توخالی………………………………… 19

2-1-1-3.میکرو استخراج فاز مایع با بهره گرفتن از انجماد حلال استخراج کننده………………………… 22

2-1-1-4.میکرو استخراج فاز مایع- مایع پخشی (DLPME) ………………………………………….. 22

2-1-2.استخراج فاز جامد ……………………………………………………………………………………….. 23

2-2. کروماتوگرافی ………………………………………………………………………………………………… 23

2-2-1. دسته‌بندی روش‌های کروماتوگرافی …………………………………………………………………. 24

2-2-1-1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)…………………………………………………….. 24

2-2-1-2. دستگاه‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………… 26

2-2-1-2-1.مخزن فاز متحرک…………………………………………………………………………………. 26

2-2-1-2-2. سیستم‌های پمپ کننده ………………………………………………………………………….. 27

2-2-1-2-3. سیستم‌های تزریق نمونه ………………………………………………………………………… 28

2-2-1-2-4. ستون‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………. 28

2-2-1-2-4-1. انواع پر کننده‌های ستون ……………………………………………………………………. 29

2-2-1-2-5. دمای ستون ……………………………………………………………………………………….. 29

2-2-1-2-6. آشکارسازها ………………………………………………………………………………………. 30

2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتریک …………………………………………………………………………. 31

2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)………………………………………………………….. 32

2-3.بررسی مطالعات دیگران در این زمینه ……………………………………………………………………. 33

2-4.بررسی داروی مورد مطالعه …………………………………………………………………………………. 36

2-4-1.مکانیسم اثر فارماکوکینتیک دارو………………………………………………………………………… 36

2-4-2.مکانیسم اثر………………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-3. موارد مصرف …………………………………………………………………………………………….. 37

2-4-4.منع مصرف و احتیاط ……………………………………………………………………………………. 37

2-4-5.عوارض جانبی …………………………………………………………………………………………….. 38

2-4-6. تداخل‌ها …………………………………………………………………………………………………… 38

2-4-7.دوز مصرفی ……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل………………………………….. 38

2-5-1.از دلایل انتخاب این روش………………………………………………………………………………. 39

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1.مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی……………………………………………………………………….. 41

3-2-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه‌های حقیقی …………………………………………………….. 41

3-2-2.تجهیزات دستگاهی ………………………………………………………………………………………. 41

3-3.روش استخراج ………………………………………………………………………………………………… 42

3-3-1.استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت…………………………………………………… 42

3-3-2. مراحل بهینه‌سازی ……………………………………………………………………………………….. 43

3-3-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………….. 43

3-3-2-2-1.نوع حلال آلی …………………………………………………………………………………….. 44

3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده ……………………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-3.اثرpHفاز گیرنده …………………………………………………………………………………… 44

 

3-3-2-2-4.اثر قدرت یونی فاز دهنده ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آنالیت ………………………………………………………………………. 44

3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج …………………………………………………………………………………. 44

3-3-3. ارزیابی کارایی روش استخراج ……………………………………………………………………….. 45

3-3-3-1. منحنی درجه‌بندی ……………………………………………………………………………………. 45

3-3-3-2.تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF) ……………………………………………………………………. 45

3-3-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD) ………………………………………………………………………… 46

3-3-4.آنالیز نمونه حقیقی ……………………………………………………………………………………….. 46

فصل چهارم: نتایج

4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل …………………………………. 48

4-2. مراحل بهینه‌سازی…………………………………………………………………………………………….. 48

4-2-1. بهینه‌سازی شرایط HPLC………………………………………………………………………………. 48

4-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………………. 49

4-2-2-1.نوع حلال آلی………………………………………………………………………………………….. 49

4-2-2-2.طراحی آزمایش………………………………………………………………………………………… 51

4-2-2-2-1. غربال‌گری …………………………………………………………………………………………. 51

4-2-2-2-2. طراحی بهینه‌سازی ………………………………………………………………………………. 55

4-2-2-2-3. خلاصه نتایج بهینه‌سازی ……………………………………………………………………….. 59

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه‌ای روش استخراج …………………………………………………………….. 59

4-3-1.تهیه منحنی درجه‌بندی …………………………………………………………………………………… 59

4-3-2.فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) …………………………………………………. 60

4-3-3.تعیین حد تشخیص (LOD) …………………………………………………………………………… 61

4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD) ……………………………………………………………………………. 62

4-4.آنالیز نمونه ادرار و پلاسما ………………………………………………………………………………….. 62

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. بحث و نتیجه‌گیری…………………………………………………………………………………………… 66

5-2. پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………… 69

منابع…………………………………………………………………………………………………………………….. 70

خلاصه انگلیسی …………………………………………………………………………………………………….. 82

ضمایم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 82

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                           صفحه

جدول 2-1. کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………… 25

جدول 2-2. کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج گونه‌های مختلف ……………………………… 33

جدول 4-1. سطوح پایین و بالای مربوط به فاکتورهای بررسی شده ……………………………………. 52

جدول 4-2. آزمایشات طراحی شده پلاکت- بورمان جهت شناسایی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر روی نتایج SBME-HPLC برای جداسازی و اندازه‌گیری donepezil…………………….. 52

جدول 4-3. آزمایشات طراحی شده باکس- بهکن جهت بهینه‌سازی فاکتورهای موثر بر SBME…. 55

جدول 4-4. خلاصه نتایج بهینه‌سازی استخراج……………………………………………………………….. 59

جدول 4-5. ارقام شایستگی SBME داروی دونپزیل……………………………………………………….. 62

جدول 5-1. مقایسه روش ارائه شده با سایر روش‌های استخراجی……………………………………….. 66

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                            صفحه

شکل ( الف ). روش‌های استخراج و میکرواستخراج ………………………………………………………….. 3

شکل 2-1. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با بهره گرفتن از میله تفلونی …………………. 11

شکل 2-2. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقیم ازدرون محلول

ب)استخراج از فضای فوقانی ……………………………………………………………………………………………. 13

شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی ………………………………. 14

شکل 2-4. (الف) سیستم HF-LPME بر اساس پیکربندی (ب) پیکربندی میله‌ای U………………… 17

شکل 2-5. طرح شماتیک از سیستم HF-LPME…………………………………………………………….. 18

شکل 2-6. (الف): شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد (ب) سیستم نیمه خودکار …………. 19

شکل 2-7. طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش مستقیم (الف) و (ب) فضای فوقانی .. 21

شکل 2-8. شمایی از یک دستگاه HPLC……………………………………………………………………… 26

شکل 2-9. یک حلقه نمونه‌برداری کروماتوگرافی مایع …………………………………………………….. 28

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC………………………………………………………… 32

شکل 2-11. ساختار شیمیایی دونپزیل …………………………………………………………………………. 36

شکل 4-1.کروماتو گرام تزریق مستقیم 1میلی‌گرم بر لیتر محلول ابی دونپزیل ………………………… 49

شکل 4-2. بررسی نوع حلال پر کننده منافذ فیبر ……………………………………………………………. 50

شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحی پلاکت- بورمان …………………………………….. 54

شکل 4-4. نمودار مربوط به میزان و نحوه تغییر سطوح فاکتورهای موثر انتخاب شده ………………. 56

شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحی تخمینی و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهای موثر در کارایی استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC………………………………………………………………………………………. 57

شکل 4-6. منحنی درجه‌بندی در شرایط بهینه SBME 59

شکل 4-7. منحنی درجه‌بندی در محیط آبی حاصل از تزریق دارو قبل از استخراج ………………………………… 60

شکل 4-8. منحنی درجه‌بندی تزریق مستقیم ………………………………………………………………….. 61

شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو………………………………….. 63

شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو……………………………… 64

 

خلاصه فارسی

داروی دونپزیل یک مهار کننده مرکزی آنزیم استیل کولیناستراز است که در موارد خفیف تا شدید بیماری آلزایمر بهکار می‌رود. همچنین در برخی موارد در درمان بیش فعالی و نیز موارد دمانس مرتبط با پارکینسون مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در این مطالعه برای تغلیظ و اندازه‌گیری مقادیر کم این دارو در نمونه‌های بیولوژیک ادرار و پلاسما، ترکیبی از روش میکرواستخراج سه فازی مایع با نوار حلال و اندازه‌گیری با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)، به کار گرفته شد که بسیار موفقیت‌آمیز بود.

استخراج  دارو از محلول آبی 15 میلی‌لیتری که حاوی دارویدونپزیل در 9/11 pH=بود، به فاز آلی که شامل حلال n-اکتانولی که در منافذ فیبرتوخالی جای داده شده بود، صورت گرفت. سپس به منظور تغلیظ، داروی وارد شده در فاز آلی با یک عمل استخراجی برگشتی، به فاز آبی با 4 /3pH= که در داخل فیبر توخالی قرار داشت، منتقل گردید.

فرایند استخراج به دلیل گرادیان و اختلاف pH بین دو فاز آبی انجام می‌شود. به منظور دستیابی به بیشترین فاکتور تغلیظ، پارامترهای موثر در استخراج نظیر نوع حلال آلی، pH فاز دهنده و گیرنده، قدرت یونی، زمان، سرعت همزدن و دما بررسی و بهینه شدند.

پس از استخراج تحت شرایط بهینه، فاکتور تغلیظ 7/106، و حد تشخیص87/0 /Lبا انحراف معیار نسبی 9/2 درصد حاصل شد.

كلید واژه: دونپزیل – میکرو استخراج سه فازی مایع با نوار حلال

مقدمه

علم شیمی تجزیه روش­های متنوعی را برای آنالیز کمی و کیفی مواد ارائه می­دهد. امروزه روش­های جداسازی، تفکیک گونه­ای موجود در بافت‌های پیچیده را با حد تشخیصی در حد خیلی کم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش­های جداسازی، مرحله­ آماده‌سازی نمونه نیز یکی از مهمترین مراحل در روند تجزیه می­باشد. این مرحله شامل تبدیل بافت یک نمونۀ حقیقی به حالتی است که برای تجزیه با یک تکنیک جداسازی و یا روش­های دیگر مناسب باشد. می­توان گفت مرحله­ آماده‌سازی نمونه برای اهداف زیر طراحی شده است:

1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزایش گزینش‌پذیری روش

2- پیش تغلیظ آنالیت مورد نظر و افزایش غلظت آن به نحوی که بتوان آنرا با دستگاه‌های تجزیه­ای اندازه‌گیری کرد.

3- تبدیل آنالیت­ها به فرمی که برای شناسایی با دستگاه تجزیه­ای مناسب باشد.