چکیده

نخود مهم­ترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند، غرب آسیا و شمال آفریقا است. بیماری پژمردگی نخود با عامل Fusarium oxysporum f. sp. ciceri یکی از مهم­ترین بیماری­های این گیاه در جهان به­شمار می­رود. این بیماری در تمام مناطق نخودکاری ایران گزارش شده است. بیماری همه ساله در تمام مناطق نخودکاری استان ایلام باعث خسارت فراوانی می­ شود بطوری­که در برخی از مزارع به 50 % تا 70 % هم میرسد. این تحقیق به منظور بررسی و تعیین تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود انجام گرفت. برای این منظور از مناطق نخودکاری استان شامل شش شهرستان از جمله آسمان­آباد، ایوان، بدره، چرداول، دره­شهر، سرابله نمونه­برداری صورت گرفت. پس از جداسازی، خالص­سازی و شناسایی قارچ عامل بیماری و معرفی F. oxysporum f. sp. ciceri به عنوان عامل غالب بیماری، بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­ها با بهره گرفتن از پنج جفت نشانگر ریزماهواره صورت گرفت، نهایتاً در مجموع 17 آلل در بین جمعیت­ها مشاهده شد نتایج تجزیه واریانس مولکولی حاکی از تنوع بالای درون جمعیتی معادل 92 درصد و تنوع پایین بین جمعیت­های مناطق مختلف در حدود 8 درصد داشت. جریان ژنی (Nm) بالا و برابر 589/7 به­دست آمد. بنابراین تمایز ژنتیکی (Gst) به میزان کمی 0618/0 مشاهده گردید. دندروگرام رسم شده بر اساس فاصله ژنتیکی بین جمعیت­های مورد مطالعه در این تحقیق، نشان داد که جمعیت­های آسمان­آباد و سرابله در دو گروه جدا قرار گرفته­اند و نسبت به جمعیت-های دیگر تفاوت ژنتیکی بیشتری دارند. نتایج حاصل از این تحقیق در جهت کمک به متخصصین اصلاح نباتات و بیماری­شناسان گیاهی در جهت اصلاح ارقام نخود می­باشد.

کلیدواژه: نخود، Fusarium oxysporum f. sp. ciceri، تنوع ژنتیکی، ریزماهواره

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست مطالب
عنوان	صفحه
چکیده ..	د
فهرست مطالب ..	ه
فهرست جدول­ها ..	ی
فهرست شکل­ها .	ل
فصل اول
1-1-مقدمه .	2
فصل دوم
2-1- آشنایی با سیمای استان ایلام .	5
2-1-1- آب و هوای استان ایلام .. .	5
2-2- جایگاه تاریخی نخود ..	6
2-3- اهمیت و جایگاه نخود در جهان و ایران ..	6
2-4- گیاه­شناسی نخود ..	7
2-4-1- انواع نخود .. ..	7
2-4-2- ارزش غذایی دانه نخود …	8
2-5- موقعیت زراعی نخود در استان ایلام ..	8
2-6- بیماری­های نخود . .	8
2-6-1- بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود ..	9
2-6-2- جنس فوزاریوم	10
2-6-2-1- طبقه ­بندی فوزاریوم ..	10
2-6-2-2- نامگذاری و طبقه ­بندی .	11
2-6-2-3- مرحله زادآوری جنسی	11
2-6-2-4- مرحله غیرجنسی	11
2-6-3- همه­گیری بیماری	12
2-6-3-1- علائم بیماری ..	12
2-6-3-2- چرخه بیماری .	13
2-6-3-3- شرایط محیطی	14
2-6-3-4- گسترش بیماری .	14
2-7- روش­های کنترل بیماری پوسیدگی ریشه نخود	15
2-7-1- روش زراعی .	15
2-7-2- روش شیمیایی ..	15
2-7-3- مبارزه بیولوژیکی	15
2-7-4- ارقام مقاوم .	15
2-8- تنوع بیماری­زایی و تنوع ژنتیکی .Fusarium ssp	16
2-8-1- بررسی تنوع ژنتیکی F. oxysporum با بهره گرفتن از نشانگرهای ..SSR	17
فصل سوم
3-1- نمونه­برداری	24
3-2- جداسازی قارچ عامل بیماری از بافت­های گیاهی آلوده	32
3-3- محیط کشت­های مورد استفاده	32
3-3-1- محیط کشت­های جداسازی	32
3-3-1-1- محیط کشت سیب­زمینی- دکستروز- آگار	32
3-3-1-2- محیط کشت پپتون- پنتاکلرونیتروبنزن- آگار	33
3-3-2- محیط کشت­های خالص­سازی ..	34
3-3-2-1- محیط کشت آب- آگار .	34
3-3-3- محیط کشت­های شناسایی	34
3-3-3-1- محیط کشت برگ میخک- آگار ..	34
3-3-3-2- محیط کشت مواد غذایی خاص ..	35
3-4- شناسایی قارچ عامل بیماری ..	35
3-5- تهیه کشت خالص و نگهداری جدایه­ها	36
3-5-1- روش تک اسپور کردن	36
3-5-2- روش نوک­هیف .	36
3-5-3- نگهداری کشت خالص قارچ .	37
3-6- محلول­های رنگی مورد استفاده برای رنگ­آمیزی و مشاهده­ قارچ	37
3-6-1- محلول اریتروزین	37
3-6-2- محلول آبی پنبه در آب	37
3-7- بررسی آزمون بیماری­زایی در گلخانه ..	38
3-8- آزمایش­های مولکولی . ..	38
3-8-1- استخراج DNA .	38
3-8-1-1- مراحل استخراج DNA ..	39
3-8-2- بررسی کیفیت استخراج	40
3-9- بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­ با کمک نشانگرهای SSR ..	41
3-10- تجزیه و تحلیل داده ­ها .	43
فصل چهارم
4-1- نتایج جداسازی جدایه­ها .	45
4-1-1- مشخصات قارچ در محیط کشت PDA .	45
4-2- آزمون بیماری­زایی ..	46
4-3- نتایج تجزیه و تحلیل داده ­های مولکولی ..	47
4-3-1- توزیع فراوانی آلل­ها در جمعیت­ها و جایگاه­های ریزماهواره .	47
-3-2- ویژگی آغازگرهای استفاده شده برای جدایه­ها .	48
4-3-3- آزمون مانتل ..	51
4-3-4- گروه­بندی جدایه­های F. oxysporum ..	52
4-3-5- تجزیه به مختصات اصلی در جدایه­های F. oxysporum مورد مطالعه ..	55
4-4- تنوع ژنتیکی جمعیت­ها ..	57
4-4-1- اطلاعات تنوع ژنتیکی پنج جایگاه SSR برای جمعیت­ها .	57
4-4-2- درصد چندشکلی در جمعیت­های مورد مطالعه	58
4-4-3- بررسی فاصله ژنتیکی و شباهت ژنتیکی در جمعیت­ها ..	58
4-4-5- بررسی میزان جریان ژنی در جمعیت­ها	60
4-4-6- تجزیه به مختصات اصلی و رسم بای­پلات بر اساس نشانگر SSR	60
4-4-7- تجزیه واریانس مولکولی .	61
4-5- بحث .	62
4-5-1- نتیجه ­گیری کلی .. .. .	65
4-7- پیشنهادات .. .	66
فهرست منابع ..	67

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول­ها
عنوان و شماره	صفحه
جدول 3-1- مشخصات جدایه­های بدست آمده از مناطق مختلف	25
جدول 3-2- اجزای محیط کشت پپتون-پنتاکلرونیتروبنزن- آگار .	33
جدول 3-3- مواد تشکیل دهنده محیط کشت مواد غذایی خاص .	35
جدول 3-4- ترکیبات بافر استخراج DNA	39
جدول 3-5- مشخصات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده	42
جدول 4-1- توزیع فراوانی آلل­ها در جمعیت­ها ..	48
جدول 4-2- ویژگی­های آغازگرهای استفاده شده .	48
جدول 4-3- شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و میزان چندشکلی (PIC)	49
جدول 4-4- اطلاعات مربوط به آلل­های موجود .	50
جدول 4-5- ضمیمه (شکل4-8) ..	55
جدول 4-6- تخمین تنوع ژنتیکی در جمعیت­ها	57
جدول 4-7- درصد چندشکلی در جایگاه­های ژنی	57
جدول 4-8- اندازه، مشخصات و فاصله ژنتیکی بین زوج جمعیت­ها	59
جدول 4-9- میزان جریان ژنی (Nm) و تمایز ژنتیکی GST در جمعیت­ها	60
جدول4-10- خصوصیات مؤلفه­ های حاصل از تجزیه به مختصات اصلی ..	61
جدول 4-11- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) داده ­ها .	62
فهرست شکل­ها
عنوان و شماره	صفحه
شکل 2-1- چرخه بیماری زردی و پژمردگی نخود	13
شکل 3-1- موقعیت جغرافیایی مناطق نمونه­برداری شده ..	24
شکل 3-2- نمونه های آلوده به بیماری زردی و پژمردگی	25
شکل 3-3- بررسی کیفیت DNA ژنومی	41
شکل 4-1- پرگنه قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri در محیط کشت PDA ..	45
شکل 4-2- تصاویر میکروسکوپی قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri .	46
شکل 4-3- آزمون بیماری­زایی ..	47
شکل 4-4- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR1	50
شکل 4-5- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR2	51
شکل 4-6- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR9	51
شکل 4-7- آزمون مانتل	52
شکل 4-8- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش UPGMA	53
شکل 4-9- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش الحاق مجاور .	54
شکل4-10- نمودار دوبعدی تجزیه به مؤلفه­ اصلی ..	56
شکل 4-11- نمودار سه بعدی تجزیه به مؤلفه­ های اصلی ..	56
شکل 4-12- دندروگرام ارتباط ژنتیکی ایجاد شده بوسیله UPGMA ..	59
شکل 4-13- نمودار دوبعدی پراکنش جمعیت­ها .	60
شکل 4-14- نمودار مربوط به تجزیه واریانس مولکولی جمعیت­ها .	62

مقدمه

نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن، دیپلوئید (2n=2x=16)، یکساله با ژنوم کوچک738mbp) ~) می­باشد [27]. نخود مهم­ترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند ، غرب آسیا و شمال آفریقا است [57]. اصلی­ترین كشورهای تولید­كننده نخود در جهان به ترتیب هند، پاكستان، تركیه، ایران و استرالیا هستند [48].

نخود، منبع بسیار مناسبی برای روی، آهن و پروتئین است. همچنین به لحاظ میزان فیبرهای رژیمی، بسیار غنی بوده و میزان چربی اندكی دارد که از نوع اسید­های چرب غیر­اشباع می­باشد، انواع نخود به طور متوسط دارای 19 درصد پروتئین، 13 درصد چربی و 68 درصد كربوهیدرات می­باشند، همچنین به لحاظ تأمین میزان كلسیم مورد نیاز نیز حائز اهمیت است [96]. سطح زیر كشت نخود در ایران 640 هزار هكتار و تولید سالیانة آن در حدود 400 هزار تن است [85، 59، 29]. طبق آمارهای انتشار یافته از سوی سازمان خوار و بار جهانی میزان تولید جهانی این محصول در سال 2010 میلادی 10 میلیون تن بوده که سهم ایران از آن حدود 233686 تن بوده است [45].

قارچ Fusarium oxysporum یک پاتوژن خاکزاد با دامنه میزبانی وسیع بوده كه باعث پژمردگی آوندی در گیاهان مختلف می­ شود [26]. بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود با عاملF. oxysporum f. sp. ciceri مهم­ترین بیماری خاكزاد این گیاه در جهان خصوصًا در شبه قاره هند، حوزه مدیترانه و كالیفرنیا بشمار می­رود، كاهش عملكرد سالیانه نخود در اثر این بیماری از ١٠ تا ١٥ درصد متغیر است ولی بیماری می ­تواند در شرایط خاص كل محصول را از بین ببرد [68]. این بیماری در ایران نیز از اغلب مناطق نخود­كاری گزارش شده و میزان خسارت آن در برخی نقاط کشور تا ٢٢ درصد هم برآورد شده است [18]. بیماری زردی و پژمردگی نخود یكی از مهم­ترین بیماری­های نخود در استان ایلام می­باشد که در این استان همه ساله در تمام مناطق نخودکاری باعث خسارت فراوانی می­ شود، بطوری­که در برخی از مزارع به 50 %تا 70 % هم می­رسد [21]. از آنجایی­که نخود ارزش غذایی بسیار بالایی دارد و یكی از ارزان­ترین منابع تامین پروتئین گیاهی (بین 12 تا 31 درصد پروتئین) می­باشد و بیماری پژمردگی یکی از تهدید­های جدی برای این محصول محسوب می­ شود، از طرفی مبارزه با این بیماری همانند سایر بیماری­های خاكزاد مشكل است و کنترل این بیماری با بهره گرفتن از مواد شیمیایی مقرون به صرفه نخواهد بود، بنابراین طبق بررسی بیماری­شناسان گیاهی بهترین روش کنترلی این بیماری استفاده از بذر سالم و ارقام مقاوم می­باشد. یکی از راه­های رسیدن به ارقام مقاوم پایدار، شناخت قارچ عامل بیماری و بررسی تنوع ژنتیکی آن در مناطق کشت محصول مورد نظر است تا معرفی ارقام مقاوم با اطمینان بالایی صورت گیرد، تغییرات ژنتیکی در قارچ­های بیمارگر از جنبه تهیه ارقام مقاوم حائز اهمیت است، ردیابی این تغییرات با روش­های سنتی مستلزم صرف هزینه زیاد و از دست رفتن زمان خواهد بود. استفاده از روش­های مولکولی در تعیین تنوع ژنتیکی بین جمیت بیمارگر موجب کسب اطلاعات مربوط به وقوع نوترکیبی ژنتیکی آن­ها می­ شود [66]. یکی از روش­های مولکولی که برای تعیین تنوع ژنتیکی جمعیت­های بیمارگر به کار می­رود نشانگرهای ریزماهواره هستند، نشانگر­های ریزماهواره ابزار قوی به منظور طبقه ­بندی و مطالعه ژنتیک جمعیت­ها را فراهم می­ کنند [42، 35]. این نشانگر­ها جایگاه­های ترکیب­شده از