چکیده

 

 

بررسی میزان ترکیبات فنلی و پتانسیل آنتی اکسیدانی گیاه برگ بو (Laurus nobilis L.)  طی مراحل مختلف رشد

 

به کوشش

لیلا باجولی

 

در پژوهش حاضر پتانسیل آنتی اکسیدانی، میزان ترکیبات فنلی و ترکیبات اسانس برگ قسمتهای مختلف شاخه گیاه برگ بو (Laurus nobilis L.) بررسی گردید. همچنین اثرات آللوپاتیک عصاره آبی برگهای شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل، کاروتنوئید و فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برگ گیاهچه های گندم و شاهی مورد مطالعه قرار گرفت. پتانسیل آنتی اکسیدانی با بهره گرفتن از روش DPPH(1,1- diphenyl 2-picryl-hydrazyl)، میزان ترکیبات فنلی کل با بهره گرفتن از روش Folin-Ciocalteu و ترکیبات اسانس برگها با روش GC/MS ارزیابی گردید. پتانسیل آنتی اکسیدانی برگها بین 856/1 ± 67/40 تا 333/0 ± 67/59 میکرومول ترولکس بر گرم وزن خشک متغیر بود. بیشترین پتانسیل آنتی اکسیدانی در برگهای شاخه غنچه دار برگ بو مشاهده شد. میزان ترکیبات فنلی کل برگها بین 045/0 ± 56/5 تا 139/0 ± 22/12 میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک اندازه گیری شد. بیشترین میزان ترکیبات فنلی کل مربوط به برگهای شاخه بدون میوه و غنچه برگ بو مشاهده شد. اسانس گیری با دستگاه کلونجر نشان داد که برگهای شاخه غنچه دار برگ بو با 53/1% بیشترین بازده را داشته است. در اسانس برگهای قسمتهای مختلف شاخه 3 ترکیب 1,8-Cineole، a-Terpinyl acetate و Sabinene بیشترین درصد را دارا بوده اند. در بررسی اثرات آللوپاتیک عصاره ی آبی برگهای شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر گیاهچه های گندم و شاهی، میزان کلروفیل در اکثر موارد تغییر معنی داری در سطح 05/0 = a نسبت به گیاهچه- های شاهد نداشته است. همچنین میزان کاروتنوئید نیز در اکثر غلظتهای عصاره مشابه گیاهچه-های شاهد بوده است. در رابطه با فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز، عصاره باعث افزایش فعالیت آنزیم در هر دو گیاهچه گردیده است. نتایج نشان دادند که فعالیت آنتی اکسیدانی و میزان ترکیبات فنلی برگهای شاخه های غنچه دار، میوه دار و بدون غنچه و میوه گیاه برگ بو با یکدیگر متفاوت میباشد. همچنین به علت بالا بودن میزان ترکیب 1,8-Cineole در ترکیبات اسانس و اهمیت کاربردی آن، می توان از اسانس برگ بو در سطح صنعتی استفاده نمود.

 

کلمات کلیدی: برگ بو، پتانسیل آنتی اکسیدانی، ترکیبات فنلی، اسانس، اثرات آللوپاتیک

 

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                   صفحه

 فصل اول: مقدمه

1-1-نقش دفاعی متابولیت های ثانویه در شرایط تنش… 2

1-2-رادیکال های آزاد و اثرات سوء آن بر گیاه 3

1-3-مکانیسم های دفاعی گیاهان در برابر گونه های فعال اکسیژن (ROS)ها 5

1-4-اهمیت آنتی اکسیدان های گیاهی. 6

1-5-ویژگی های آنتی اکسیدانی تركیبات فنلی. 8

1-6-مبحث اسانس… 9

1-6-1-روغن های اسانسی.. 9

1-6-2-مصارف و کاربرد روغن های اسانسی.. 9

1-6-3-روش های استخراج روغن های اسانسی.. 10

1-6-4-روش های جداسازی ترکیبات روغن های اسانسی.. 11

1-6-4-1-روش کروماتوگرافی گازی(GC) 11

1-6-5-بررسی تکنیک کروماتوگرافی گازی-طیف سنج جرمی (GC/MS) 13

1-7-مبحث آللوپاتی. 13

1-8-خصوصیات کلی تیره برگ بو 16

1-9-خصوصیات گیاه شناسی گیاه برگ بو 16

عنوان                                                                                                             صفحه

 

1-10-خصوصیات اکولوژیکی گیاه برگ بو 17

1-11-خواص درمانی گیاه برگ بو 18

1-12-سایرکاربردهای گیاه برگ بو 19

 

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین

2-1-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازگیری فعالیت آنتی اکسیدانی گیاهان. 21

2-2-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی گیاهان. 23

2-3-پژوهش های انجام شده در زمینه ی شناسایی ترکیبات موجود در اسانس گیاهان. 24

2-4-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازگیری فعالیت آللوپاتی گیاهان. 26

اهداف پژوهش… 29

 

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-جمع آوری و آماده سازی برگهای گیاه برگ بو 31

3-2-عصاره گیری. 33

3-2-1-تهیه عصاره متانولی.. 33

3-2-2-تهیه عصاره آبی.. 33

3-3-تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی با بهره گرفتن از روش DPPH.. 33

عنوان                                                                                                                صفحه

 

3-3-1-مواد و محلول های مورد نیاز 34

3-3-2-روش آزمایش…. 34

3-3-3-تهیه محلول استاندارد. 35

3-4-اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu. 36

 

3-4-1-مواد و محلول های مورد نیاز 36

3-4-2-روش آزمایش…. 37

3-4-3-تهیه محلول استاندارد. 38

3-5-بررسی ترکیبات اسانس برگ گیاه برگ بو 39

3-5-1-اسانس گیری.. 39

3-5-2-آزمایش های مربوط به تعیین ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو. 39

3-5-2-1-معرفی دستگاه كروماتوگراف گازی متصل به طیف سنج جرمی  (GC/MS) 39

3-6-بررسی پتانسیل آللوپاتی عصاره آبی گیاه برگ بو 40

3-6-1-اثر عصاره آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید برگ گیاهچه های گندم و شاهی  40

3-6-1-1-مواد و محلول های مورد نیاز 40

عنوان                                                                                                                صفحه

 

3-6-1-2-آماده سازی گیاهان. 41

3-6-1-3-روش آزمایش… 41

3-6-2-اثر عصاره آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز استخراج شده از برگ گیاهچه های گندم و شاهی.. 42

3-6-2-1-مواد و محلول های مورد نیاز 42

3-6-2-2-آماده سازی گیاهان. 43

3-6-2-3-استخراج آنزیم گایاكول پراكسیداز 43

3-6-2-4-تعیین فعالیت آنزیم. 43

تجزیه و تحلیل آماری داده ها 45

 

فصل چهارم: نتایج

4-1-پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو با بهره گرفتن از DPPH.. 47

4-2- میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu. 51

4-3-مقایسه بازده اسانس برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو 54

4-4-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو 55

عنوان                                                                                                             صفحه

 

4-4-1-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو. 55

4-4-2-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ های شاخه میوه دار گیاه برگ بو. 55

4-4-3-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ های شاخه بدون میوه و غنچه گیاه برگ بو 56

4-4-4-مقایسه بین ترکیبات عمده موجود در اسانس برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو 62

4-5-پتانسیل آللوپاتی عصاره آبی گیاه برگ بو 63

4-5-1-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل برگ گیاهچه های گندم و شاهی  63

4-5-2-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کاروتنوئید برگ گیاهچه های گندم و شاهی  64

4-5-3-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز استخراج شده از برگ گیاهچه های گندم و شاهی.. 67

 

فصل پنجم: بحث

5-1-پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو با بهره گرفتن از روش DPPH.. 70

 

عنوان                                                                                                             صفحه

 

5-2-میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu. 71

5-3-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو 71

5-4-بررسی پتانسیل آللوپاتی عصاره آبی گیاه برگ بو 73

5-4-1-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل برگ گیاهچه های گندم و شاهی  73

5-4-2-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کاروتنوئید برگ گیاهچه های گندم و شاهی  73

5-4-3-اثر عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز استخراج شده از برگ گیاهچه های گندم و شاهی.. 74

نتیجه گیری کلی. 75

پیشنهادات پژوهشی آینده 76

فهرست منابع فارسی. 77

فهرست منابع انگلیسی. 78

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

 

جدول3-1- مخلوط واكنش جهت سنجش فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز 44

بر حسب میلی گرم در میلیلیتر و درصد مهار رادیکال های آزاد DPPH توسط عصاره ی برگ های شاخه. 51

جدول 4-2 میزان ترکیبات فنلی کل عصاره ی متانولی برگ های شاخه بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک   54

جدول 4-3- بازده اسانس برگ های قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو 54

جدول 4-4- ترکیبات تشکیل دهنده اسانس برگ گیاه برگ بو 57

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                        صفحه

 

شکل 3-1-شاخه گیاه برگ بو…………………………………………………………………………………………………32

شکل 3-2-قسمت های مختلف شاخه برگ بو، شاخه غنچه دار(الف)، شاخه میوه دار(ب)، شاخه بدون غنچه و میوه(ج)………………………………………………………………………………………………………………32

شکل 4-1- منحنی استاندارد ترولکس بر حسب میکرومول. 49

) عصاره متانولی برگ های شاخه غنچه دار(الف)، برگ های شاخه میوه دار(ب) و برگ های شاخه بدون میوه و غنچه(ج) بر جذب محلول DPPH. 50

شکل 4-3- منحنی استاندارد گالیک اسید برحسب میکروگرم درمیلی لیتر 52

) عصاره متانولی برگ های شاخه غنچه دار(الف)، برگ های شاخه میوه دار(ب) و برگ های شاخه بدون میوه و غنچه(ج) 53

شکل 4-5- کروماتوگرام اسانس برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو. 59

شکل 4-6- کروماتوگرام اسانس برگ های شاخه میوه دار گیاه برگ بو. 60

شکل 4-7- کروماتوگرام اسانس برگ های شاخه بدون غنچه و میوه گیاه برگ بو………………..61

شکل 4-8- مقایسه بین ترکیبات عمده موجود در اسانس برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو 62

عنوان                                                                                                                        صفحه

 

شکل 4-9- اثر غلظت های مختلف عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل برگ گیاه تک لپه گندم (الف) و گیاه دولپه شاهی (ب).. 65

شکل 4-10- اثر غلظت های مختلف عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان کاروتنوئید برگ گیاه تک لپه گندم (الف) و گیاه دولپه شاهی (ب).. 66

شکل 4-11- اثر غلظت های مختلف عصاره آبی برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز از برگ گیاه تک لپه گندم (الف) و گیاه دولپه شاهی (ب).. 68

 

مقدمه

 

بشر در طول قرن ها به گیاهان به عنوان منبعی از کربوهیدرات، پروتئین و چربی وابستگی کامل داشته است. عمدتاً یکسری از واکنش های شیمیایی که واسطه آنزیمی دارند، در گیاه زنده به عنوان متابولیسم شناخته می شوند. این واکنش های شیمیایی با هم هماهنگ شده تا مسیرهای متابولیکی که در آنها سنتز مولکولهایی مثل قندها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب عمده، نوکلئوتیدها و پلیمرهای حاصل از آنها (DNA RNA,) انجام می شود، به دست آیند. این تجمع به عنوان متابولیسم اولیه در نظر گرفته می شود و ترکیبات تولید شده که برای زنده ماندن و سالم ماندن گیاه لازم هستند متابولیت اولیه نامیده می شوند. همچنین در گیاهان، مسیرهای متابولیکی دیگری نیز وجود دارد که محصول این مسیرها برای گیاه کاملاً مشخص نیست که به این ترکیبات متابولیت های ثانویه اطلاق می گردد و به مسیر تولید آنها متابولیسم ثانویه می- گویند.

متابولیت های اولیه در بین تمام گیاهان مشترک هستند ولی نوع و میزان متابولیت های ثانویه از یک گونه گیاهی به گونه ای دیگر ممکن است متفاوت باشد. متابولیت های ثانویه گیاهی براساس نحوه بیوسنتز به ترپن ها، فنولیک ها و ترکیبات ازت دار تقسیم می شوند [Taiz & [Zeiger, 2002.

 

1-1-نقش دفاعی متابولیت های ثانویه در شرایط تنش

با توجه به این كه امروزه نقش دفاعی متابولیت های ثانویه برای همه تقریباً پذیرفته شده است، اما هنوز بررسی سازوكار تأثیر تنش های محیطی بر تولید این مواد تصویر پیچیده و مبهمی پیش روی ما می گذارد.

به طور کلی می توان گفت گیاهان، طیف وسیعی از تنش‌های محیطی را که نهایتاً منجر به بروز

تنش اکسیداتیو در گیاه می‌شود، درک می کنند. مکانیسم مقاومت در برخی از تنش‌ها، به صورت یک ارتباط درونی و نتیجه یک برنامه ریزی هماهنگ و پیچیده است [Blokhina et al., [2003.

تنش های محیطی بر رشد و نمو، ساختار فیزیولوژیک گیاه، سنتز پروتئین ها، فعالیت های آنزیمی و غیرآنزیمی، تنفس سلولی و متابولیسم سلولی تأثیر دارند. قرار گرفتن در معرض تنش، ممکن است باعث افزایش تولید گونه های فعال اکسیژن و ایجاد تنش اکسیداتیو شود[Lewitt, [2009.

تنش اکسیداتیو سبب تغییرات فیزیولوژیک و القای پاسخ های متابولیک خاص با القای سنتز برخی از متابولیت های ثانویه مانند آنتوسیانین ها، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و پرولین برای کنترل و خنثی کردن رادیکال های آزاد می شود. هر کدام از این مواد دارای ساختار و خصوصیات بیوشیمیایی منحصر به فرد است و با مکانیسم های متفاوتی در جاروب کردن رادیکال های اکسیژن شرکت می کنند و در نتیجه باعث افزایش مقاومت سلول در مقابل عوامل تنش زا می- شود[Mittler, 2004].

متابولیت های ثانویه گیاهان از جمله فنل و فلاونوئید کل با پتانسیل قوی برای پاکسازی رادیکالهای آزاد در تمام قسمت های مختلف گیاهان مانند برگ، میوه، دانه، ریشه و پوست وجود دارند.

1-2-رادیکال های آزاد و اثرات سوء آن بر گیاه

دکتر دنهام هارمون اولین کسی بود که رادیکال های آزاد را کشف و به ارتباط بین رادیکال های آزاد و فرایند پیری در انسان اشاره کرد. وی زمانی نظریه ی خود را ارائه کرد که توانست با دادن مواد ضداکسایشی مختلف به برخی