هیدروکسی دوپامین (6-OHDA)

عنوان                                                                                                                                   صفحه   

1……………………………………….. چکیده

                              فصل اول ،کلیات تحقیق                                         
مقدمه……………………………………… 3
1-2بیان مسئله ……………………………… 4
1-3.اهمیت وضرورت انجام تحقیق…………………. 5
1-4. اهداف پژوهش……………………………. 7
1-4-1. هدف کلی……………………………… 7
1-4-2.اهداف ویژه …………………………… 7
1-5.فرضیات پژوهش……………………………. 8
1-6. محدودیت های پژوهش………………………. 8
1-6-1. محدودیت­های قابل کنترل…………………. 8
1-6-2. محدودیت های غیر قابل کنترل…………….. 8
1-7. تعریف واژه ها واصطلاحات پژوهش…………….. 8
1-7-1. عصاره هیدروالکلی گل گیاه ازگیل ژاپنی(Eriobotrya japonica)  8
1-7-2. دویدن اختیاری روی چرخ دوار…………….. 8
1-7- 3 .فاکتورهای نروتروفیک (NTFs):…………… 9
1-7-4 .شاخص GDNF……………………………. 9
1-7-5 . مخچه……………………………….. 9

فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق

2-1. مبانی نظری…………………………….. 11
2-2.معرفی چند ناحیه از مغز که در تولید دوپامین وGDNF،موثر می باشند………………………………………….. 12
ز

2-2-1.گانگلیا بازال…………………………. 12
2-2-2.  جسم سیاه در مغز میانی………………… 13
2-3.نرونهای دوپامینژیک –دوپامین………………. 14
2-4. مخچه وپارکینسون………………………… 15
2-5.خانواده نروتروفینهاو GDNF……………….. 16
2-5-1.فاکتورهای نروتروفیک……………………   16
2-5-2.عوامل نروتروفیک در مغز میانی نرون های دوپامینرژیک  17
2-5-3 .سلول گلیال وفاکتورهای نروتروفیک………… 17
2-5-4.فاکتور نروتروفیک GDNF مشتق از سلولهای گلیال 19
2-5-5.ساختار GDNF………………………….. 21
2-6.نقش استرس اکسایشی در پارکینسون……………. 22
2-7.مخچه…………………………………… 25
2-7-1.آناتومی وعملکرد بخشهای مختلف مخچه……….. 25
2-7-1-1.لوب های مخچه………………………… 26
2-7-1-2. بخشهای  طولی مخچه…………………… 26
2-7-1-3. ساقه مخچه………………………….. 26
2-7-1-4. قشر مخچه( سطح ماده خاکستری مخچه)……… 26
2-7-1-5. انواع سلول  و الیاف آوران از قشر مخچه…. 27
2-7-1-5.راه های ورودی اصلی مخچه………………. 28
2-7-1-6.راه های خروجی (وابران)مخچه……………. 28
2-7-2.فیزیولوژی مخچه………………………… 29
2-7-3.عملکرد مخچه در کنترل کلی حرکات………….. 32
2-7-4. ارتباط مخچه وپارکینسون………………… 33
2-7-4-1.اتصالات های تشریحی بین عقده های قاعده ای ومخچه   34
2-7-5.پارکینسون وتغیرات ساختاری در مخچه ………. 35
ح

2-7-5-1.مخچه وعلائم غیر حرکتی در بیماری پارکینسون.. 36
2-8.ورزش وبیماری پارکینسون…………………… 36
2-8-1.ورزش اختیاری چرخ دوار و پارکینسون……….. 38
2-8-2.ورزش اجباری…………………………… 38
2-7.مدل حیوانی پارکینسون مدل تجربی با بهره گرفتن از هیدروکسی دوپامین6-OHDA)…………………………………….. 39
2-9. مکملهای گیاهی………………………….. 42
2-10.تحقیقات انجام شده قبلی (ورزش پارکینسون ،GDNF) 48
2-10-1.تحقیقات داخلی (ایرانی)………………… 48
2-10-2. تحقیقات خارجی……………………….. 49

فصل سوم ،روش اجرای تحقیق

3-1. مقدمه…………………………………. 53
3-2. طرح پژوهش……………………………… 53
3-3. آزمودنی­ها و دسته بندی آن­ها………………. 53
3-4. محیط پژوهش…………………………….. 54
3-5. تغذیه آزمودنی­ها………………………… 55

3-6. وسایل­ و  ابزار  ……………………….. 55
3-7.  متغیرهای تحقیق  ………………………. 56
3-7-1. متغیرهای مستقل……………………….. 56
3-7-2. متغیر­ وابسته : سطح GDNF مخچه…………… 56
3-7-3. عوامل مداخله گر قابل کنترل…………….. 56
3-7-4. عوامل مداخله­گر غیر قابل کنترل………….. 56
3-8 . دوره و زمانبندی تمرینی…………………. 56
3-9. روش و نحوه عصاره­گیری……………………. 57
3-10. نحوه تزریق عصاره………………………. 57
ط

3-11-1. دستگاه استریوتاکسی  …………………. 58
3-11-2. آماده کردن حیوان برای جراحی…………… 59
3-12. روش کانول گذاری و تزریق 6-OHDA ………… 61
3-13. تست چرخشی…………………………….. 62
3-14. بافت برداری…………………………… 64
3-15. هموژنایز، تهیه عصاره بافتی و اندازه گیری متغیرهای وابسته    64
3-17. تجزیه و تحلیل آماری داده ­ها……………… 64

فصل چهارم ،تجزیه و تحلیل داده ها

4-1. مقدمه…………………………………. 66
4-2. توصیف داده ­ها  …………………………. 66
4-3. تجزیه و تحلیل استنباطی داده ­ها……………. 69
4-3-1. فرضیه اول …………………………… 69
4-3-2. فرضیه دوم …………………………… 70
4-3-3. فرضیه سوم …………………………… 71
4-3-4. فرضیه چهارم………………………….. 72

فصل پنجم،نتیجه گیری و پیشنهادات

5-1. مقدمه ………………………………… 74
5-2. خلاصه تحقیق ……………………………. 74
5-3. یافته‌ها بطور كلی و به تفكیک مراحل تحقیق       75
5-4. بحث و بررسی و نتیجه ­گیری یافته های پژوهش…… 75
5-5. نتیجه گیری پژوهش……………………….. 79
5-6. پیشنهادات تحقیق ……………………….. 80
منابع و مآخذ………………………………… 81
فهرست منابع فارسی……………………………. 81
ی

فهرست منابع انگلیسی………………………….. 83
چکیده انگلیسی………………………………. 93

فهرست شکلها

شکل 2-1 موقعیت  عقده های قاعده ای در نیمکره های مغز  12
شکل 2-2. ارتباط هسته قاعده ای با قسمتهای دیگر مغز    13
شکل2-3. بخشهای مغز میانی ،موقعیت جسم سیاه   13
2-4.ترسم شماتیک از روابط آستروسیت با عناصر دیگر از سیستم عصبی مرکزی    18
شکل2-5. لیگاندهای خانواده      21
شکل2-6 موقعیت مخچه در مغز 25
شکل2-7. بخشهای مختلف قشر مخچه  27
شکل2-8..راه های انتقال پیام های عصبی از مخچه 34
شکل3-1. چرخ دوار      56
شکل3-2 دستگاه استریوتاکسی 59
شکل 3-3.   فیکس کردن سر موش صحرایی     60
شکل 3-4.   نمای پشتی- جانبی از جمجمه موش    61
شکل3-5.  تزریق با سرنگ همیلتون 63
شکل3-6. تست چرخشی 64
فهرست جداول

جداول 3-1. گروه­های اصلی و ویژگی­ آنها………….. 54
جداول3-2. اطلاعات استریوتاکسی برای موشها با جنسیت، نژاد و وزن متفاوت………………………………………….. 61
جدول4-1. مجموع و میانگین تمرین انجام شده توسط گروه­های تمرینی 68

                                              فهرست نمودار

نمودار4-1. وزن گروه­ها در طول دوره پژوهش 66
نمودار 4-2. مسافت روزانه طی شده توسط گروه های تمرینی 68
نمودار 4-3. تغییرات GDNF مخچه در گروه های پایه، کنترل و تمرین    69
نمودار4-4. تغییرات GDNF مخچه در گروه های پایه، کنترل و عصاره 70
نمودار 4-5.تغییرات GDNF مخچه در گروه های پایه، کنترل و ترکیب تمرین و عصاره  71
نمودار 4-7. تغییرات سطح GDNF همه گروه های تحقیق 72

چکیده :

مقدمه و هدف: پارکینسون یک اختلال عصبی تخریب کننده ی مزمن وشایع است که سبب  اختلال در مراکز کنترل بدن می شود .این بیماری بر سلولهای دوپامین ساز جسم سیاه (SN[1]   ) واقع درهسته قاعده ای ، اثر می گذارد . هدف از این پژوهش بررسی، اثر حفاظتی تمرین اختیاری روی چرخ دوار همراه با مصرف عصاره گل گیاه ازگیل ژاپنی برسطح  GDNF[2]مخچه موش های پارکینسونی القائی توسط 6 هیدروکسی دوپامین (6-OHDA) بود.

مواد و روش­ها : 50 سر موش صحرائی نر بالغ نژاد ویستار (دوازده هفته­ای)به طور تصادفی به شش گروه: گروه پایه­، گروه كنترل پارکینسونی،گروه مصرف آنتی اکسیدان وگروه تمرین (­كه به نوبه خود به زیر گروه­های مربوطه تقسیم شدند: 1- گروه پارکینسون و تمرین؛ 2- گروه پارکینسون و تمرین و عصاره؛ و 3- گروه پارکینسون و عصاره). گروه­های تمرینی به مدت دوازده هفته روی چرخ دوار تمرین کردند و گروه­هایی که عصاره مصرف کردند، هر هفته سه بار عصاره را به صورت صفاقی و به میزان200 میلی گرم به ازای هر کیلو گرم وزن بدن دریافت کردند. مخچه همه گروه­ها به جز گروه پایه و تمرین سالم با تزریق محلول 6-هیدروکسی دوپامین به صورت استریوتاکسی به داخل بطن مغز تخریب شد. سطح GDNFمخچه ، با روش الایزا اندازه گیری گردید. داده ها به روش One way ANOVA و آزمون تعقیبی TUKEYتجزیه و تحلیل شد.

نتایج: بررسی سطح GDNF مخچه در گروه­های تمرین، و مصرف عصاره نشان داد ورزشی اختیاری و مصرف عصاره گل گیاه ازگیل ژاپنی تأثیر پیش درمان معنی­داری بر حفاظت عصبی  سلول های DA مخچه پس از ایجاد مدل پارکینسونی دارد اما نتیجه تحقیق در گروه تمرین با مصرف عصاره نسبت به گروه پایه وکنترل پارکینسونی نشان دادکه ترکیب این دو مداخله با هم تأثیر پیشگیری بر کاهش سطح GDNF مخچه در برابر آثار سمی 6 هیدروکسی دوپامین نشان نداده است.

کلیدواژگان: عصاره گل گیاه ازگیل ژاپنی، تمرین اختیاری، 6-هیدروکسی دوپامین، GDNFومخچه

1  مقدمه

بیماری پارکینسون (PD[1])  برای اولین بار توسط جیمز پارکینسون در سال 1817 شرح داده شد.( 105) پارکینسون یک اختلال عصبی تخریب کننده ی مزمن وشایع است که حدودا”01/0در صد از افراد بالای 60 سال را گرفتار می کند (5). علائم اولیه پارکینسون عبارتند از: اختلال در عملکرد خودکار، اختلالات عصبی، خواب وخستگی وشکایت حسی می باشد  (25) . علائم دیگر در طول بیماری پارکینسون اختلالاتی نظیر سفتی عضلانی، کندی غیرطبیعی حرکات، لرزش و ناپایداری وضعیتی می باشد . (7). درمان با لوودوپا، موثرترین روش برای مدیریت علائم حرکتی وافزایش خطر ابتلابه نوسانات حرکتی ووقوع حرکات غیر ارادی می باشد(79)بیماری پارکینسون بر اثر از بین رفتن سلول های ترشح کننده ماده ای به نام دوپامین رخ می دهد(71)این بیماری زمانی آغاز می شود که حدود 80/0سلول عصبی دوپامینرژیک از بین برود (13).ویژگی های پاتولوژیک اولیه PD انحطاط نرونی و مرگ نرونهای دوپامینرژیک (DA[2]) منجر به کاهش سطح دوپامین درجسم مخطط شده(46) و علاوه بر از دست دادن نرون های دوپامینرژیک، حضور اجزای داخل سیتوپلاسمی به نام  جسم لوی ،مشخص شده است(90). بیولوژی پیچیده بیماری پاركینسون و مكانیسم ناشناخته مرگ نرونهای دوپامین ساز در طی این بیماری، بیانگر آنست كه شاهراه های درون سلولی متعدد و عناصر اساسی بیشماری در زوال این نرونها نقش ایفا می کند.نرون ها به طور مداوم در معرض سموم داخلی و خارجی موجود در مغز هستند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) و گونه های نیتروژن واکنشی (RNS) نشان دهنده عوامل واسطه رایج ناشی از یک گروه متنوع از نروتوکسین که شروع کننده انحطاط عصبی هستند می باشد.به طور بالقوه رادیکال آزاد مخرب است وبه طور مداوم به عنوان بخشی از سوخت وساز طبیعی درنرون DA تشکیل می شود . سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی ارائه شده توسط آنتی اکسیدان آنزیمها ،سنتز آنتی اکسیدان ها در رژیم غذایی، می توانند این رادیکالها را فرو بنشانند(82).چنانچه رادیکال های آزاد بیش از حد تولید شود یا آنتی اکسیدان های آندروژنیک کاهش یابند، آسیب نرونی، ایجاد خواهد شد. بنابراین تعادل مناسب بین رادیکالهای آزاد و آنتی اکسیدان ها برای بقا نرون ها ضروری است(98). مغز دارای سیستمهای دفاعی آنتی اکسیدانی است که به عنوان سد دفاعی در برابر رادیکالهای آزاد عمل می کند ، اما با افزایش سن و بروز کهنسالی این سیستمهای دفاعی، تضعیف می گردند. از آنزیمهای موجود در این سیستمها می توان به آنزیمهای سوپراکسید دسموتاز(SOD) و کاتالازCAT) ) اشاره کرد (9).  فاکتورهای نرتروفیک گروهی مهم از پروتئین های ترشحی نهان وخارج سلولی است که بقا و مرگ سلولهای عصبی را در زمان تشکیل سیناپس با بافت هدف ویا با دیگر سلولهای عصبی تنظیم می کنند . فاکتورهای نروتروفیک باعث دوام سلولهای عصبی دوپامینژیکی می شوند که در جسم سیاه ماده مغز میانی قرار گرفته اند(68) در سال1993,GDNF (عوامل نروتروفیک مشتق از سلول های گلیال)  به عنوان یک فاکتور نروترفیک رشد وبقا، مشخص شده است. نشان داده شده به عنوان یک عامل تغذیه ای قوی برای نرونهای حرکتی ستون فقرات ونرونهای نورآدرژنیک مرکزی است .GDNF،از نرونهای سروتونرژیک ،دوپامینرژیک وسلولهای گلیال در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند (113)وموجب رشد اکسون  DAنرون های مغز میانی می شود.همچنین از نرونهای DA محکوم به مرگ محافظت و به بازسازی مسیر SN_ST کمک می کند(44  ).واثر تغذیه ای در انواع مختلف از نرون ها، از جمله سلول های پورکنژ مخچه دارند و ازانحطاط نرون های نورآدرنرژیک مخچه به دنبال ضایعات اعصاب جلوگیری می کند. داده ها نشان می دهد که GDNF ممکن است به طور عمده در سلول های پورکنژ مخچه تولید و متمرکزشود (65).

1-2.بیان مسئله

فاکتورهای نوروتروفیک (NTFs) پروتئین های ترشحی ای هستند که به گیرنده های هدفشان متصل می شوند و از کاهش سلول های عصبی جلوگیری می کنند. فاکتورهای نروتروفیک باعث دوام سلولهای عصبی دوپامینژیکی می شوند که در جسم سیاه ماده مغز میانی قرار گرفته اند(68؛93). GDNF در سال 1991 کشف شد،  و اولین عضو از خانواده GDNF لیگاندهای (GFL) است. GDNFدر سال 1993به عنوان یک فاکتور نروترفیک رشد وبقا، مشخص شده است. نشان داده شده به عنوان یک عامل تغذیه ای قوی برای نرونهای حرکتی ستون فقرات ونرونهای نورآدرژنیک مرکزی است .GDNF، نرونهای سروتونرژیک،دوپامینژیک وسلولهای گلیال را در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند(113). GDNF فاکتور نروتروفیک مشتق از سلول گلیال، موجب رشد اکسون  DAنرون های مغز میانی می شود.همچنین از نرونهای DAمحکوم به مرگ محافظت و به بازسازی مسیر SN_ST کمک می کند. شواهد مستقیم نشان می دهد GDNF در نرونهای واسطه DA روییده شده وجود دارد(44) . GDNF،از چندین جمعیت نرون ،در سیستم عصبی مرکزی، از جمله نرونهای حرکتی دوپامین مغز میانی،حمایت می کند . موجب دوام نرون های؛ حرکتی ، حسی و عصب سمپاتیک وپاراسمپاتیک می شود . همچنین عملکرد مهمی درخارج از سیستم عصبی دارد . برای تکثیر سلولهای عصبی روده ای وتحریک رشد کلیه ،برای سلولهای اولیه جنسی مرد  تمایز وتجدید تشکیل اسپرماتوزوئید مهم می باشد(93). ذخیره مداوم GDNFبرای بقای سلولهای عصبی فعال شده یا کاتکولامین های بالغ ضروری می باشد. گیرنده نروتروفیک GDNF توسط CK2 در فعالیت حیاتی ،عبور سیگنال ،سنتز پروتئین ،چسبندگی سلول به سلول ورونویسی ژن که همه موجب  بقائ بافت عصبی می شود به عنوان  واسطه نقش دارد. GDNFبه همراه (گیرنده آلفا/گیرنده کیناز)GFRα1/Retدر حفاظت از سیستم عصبی ونروتوژنیک نقش دارد ومسیر Mapk/Erk (چرخه گلوتامات- گلوتامین که موجب جذب گلوتامات می شود)را تحریک می کند که مانع از مرگ سلولی ناشی از NMDAمی شودGDNF.  در تعامل با گیرنده هایGFRα1/Ret   در سطح سلول، موجب بقای میکروگلیال شده وفعالیت فاگوسیتوز را بهبود می بخشد .فعال سازی میکروگلیال موجب تولید GDNFمی شود .که این امر موجب بقای DAمی شودوفعالیت GPX-1را افزایش می دهد وآن را فعال می کند که این امر خواص حفاظتی GDNFرا با مهار استرس اکسیداتیو تقویت می کند وفاکتور رشد برای کمک به یادگیری وتقویت حافظه گزارش شده است (27).   GDNF دارای خواص احیا کننده برای سلول های مغز است و به عنوان پتانسیل درمان برای بیماری پارکینسون نشان داده شده است. (44) . پیری با کاهش در عملکرد پاسخ های گیرنده بتا آدرنرژیک در مخچه در ارتباط است. گزارش شده سلول فاکتور نروتروفیک مشتق از گلیال (GDNF)،ازانحطاط نرون های نروآدرنرژیک به دنبال ضایعات اعصاب جلوگیری می کند . فعالیت بدنی  موجب کاهش مقدار قابل توجهی اکسیژن در کل بدن  و به خصوص در ماهیچه های اسکلتی می شود.بخش کوچکی از اکسیژن(2-5٪)به اکسیداتیو متوسط تبدیل شده و موجب تغییرات بیوشیمیایی و آسیب بافت می شود.کاهش فعالیت سیستم آنتی اکسیدان می تواند باعث افزایش اکسیداتیو در طی ورزش شود .تمرین بدنی  باعث افزایش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدان ماهیچه ای و کبدی و تسهیل مقدار حذف ،گونه های اکسیژن غیر فعال و کاهش سطح استرس اکسایشی می شود (65). در میان الگوهای ورزشی مختلف، فعالیت اختیاری روی چرخ­دوار، دوی اجباری تردمیل و حرکات مقاومتی عضلانی ، رایج ترین مدل­های ورزشی اتخاذ شده هستند.این ورزش­ها، جدا از مزایای بدنی خود، عملکرد شناختی را بهبود