چکیده:

بررسی فنوتیپی و ژنوتیپی همولیزین­های استافیلوکوکوس­های جداشده از منابع انسانی و گاوی

استافیلوکوکوس­ها میکروارگانیسم­هایی هستند که در شرایط خاصی می­توانند عامل ایجاد کننده بسیاری از عفونت­های انسان و حیوان باشند. برخی از سویه­های استافیلوکوکوس ترکیباتی تولید می­ کنند که با قدرت بیماری­زایی آن­ها در ارتباط است. یکی از مهم­ترین آن­ها همولیزین است. استافیلوکوکوس اورئوس چهار نوع همولیزین آلفا، بتا، گاما و دلتا تولید می­ کند. مطالعات مختلفی در مورد همولیزین­های استافیلوکوکوس اورئوس انجام شده است، اما در ارتباط با سایر جدایه­های دامی و انسانی اطلاعات دقیقی در مورد نقش همولیزین در بیماری زایی در دست نیست. لذا هدف از این مطالعه بررسی انواع همولیزین در گونه­ های مختلف استافیلوکوکوس جدا شده از منابع انسانی و حیوانی بر اساس خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی است. در این مطالعه 9 سویه مرجع از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران تهیه شد و40 جدایه استافیلوکوکوس که 20 مورد منشا گاوی و 20 مورد دیگر منشا انسانی داشتند، جمع آوری شدند. پس از تایید جنس باکتری­ های مورد مطالعه بر اساس تست­های بیوشیمیایی، نوع همولیزین بر اساس ناحیه ایجاد شده توسط هر یک از جدایه­های مختلف روی آگار حاوی خون گوسفند، خرگوش و اسب مشخص گردید و ژن­های کد کننده همولیزین­های مختلف با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که 31جدایه دارای فعالیت همولیتیک بودند. با بررسی ژنوتیپی همولیزین­ها مشخص شد که ژن hla و hld در همه جدایه­ها وجود دارد. ژن hlg در هیچ جدایه­ای یافت نشد و 11 جدایه­ دارای ژن hlb بودند. با بررسی فنوتیپی همولیزین­ها مشخص شد که بیشتر جدایه­های گاوی همولیز دلتا و بیشتر جدایه­های انسانی همولیز آلفا داشتند. نتایج بررسی­ها نشان داد که همولیزین­های جدایه­های مختلف استافیلوکوکوس تفاوت­هایی از نظر فنوتیپی و ژنوتیپی دارند همچنین تظاهر فنوتیپی همولیزین روی محیط کشت تنها با وجود ژن کد کننده آن امکان پذیر است در صورتی که عکس آن صادق نیست و امکان عدم بیان ژن همولیزین وجود دارد

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

فصل اول: مقدمه و هدف

مقدمه و هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………………….1

فصل دوم: کلیات

1 – 2 ریخت شناسی و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………..3

2 – 2 ساختار و ترکیب…………………………………………………………………………………………………………………………………4

3 – 2 ویژگی­های رشد………………………………………………………………………………………………………………………………….4

4 – 2 جداسازی…………………………………………………………………………………………………………………………………………….5

5 – 2 شناسایی و ویژگی­های کلونی…………………………………………………………………………………………………………….6

1 – 5 – 2 تولید رنگدانه……………………………………………………………………………………………………………….6

2 – 5 – 2 همولیز…………………………………………………………………………………………………………………………7

6 – 2 تست­های تشخیص بیماری­زایی جدایه­های استافیلوکوکوس…………………………………………………………….9

1 – 6 – 2 تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………………………….9

2 – 6 – 2 تست DNase…………………………………………………………………………………………………………..11

3 – 6 – 2 تست تایید وجود پروتئین آ……………………………………………………………………………………..11

7 – 2 جایگاه طبیعی………………………………………………………………………………………………………………………………….12

8 – 2 گونه­ های استافیلوکوکوس………………………………………………………………………………………………………………..12

1 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اورئوس…………………………………………………………………………………………..12

2 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس…………………………………………………………………………………..13

3 – 8 – 2 استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس………………………………………………………………………………14

4 – 8 – 2 استافیلوکوکوس همولیتیکوس…………………………………………………………………………………14

5 – 8 – 2 استافیلوکوکوس سیمولنس………………………………………………………………………………………15

6 – 8 – 2 استافیلوکوکوس لوجاننسیس……………………………………………………………………………………15

7 – 8 – 2 استافیلوکوکوس کپیتیس…………………………………………………………………………………………15

8 – 8 – 2 استافیلوکوکوس زایلوسوس………………………………………………………………………………………16

9 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اینترمدیوس…………………………………………………………………………………..16

10 – 8 – 2 استافیلوکوکوس هایکوس………………………………………………………………………………………16

11 – 8 – 2 استافیلوکوکوس سیوری………………………………………………………………………………………..17

12 – 8 – 2 استافیلوکوکوس کروموژنز……………………………………………………………………………………..17

13 – 8 – 2 استافیلوکوکوس لنتوس…………………………………………………………………………………………17

9 – 2 بیماری­زایی…………………………………………………………………………………………………………………………….18

10 – 2 نقش استافیلوکوکوس در بیماری­های انسان………………………………………………………………………18

11 – 2 نقش استافیلوکوکوس در بیماری­های حیوان……………………………………………………………………..18

12 – 2 فاکتورهای حدت در استافیلوکوکوس…………………………………………………………………………………19

13 – 2 فاکتورهای حدت در استافیلوکوکوس­های کوآگولاز منفی…………………………………………………19

14 – 2 پاسخ به درمان………………………………………………………………………………………………………………………………20

15 – 2 آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………….21

1 – 15 – 2 نمونه­ها………………………………………………………………………………………………………………..21

2 – 15 – 2 تهیه گسترش………………………………………………………………………………………………………21

3 – 15 – 2 کشت……………………………………………………………………………………………………………………21

4 – 15 – 2 تست کاتالاز………………………………………………………………………………………………………….22

5 – 15 – 2 تست کوآگولاز……………………………………………………………………………………………………………….22

6 – 15 – 2 تست حساسیت آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………………..22

7 – 15 – 2 تست­های سرمی و تعیین تیپ…………………………………………………………………………….23

فصل سوم: مواد و روش­ها

1 – 3 مواد و وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………….24

2 – 3 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………27

1 – 2 – 3 جمع آوری نمونه­ها………………………………………………………………………………………………….27

2 – 2 – 3 جداسازی استافیلوکوکوس با بهره گرفتن از روش کشت………………………………………………27

فصل چهارم: نتایج

نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..36

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………46

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………50

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51

فهرست جداول

عنوان                                                                                                         صفحه

جدول 1 – 3 چهار جفت پرایمر ژن­های مولد همولیزین در استافیلوکوکوس…………………………………..32

جدول 1 – 4 نتایج تست­های بیوشیمیایی و مولکولی نمونه­های کنترل…………………………………………..37

جدول 2 – 4 نتایج تست­های بیوشیمیایی و مولکولی جدایه­های گاوی……………………………………………38

جدول 3- 4 نتایج تست­های بیوشیمیایی و مولکولی جدایه­های انسانی…………………………………………39

فهرست نمودار­ها

عنوان                                                                                                        صفحه

نمودار 1 – 4 میزان درصد فراوانی انواع همولیز بر اساس ژنوتیپ……………………………………………………..43

نمودار 2 – 4 میزان درصد فراوانی انواع همولیز بر اساس فنوتیپ…………………………………………………….43

نمودار 3 – 4 مقایسه درصد فراوانی همولیزین های انسانی و گاوی بر اساس ژنوتیپ……………………..44

نمودار 4 – 4 مقایسه درصد فراوانی همولیزین های انسانی و گاوی بر اساس فنوتیپ……………………..44

نمودار 5 – 4 میزان درصد فراوانی فعالیت همولیتیک و غیر همولیتیک…………………………………………..45

فهرست تصاویر

عنوان                                                                                                        صفحه

تصویر 1 – 3 همولیز کامل در استافیلوکوکوس………………………………………………………………………………….30

تصویر 1 – 4 کوکسی گرم مثبت خوشه انگوری استافیلوکوکوس در زیر میکروسکوپ……………………40

تصویر 2 – 4 تست اکسیداز منفی استافیلوکوکوس……………………………………………………………………………40

تصویر 3 – 4 تست کاتالاز مثبت در استافیلوکوکوس………………………………………………………………………..40

تصویر 4 – 4 تست کوآگولاز در لوله…………………………………………………………………………………………………40

تصویر 5 – 4 رشد روی مانیتول سالت آگار………………………………………………………………………………………..40

تصویر 6 – 4 همولیز بتا، همولیز دوتایی و بدون همولیز……………………………………………………………………41

تصویر 7 – 4 همولیز دلتا…………………………………………………………………………………………………………………….41

تصویر 8 – 4 همولیز دوتایی و آلفا……………………………………………………………………………………………………41

تصویر 9 – 4 تشدید همولیز در محل برخورد همولیز بتا و دلتا………………………………………………………..42

تصویر 10 – 4 مقایسه همولیز ایجادی روی محیط کشت حاوی خون گوسفند و اسب…………………..42

تصویر 11 – 4 عکس UV از محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز……………………………………………………42

مقدمه و هدف

اعضای جنس استافیلوكوكوس میكروارگانیسم­هایی هستند كه گونه­ های مختلفی را شامل می­شوند. هریک از این گونه­ ها می­توانند عامل ایجاد كننده بسیاری از عفونت­های شناخته شده باشند. استافیلوكوكوس­ها می­توانند از طریق محیط روی پوست، غشاهای مخاطی و دیگر اعضای بدن انسان و حیوان ساكن شوند (گان، 1989). این میكروارگانیسم­ها را می­توان به 2 دسته کواگولاز مثبت و کواگولاز منفی تقسیم كرد. کواگولاز منفی­ها میكروارگانیسم­های فرصت طلبی هستند كه در شرایط خاصی در بدن انسان و حیوان عفونت­های شدیدی را ایجاد می­ کنند و اغلب عامل اولیه بیماری در انسان و دام­ها محسوب می­شوند و بیماری­هایی از قبیل عفونت­های مجاری ادراری، روده­ای، گوش، ورم PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)، استئومیلیت، اندوكاردیت، منن‍‍‍ژیت، ذات الریه، ضایعات سطحی مانند فورونكولوز و بسیاری بیماری­های دیگر را ایجاد می­ کنند (گان، 1989 و ترکیالماز، 2005).

استافیلوکوکوس اورئوس[1]یكی از عوامل مهم عفونت PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است) در گاو بوده و به عنوان پاتوژن مهم انسانی نیز شناخته می­ شود (ایسمون و ادلام، 1983 و آرستراپ، 1995). استافیلوکوکوس اورئوس تركیبات مختلفی را تولید می­كند که با قدرت بیماری­زایی آن در ارتباط هستند، که یكی از مهم­ترین آن­ها همولیزین است. همولیزین استافیلوكوكوس­ها به عنوان یكی از مهمترین عوامل حدت باكتری شناخته شده است كه در تهاجم باكتری و فرار باكتری از دسترسی سیستم دفاعی بدن شركت می­كند (اندرسون، 1976 و ایندولو، 1989).

استافیلوکوکوس اورئوس چهار نوع همولیزین آلفا (α)، بتا (β)، گاما (γ) و دلتا (δ) را تولید می­كند كه بررسی نقش این همولیزین­ها به عنوان عوامل حدت در مطالعات مختلفی نشان داده شده است (ویسمان، 1975 و آربوثنوت، 1981).

توكسین آلفا به دلیل اثرات همولیتیك، درمونكروتیک و نوروتوكسیک به عنوان فاكتور اصلی بیماری­زایی استافیلوكوكوس شناخته می­ شود. توكسین بتا (همولیزین بتا) حاوی اسفنگومیلیناز بوده كه علیه گلبول­های قرمز گوسفند و گاو فعال است، اما برخلاف توكسین آلفا نقش توكسین بتا در قدرت بیماری­زایی این میكروارگانیسم كمتر به اثبات رسیده است (داسیلوا و همکاران، 2005).

با توجه به اینكه مطالعات مختلفی نشان داده است كه همولیزین­های استافیلوکوکوس اورئوس ارتباط خاصی با ایجاد تورم PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل