پایان نامه:جداسازی، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان

فهرست مطالب صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1

فصل اول (مقدمه و هدف) …………………………………………………………………………………………………………………..3

1-1-بیماری سل…………………………………………………………………………………………………………………………………..5

1-2- مایکو باکتریوم ها ………………………………………………………………………………………………………………………..7

1-2-1-نامگذاری…………………………………………………………………………………………………………………………………7

1-2-2- طبقه بندی مایکو باکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….9

1_2_3_ مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ………………………………………………………………………………. 11

1-2-4- خصوصیات رشد مایکوباکتریها ……………………………………………………………………………………………….12

1-2-5- فاکتورهای ویورلانس مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………..13

1-2-6- آنتی ژنهای مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………………………14

1-3- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………..15

1-4- اشکال بیماری سل …………………………………………………………………………………………………………………….17

1-5- عوامل مساعد کننده ……………………………………………………………………………………………………………………17

1-6- عارضه های بیماری…………………………………………………………………………………………………………………….18

1-7- پیدایش بیماری ………………………………………………………………………………………………………………………….18

1-8- روش های تشخیص ……………………………………………………………………………………………………………………..20

1-9- درمان ………………………………………………………………………………………………………………………………………21

1-10- عوارض داروهای ضد سل ……………………………………………………………………………………………………….22

1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23

1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23

1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23

1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26

1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو …………………………………………………………………………………………………27

1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27

1_14_ راه های ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29

1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30

1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30

1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35

1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36

1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39

1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39

1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39

1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39

1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40

1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40

1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42

1 _16_1_تكنیك‌های ژنومی كه اساس آنها PCR نمی‌باشد …………………………………………………………………..42

1_16_1_2_انگشت‌نگاری DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43

1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50

1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP……………………………………………………………………….. 50

1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55

2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56

2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58

2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65

فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80

3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

فهرست جدول ها

عنوان جدول صفحه

جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8

جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه های مختلف کندرشد مایکوباکتریای ……………. 33

جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه های مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی …..…………… 35

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71

جدول 3-2: لیست مواد مصرفی …………………………………………………………………………………………………………… 72

جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79

جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها ………………………………………………………………………………. 81

جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91

جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها ………………………….. 113

فهرست شکل ها

عنوان شکل صفحه

تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010……………………………………………………………………………………….. 6

تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها ……………………………………………………………………………………………. 11

تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………………… 11

تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ………………………………….. 13

تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………… 14

تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………… 16

تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس …………………………………………. 20

تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ……………………………………………………………. 21

تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه……………………………………………………………………. 24

تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس ………………………………………………………………………………… 29

تصویر1-13:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………………………………………. 41

تصویر1-14:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………………………………………. 41

تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………….. 42

تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با بهره گرفتن از روش REA …………………….. 46

تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با بهره گرفتن از روش RFLP …………………… 46

تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV ……………………….. 51

تصویر1-19 : لوکوس DR و یک توالی فاصله انداز را DVR میگویند ………………………………………………… 51

شکل 1-20 : حذف توالی های فاصله انداز، که ممکن است در یک یا چند توالی فاصله انداز باشد …………. 52

تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر ……………………………………………………………………………………. 57

تصویر 3-1: نمونه ای از عقدههای لنفاوی …………………………………………………………………………………………. 71

تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون………………. 75

تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی …………….. 76

تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگآمیزی فلوئوروکروم …………………………………………………………………… 81

تصویر 3-5: لولههای تست نیاسین مثبت و منفی ……………………………………………………………………………….. 82

تصویر 3-6- نمائی از لولههای کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ……………………………………………………….. 83

تصویر3-7: دستگاه نانودراپ ………………………………………………………………………………………………………….. 88

تصویر 3- 8: صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ……………………………………………………………………….. 88

تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر ………………………………………………………………….. 89

تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ………………………. 90

تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی ………………….. 92

تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینهای ………………………. 97

تصویر 3-13: دات بلات PGRS و DR ………………………………………………………………………………………………………………. 102

تصویر4-1- لوله های لونشتاین– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ……………………………….. 106

تصویر4-2- الكتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 ……………………………………. 107

تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه …………………………………………………………………………………… 108

شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP …………………………………………………………………………… 109

تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ……………………………………….. 110

تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS …………………………………………………. 111

تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ………………………………………………………. 112

چکیده:

بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا بهره گرفتن از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.

در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت، تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.

این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماری سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروی مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه های مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها برای ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماری سل درانسان ضروری است.

کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس– تعیین هویت مولکولی – RFLP PGRSDR,

فصل اول

موضوعات: بدون موضوع لینک ثابت

فرم در حال بارگذاری ...

فید نظر برای این مطلب