فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                        صفحه

فصل اول ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1

مقدمه  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………2

فصل دوم  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………5

بررسی منابع …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6

2-1 آنزیم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………7

2-1-1 ضرورت افزودن آنزیم به جیره……………………………………………………………………………………………………………………..8

2-1-2 پلی ساکاریدهای غیر نشاسته­ای …………………………………………………………………………………………………………………..9

2-1-3 اثرات ضد تغذیه­ای پلی­ساکاریدهای غیرنشاسته­ای……………………………………………………………………………………….10

2-1-4 نقش آنزیمها در تغذیه طیور ………………………………………………………………………………………………………………………13

2-1-5 تاثیر مکمل آنزیم بر عملکرد طیور ……………………………………………………………………………………………………………..13

2-2 آنتی بیوتیک ها  …………………………………………………………………………………………………………………………………………..17

2-3 پروبیوتیک ها  …………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

2-3-1 میکروبهای مورد استفاده به عنوان پروبیوتیک  ……………………………………………………………………………………………..22

2-3-2 شیوه های تاثیرگذاری پروبیوتیک ها  …………………………………………………………………………………………………………23

الف- بهبود سلامت دستگاه گوارش از طریق حفظ فلور میکروبی مطلوب  ………………………………………………………………..23

ب- تغییر در متابولیسم میکروبی  ………………………………………………………………………………………………………………………….26

2-3-3- تحقیقات انجام گرفته در مورد استفاده از پروبیوتیک ها  ……………………………………………………………………………..28

2-4 پری بیوتیک ها ……………………………………………………………………………………………………………………………………………30

2-4-1 ویژگی یک پروبیوتیک  …………………………………………………………………………………………………………………………….32

2-4-2 مواد شناخته شده ه عنوان پروبیوتیک  ………………………………………………………………………………………………………..32

2-5 دستگاه گوارش پرندگان  ………………………………………………………………………………………………………………………………40

2-5-1 ساختمان عمومی لوله گوارش  ………………………………………………………………………………………………………………….40

2-5-2 وضع تشریحی روده باریک  ……………………………………………………………………………………………………………………..42

2-6 فراسنجه های خونی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………44

2-6-1 پروتئین­های پلاسما  …………………………………………………………………………………………………………………………………45

2-6-2 اهمیت غلظت پروتئین پلاسما در تعیین چگونگی توزیع مایعات بین خون و بافت …………………………………………..45

2-6-3 مطالعات در مورد پروتئین  های پلاسما ………………………………………………………………………………………………………46

2-6-4 آلبومین پروتئین اصلی موجود در پلاسما ……………………………………………………………………………………………………48

2-6-5 نقش ایمنوگلوبولینهای پلاسما در مکانیسم­های دفاعی بدن  …………………………………………………………………………..49

2-6-6 انتقال وذخیره سازی لیپیدها  ……………………………………………………………………………………………………………………..50

2-6-7 چهار گروه اصلی لیپوپروتئین­های پلاسما 

 …………………………………………………………………………………………………..51

فصل سوم  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………53

مواد و روشها  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….53

3-1 محل وزمان آزمایش  ……………………………………………………………………………………………………………………………………54

3-2 آماده سازی سالن  ………………………………………………………………………………………………………………………………………..54

3-3 جوجه­ریزی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….54

3-4 مشخصات جیره ها  ……………………………………………………………………………………………………………………………………..55

3-5 پرورش جوجه ها  ……………………………………………………………………………………………………………………………………….56

3-6 آزمایشات  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….56

3-6-1  مصرف خوراک ………………………………………………………………………………………………………………………………………56

3-6-2 افزایش وزن هفتگی  ………………………………………………………………………………………………………………………………..57

3-6-3 ضریب تبدیل غذایی  ……………………………………………………………………………………………………………………………….57

3-6-4 وزن نهایی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..58

3-6-5 فراسنجه های خون  …………………………………………………………………………………………………………………………………58

3-6-6 مورفولوژی روده  …………………………………………………………………………………………………………………………………….59

3-7 آنالیز داده های آماری  ………………………………………………………………………………………………………………………………….59

فصل چهارم :نتایج   ……………………………………………………………………………………………………………………………………………60

4-1 اثر جیره های آزمایشی بر عملکرد  ………………………………………………………………………………………………………………..61

4-1-1 ضریب تبدیل غذایی  ……………………………………………………………………………………………………………………………….61

4-1-2 مصرف خوراک  ………………………………………………………………………………………………………………………………………62

4-1-3 میانگین افزایش وزن  ……………………………………………………………………………………………………………………………….63

4-2 اثر تیمارهای آزمایشی بر مورفولوژی روده  …………………………………………………………………………………………………….64

4-3 اثر تیمارهای آزمایشی بر چربی و پروتئین سرم ……………………………………………………………………………………………… 65

فصل پنجم :بحث  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………66

5-1 اثر جیره های آزمایشی بر عملکرد جوجه های گوشتی………………………………………………………………………………………67

5-2 اثر تیمارهای آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک  …………………………………………………………………………………………72

5-3 اثر تیمارهای آزمایشی بر چربی و پروتئین سرم ……………………………………………………………………………………………….76

6- نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..78

7- پیشنهادات  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………79

جداول  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..80

منابع  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

فهرست جداول

1: ترکیب شیمیایی جیره های آزمایشی…………………………………………………………………………………………………………………..81

2: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر ضریب تبدیل غذایی………………………………………………………………………………………….82

3: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی برمصرف خوراک………………………………………………………………………………………………….83

4: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر افزایش وزن  …………………………..   …………………………………………………………………..84

5: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ددنوم) در 42 روزگی…………………………………………………..85

6: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ددنوم) در 49 روزگی…………………………………………………..86

7: اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ژژنوم) در 42 روزگی …………………………………………………87

8 . اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ژژنوم) در 49 روزگی…………………………………………………88

9 . اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ایلئوم) در 42 روزگی  ……………………………………………….89

10 . اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (ایلئوم) در 49 روزگی  ……………………………………………..90

11 . اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (قائده سکوم) در 42 روزگی  …………………………………….91

12 . اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر مورفولوژی روده کوچک (قائده سکوم) در 49 روزگی  …………………………………….92

13. اثر تیمارهای ازمایشی بر مورفولوژی (بدنه سکوم) جوجه های گوشتی در 42 روزگی …………………………………………93
14. اثر تیمارهای ازمایشی بر مورفولوژی (بدنه سکوم) جوجه های گوشتی در49 روزگی …………………………………………..94
15. اثر تیمارهای ازمایشی بر مورفولوژی (راس سکوم) جوجه های گوشتی در 42 روزگی ………………………………………….95
16. اثر تیمارهای ازمایشی بر مورفولوژی (راس سکوم) جوجه های گوشتی در 49 روزگی ………………………………………….96
17. اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر چربی سرم …………………………………………………………………………………………………..97
18. اثر تیمارهای مختلف آزمایشی بر پروتئین سرم ………………………………………………………………………………………………..98

چکیده:

در این تحقیق اثر افزودنیهای خوراکی مختلف بر عملکرد، مورفولوژی روده و متابولیتهای سرم خون جوجه های گوشتی مورد بررسی قرار گرفت.تعداد ۳۶۰ جوجه گوشتی (راس ۳۰۸) به ۵ تیمار در قالب طرح کاملا تصادفی اختصاص داده شد.تیماره به ترتیب با پروبیوتیک چند سویه ای (پروتکسین)، پروبیوتیک دکستران اولیگوساکارید، پروبیوآنزیم و مولتی آنزیم(گریندازیم) مکمل گردیدند. مصرف خوراک وزن بدن وضریب تبدیل غذایی برای دوره های آغازین ، رشد و پایانی محاسبه گردید.در روز ۴۲ به طور تصادفی از هرتکرار ۲ نمونه خونی تهیه و برای انجام آزمایشات سرم خون به آزمایشگاه ارسال شد. همچنین از هر تکرار ۲ پرنده برای نمونه برداری روده انتخاب و کشتار گردید.مکمل سازی جیره با پروتکسین موجب کاهش معنی­دار ضریب تبدیل غذایی در22-42 و 0-42 روزگی شد(0.05≥p). در دوره­ 0-21 روزگی اثر معنی­دار بر ضریب تبدیل غذایی فقط در تیمار دکستران اولیگوساکارید مشاهده گردید(0.01≥p).

مصرف خوراک 22-42روزگی تحت تاثیر تیمارهای پروتکسین ودکستران اولیگوساکارید قرار گرفته و بطور معنی داری کاهش یافت(0.05≥p).در 22-42 و0-42 روزگی دکستران اولیگوساکارید و پروبیوآنزیم باعث افزایش معنی­دار وزن جوجه­های گوشتی گردیدند(0.05≥p).در مورد اثر تیمارها بر مورفولوژی روده دکستران اولیگوساکارید،گریندآنزیم و لینکومایسین ضخامت لایه عضلانی داخلی را در مقایسه با گروه شاهد به طور معنی داری کاهش دادند(0.05≥p).اثر معنی دار

فهرست مطالب

عنوان                       صفحه

فصل اول: کلیات.. 1

1-1-تاریخچه وطبقه بندی: 2

1-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی: 4

1-3- کشت: 4

1-4-آنتی ژنها وعوامل بیماریزایی.. 5

1-4-1-عوامل اتصالی فیمبریه ای: 7

1-4-2-سایرعوامل بیماریزائی: 10

1-5-بیماریها و عوارض…. 11

1-6- روش‏های تشخیص کلاسیک: 13

1-7-اپیدمیولوژی.. 14

1-7-1-جلوگیری از پنومونی.. 14

فصل دوم: پیشینه پژوهش… 16

2-1- مقدمه. 17

2-2- تاریخچه. 18

فصل سوم: روش شناسی.. 21

3-1- مواد و وسایل: 22

3-2- دستگاه ها: 24

3-3- محلول سازی: 25

3-3-1- آماده سازی محیط کشت: 25

3-3-2- محیط شکلات اگار: 26

3-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد: 27

3-4- طراحی و روش اجرا: 27

3-4-1- جمع‏آوری نمونه: 27

3-5- کشت نمونه ها: 27

3-6- تست ‌های بیوشیمیایی: 28

3-7- رنگ آمیزی: 29

3-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ: 29

3-9- استخراج DNA.. 30

3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 30

3-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده: 30

3-11- راه اندازی و انجام PCR: 31

3-12- واکنشPCR.. 32

3-13- الکتروفورز محصول PCR: 35

3-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز: 35

3-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 35

3-14- تفسیر ژل الکتروفورز. 36

3-15- RFLP.. 36

3-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز. 37

3-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ: 37

3-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP: 37

3-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1: 38

3-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1: 38

 

3-17- تعیین توالی و پردازش داده ها: 38

3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده: 39

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 40

4-1- تعداد نمونه‏ها و ایزولاسیون: 41

4-2-تستهای بیوشیمیایی: 42

4-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده: 42

4-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا: 43

4-5- RFLP: 44

4-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL: 45

4-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها: 46

4-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3: 46

4-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5: 47

4-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8: 48

4-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35: 49

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47: 50

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14: 51

4-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران: 52

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 56

5-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی: 57

5-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3: 57

5-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5: 58

5-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8: 58

5-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35: 59

5-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14: 60

5-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47: 60

5-3- بحث: 61

پیشنهادات: 66

منابع. 67

فهرست منابع. 68

Abstract 75

پیوست ها 76

فهرست جداول

جدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای  PCRاز ompP2. 34

جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP2. 34

جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP2. 35

جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه. 41

جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 42

جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI 47

جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI 48

جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI 49

جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI 50

جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI 51

جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI 52

فهرست اشکال

شکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت… 3

شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار. 5

شکل3-1-تست کاتالاز. 29

شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا 30

شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر. 34

شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز. 36

شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی… 43

شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی… 44

شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن  ompP2ایزوله‌های بالینی… 44

شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره  14با پرایمر Forward.. 45

شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره  14با پرایمر Revers. 45

شکل 4-7- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 46

شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3.. 46

شکل 4-9- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 5  با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 47

شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 5.. 47

شکل 4-11- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 48

شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 8.. 48

شکل 4-13- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 49

شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 35.. 49

شکل 4-15- آنالیزو مقایسه نمونه شماره  47با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 50

شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 47.. 50

شکل 4-17- آنالیزو مقایسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 51

شکل 4-18- نواحی حفاظت شده پروتئین شماره 14.. 51

شکل 4-19- مقایسه ساختمانی اسیدآمینه پروتئینP2 ایزوله‌های بالینی با همدیگر. 54

فهرست نمودارها

نمودار 4-1- نتایجRFLP 52

نمودار 4-2- میزان درصد هر یک از الگو ها 53

نمودار 4-3- درصد جهش ها 53

چکیده:

هموفیلوس آنفلوانزا،یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی می‏تواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی ،سپتی سمی،اپی گلوتیت،باکتریمی،عفونت گوش میانی کند. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین ها ی حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به منظور طراحی واکسن بومی علیه ان می‏باشد. پروتئینP2  ، بین 38 الی 40 كیلودالتون وزن داشته و بیش از 50 درصد كل پروتئینهای غشاء خارجی هموفیلوس را شامل می‏گردد و غالبا توسط سویه‏های فاقدكپسول و سویه b هموفیلوس ها بیان می‏شود.

این پروتئین به عنوان یک کاندیدای مناسب واکسن برای سویه‏های بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا مطرح است. در این تحقیق ،اپیدمیولوژی ژن ompP2 با بهره گرفتن از نمونه‏های بالینی که از 30 بیمار جداسازی شده بودند،مورد بررسی قرار گرفت. باکتری ها در محیط شکلات اگار کشت داده شدند و تستهای بیوشیمیایی انها انجام شد. پس از تخلیص DNA،واکنش PCR انجام شد. همه نمونه ها از نظر وجود ژن ompP2) 1173(bp مثبت شدند. پس از تعیین توالی 6 نمونه و مقایسه توالی ژن ompP2 سویه‏های بومی با سویه‏های استاندارد و توالی موجود در بانک ژنی،با نرم افزار MEGA4 ،شباهت ها و تفاوت های ناشی از حذف ،اضافه و یا جابه جایی نوکلئوتیدی را نشان داد. جهت بررسی الگوی پلی مورفیسم ژن مورد نظر ،محصول PCR مورد هضم توسط آنزیم های Alu1 و EcoR1 قرار گرفتند. الگوی برش 21 نمونه (99%-98%) مشابه سویه‏های استاندارد باno:J3359. 1,M93268. 1,M93269. 1,M932701) (accessionبود و 9 نمونه (98%-91%) متفاوت بود. نتایج ما نشان دادکه ژن ompP2 از نظر سازماندهی ژنی،شبیه سویه‏های مختلف هموفیلوس آنفلوانزا ثبت شده در بانک ژنی است و در قسمت برش توسط آنزیم محدودالاثر Alu1دچار پلی مورفیسم شدند. لذا این پروتئین می‏تواند کاندید مناسبی برای واکسن باشد.

واژگان کلیدی: هموفیلوس آنفلوانزا،واکسن،ژن ompP2،PCR.

فهرست مطالب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
فصل اول – مقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1 صرع…………………………………………………………………………………………………………………………………..	1
1-1-1 تاریخچه صرع…………………………………………………………………………………………………………….	1
1-1-2 تعریف صرع………………………………………………………………………………………………………………	2
1-1-3 اپیدمولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………	3
1-1-4 اتیولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………….	3
1-1-4-1 علل قبل از زایمان…………………………………………………………………………………………………	3
1-1-4-2 ضربه های مغزی………………………………………………………………………………………………….	4
1-1-4-3 علل عفونی و بیماریها…………………………………………………………………………………………….	4
1-1-4-4 علل متابولیکی……………………………………………………………………………………………………..	4
1-1-4-5  سکته های مغزی…………………………………………………………………………………………………	5
1-1-4-6  صرع و ژنتیک…………………………………………………………………………………………………….	5
1-1-5 تشخیص بیماری……………………………………………………………………………………………………………	5
1-1-6 درمان صرع………………………………………………………………………………………………………………….	7
1-1-7  فیزیوپاتولوژی صرع……………………………………………………………………………………………………….	9
1-1-8  طبقه بندی صرع……………………………………………………………………………………………………………	12
1-1-8-1 اجزاء تشنج…………………………………………………………………………………………………………	12
1-1-8-2  طبقه بندی بین المللی صرع……………………………………………………………………………………..	12
1-1-8-2-1 تشنج های موضعی……………………………………………………………………………………..	12
1-1-8-2-2 تشنج های عمومی………………………………………………………………………………………	13
1-1-9  صرع لوب گیجگاهی………………………………………………………………………………………………………	16
1-1-10 نقش نئوکورتکس در مکانیسم صرع زایی……………………………………………………………………………..	16
1-1-11 نقش صرع زایی نواحی لیمبیک…………………………………………………………………………………………	18
1-2 مدل های ایجاد صرع تجربی در حیوانات………………………………………………………………………………………..	20
1-2-1 کیندلینگ…………………………………………………………………………………………………………………….	21
1-2-2 کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………………	21
1-2-3 انواع کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………..	22
1-2-3 -1 تزریق درون بطنی مواد تشنج زا………………………………………………………………………………….	22
1-2-3 -2 تزریق سیستمیک مواد تشنج زا…………………………………………………………………………………..	22
1-3  استرس………………………………………………………………………………………………………………………………..	23
1-3-1 مفهوم استرس………………………………………………………………………………………………………………	23
1-3-2 مراحل پاسخ دهی به استرس ……………………………………………………………………………………………	25
1-3-3  پیامد های استرس…………………………………………………………………………………………………………	26
1-3-4 نوروآناتومی و فیزیولوژی استرس ………………………………………………………………………………………	27
1-3-4-1 سیستم سمپاتیک(SAM) ………………………………………………………………………………………..	28
1-3-4-2 سیستم هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال(HPA) ………………………………………………………………	28
1-3-5  تجارب اولیه مطالعات حیوانی نوروبیولوژی استرس…………………………………………………………………	32
1-4 اثرات استرس بر صرع……………………………………………………………………………………………………………….	32
فصل دوم –  روش تحقیق و مواد	34
1-2 نوع حیوان و نحوه تهیه: …………………………………………………………………………………………………………….	35
2-2 شرایط نگهداری موش ها : ………………………………………………………………………………………………………..	35
2-3 مواد و لوازم مورد نیاز : ……………………………………………………………………………………………………………	35
2-3-1 مواد شیمیایی: ………………………………………………………………………………………………………………	35
2-3-2 ابزار و وسایل ……………………………………………………………………………………………………………….	36
2-4 گروه های مورد آزمایش : ………………………………………………………………………………………………………….	36
2-4-1 گروه بندی ماده ها: ………………………………………………………………………………………………………	37
2-4-2 گروه های ماده و گروه بندی نوزادان نر : ………………………………………………………………………………	39
2-5 شاخص های مورد آزمایش: ……………………………………………………………………………………………………..	42
2-6 بررسی مراحل 6 گانه رفتار تشنجی ……………………………………………………………………………………………..	43
فصل سوم –  نتایج تحقیقات	44
3-1 استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..	45
3-2 استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشتج زایی در فرزندان کاهش می دهد. ………………………	47
3-2-1 استرس قبل از بارداری مادران…………………………………………………………………………………………………………….	47
3-2-2 استرس حین بارداری مادران………………………………………………………………………………………………………………	47
3-2-3 استرس در بارداری دوم مادران…………………………………………………………………………………………………………..	50
3-3: ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد……………………………	51
فصل چهارم – بحث و نتیجه گیری	53
4-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..	54
4-2 الف) استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی در فرزندان را پس از رسیدن به بلوغ، کاهش می دهد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..	55
4-3 ب) ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد. …………………….	57
4-4 ج)استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..	58
5-4 نتیجه گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………….	61
پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………	62
منابع فارسی و انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………….	63
چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	72

فهرست شکل ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
1-1 امواج EEGدر حملات تشنجی………………………………………………………………………………………………………………………	6
1-2 تخریب فیبر های رابط نیم کره های مغزی…………………………………………………………………………………………..	8
1-3 تحریک عصب واگ……………………………………………………………………………………………………………………………………..	9
1-4 مقایسه امواج EEGدر حالت طبیعی و تشنجات……………………………………………………………………………………………….	11
1-5 میسر انتشار تشنج در صرع موضعی و عمومی………………………………………………………………………………………………….	14
1-6 مراحل تونیک  و کلونیک……………………………………………………………………………………………………………………………..	14
1-7 تشنج ساده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	15
1-8 طبقه بندی تشنج ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..	16
1-9 محور HPA………………………………………………………………………………………………………………………………………………..	31
2-1 موش ماده و نوزادانش………………………………………………………………………………………………………………………………….	36
2-2 شنای اجباری موش……………………………………………………………………………………………………………………………………..	38
2-3 محدودیت حرکت موش(Restrain) ……………………………………………………………………………………………………………	38
2-4 علامت گذاری موش ها………………………………………………………………………………………………………………………………..	41
2-5 نوزادان نر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	41
2-6 استرس جدایی از مادر نوزادان نر…………………………………………………………………………………………………………………..	40
2-7 بررسی و زمانگیری مراحل تشنج……………………………………………………………………………………………………………………	42
2-8 ثبت دقیق عمق و مراحل تشنج………………………………………………………………………………………………………………………	43
2-9 تزریق درون صفاقی (IP) …………………………………………………………………………………………………………………………….	43

فهرست نمودار ها و منحنی ها

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
1-1 وقایع مربوط به مواجه شدن پس از استرس…………………………………………………………………………………………………….	25
2-1 مراحل استرس هتروژن………………………………………………………………………………………………………………………………..	38
3-1 نتایج استرس جدایی از مادر………………………………………………………………………………………………………………………….	46
3-2 نتایج استرس قبل از بارداری ……………………………………………………………………………………………………………………….	48
3-3 نتایج استرس حین بارداری ………………………………………………………………………………………………………………………….	49
3-4 نتایج استرس قبل از بارداری دوم(بین بارداری ) ……………………………………………………………………………………………..	50
3-5 نتایج استرس در بارداری قبل………………………………………………………………………………………………………………………..	52

 

چکیده:

استرس به عنوان یک عامل تهدید برای CNS است و بقای ارگانیسم جانوری در سازگاری و یا خروج از آن می باشد. حاضر پژوهش انجام گرفته پاسخ بالقوه فرزندان موش به استرس مادر در زمان های مختلف زندگی بوده است. مدل استرس مزمن، استرس هتروژن است که مدلی از استرس طبیعی بوده و نه روز طول کشیده است. استرس قبل از بارداری منجر به کاهش نمو کیندلینگ در فرزندان شده، در حالی که استرس حین بارداری مانع کیندلینگ در نوزادان شده است. استرس بین بارداری و استرس بارداری قبل تغییری در شدت کیندلینگ ایجاد نکرده است. این نتایج نشان داد که بارداری می تواند مانعی برای اثرات مخرب استرس باشد، هر چند،  افزایش سن،  این اثر حفاظتی را خنثی می نماید.

مقدمه :

فهرست مطالب

عنوان                 صفحه

خلاصه فارسی ‌ح
فصل اول کلیات

1-1 ………………. سینوزیت… 3

1-2 ………………. شیوع سینوزیت… 4

1-3 ………………. عوامل مستعد کننده سینوزیت… 4

1-4 ………………. منشأ سینوزیت… 5

1-4-1 ………….. سینوزیت با منشأ آلرژیک… 5

1-4-2 ………….. سینوزیت با منشأ ویروسی.. 6

1-4-3 ………….. سینوزیت با منشأ قارچی.. 6

1-4-4 ………….. سینوزیت با منشأ باکتریایی.. 6

1-5 ………………. انواع سینوزیت… 8

1-5-1 ………….. سینوزیت حاد. 8

1-5-1-1 ……… علائم بالینی سینوزیت حاد. 8

1-5-1-2 ……… تشخیص و درمان سینوزیت حاد. 8

1-5-2 ………….. سینوزیت مزمن.. 9

1-5-2-1 ……… علائم بالینی سینوزیت مزمن.. 9

1-5-2-2 ……… تشخیص و درمان سینوزیت مزمن.. 9

1-6 ………………. عوارض سینوزیت… 9

1-7 ………………. مشخصات باکتری های مورد آزمایش…. 10

1-7-1 ………….. مشخصات کلی استرپتوکوک ها 10

1-7-1-1 ……… استرپتوکوک پیوژن. 11

1-7-1-1-1 ….. بیماری زایی.. 12

1-7-1-1-2 ….. تست های تشخیصی.. 12

1-7-1-1-3 ….. درمان. 13

1-7-1-2 ……… استرپتوکوک پنومونیه. 13

1-7-1-2-1 ….. تست های تشخیصی.. 14

1-7-1-2-2 ….. بیماری زایی.. 15

1-7-1-2-3 ….. درمان. 15

1-7-2 ………….. مشخصات کلی استافیلوکوک ها 16

1-7-2-1 ……… استافیلوکوک اورئوس… 16

1-7-2-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 17

1-7-2-1-2 ….. بیماری زایی.. 18

1-7-2-1-3 ….. درمان. 18

1-7-3 ………….. مشخصات کلی پسودوموناس ها 19

1-7-3-1 ……… پسودوموناس آئروژینوزا 19

1-7-3-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 21

1-7-3-1-2 ….. بیماری زایی.. 21

1-7-3-1-3 ….. درمان. 21

1-8 ………………. تاریخچه درمانی گیاهان دارویی.. 22

1-8-1 ………….. ویژگی های خاص تولید گیاهان دارویی.. 23

1-8-2 ………….. شکل های مصرف گیاهان دارویی.. 23

1-9 ………………. ویژگی های گیاهان دارویی مورد آزمایش…. 23

1-9-1 ………….. گیاه درمنه. 23

1-9-1-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 24

1-9-1-2 ……… خواص درمانی.. 25

1-9-2 ………….. گیاه اسطو خودوس… 25

1-9-2-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 26

1-9-2-2 ……… خواص درمانی.. 26

1-9-3 ………….. گیاه دارچین.. 26

1-9-3-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 28

1-9-3-2 ……… خواص درمانی.. 29

1-9-4 ………….. گیاه مورد یا مورت… 29

1-9-4-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 31

1-9-4-2 ……… خواص درمانی.. 32

1-10 ……………. اسانس های گیاهی.. 32

1-11 ……………. نانواسانس های گیاهی.. 33

1-11-1 ………… کیتوزان. 33

1-12 ……………. بررسی اثرات ضد میکروبی.. 35

1-13 ……………. تعیین MIC به روش میکرودایلوشن (ریز رقت) 35

1-13-1 ………… متغیر های مؤثر در انجام آزمون MIC.. 36

1-13-2 ………… تعیین MBC.. 36

1-13-3 ………… دیسک دیفیوژن. 36

1-13-3-1 ……. دینامیک تشکیل هاله. 37

1-13-3-2 ……. دیسک های آنتی بیوتیک… 37

1-13-4 ………… انتشار در آگار (چاهک) 37

1-14 ……………. روش های تهیه سوسپانسیون. 38

 

1-15 ……………. بیان مسئله. 38

1-16 ……………. ضرورت اهمیت موضوع. 39

1-17 ……………. اهداف تحقیق.. 40

1-17-1 ………… هدف کلی.. 40

1-17-2 ………… هدف اختصاصی.. 40

1-18 ……………. فرضیات تحقیق.. 40

1-19 ……………. سوالات تحقیق.. 40

2-1 ………………. سوابق تحقیق در ایران و سایر کشور ها در زمینه استفاده از اسانس ها و نانواسانس های گیاهی   43

3-1 ………………. دستگاه های مورد نیاز. 48

3-2 ………………. مواد و وسایل مورد نیاز. 48

3-2-1 ………….. سوش های میکروبی مورد مطالعه. 50

3-2-2 ………….. اسانس های مورد مطالعه. 50

3-3 ………………. روش کار. 51

3-3-1 ………….. روش تهیه نانواسانس های درمنه، اسطوخودوس، مورد و دارچین.. 51

3-3-1-1 ……… تهیه محلول کیتوزان. 51

3-3-2 ………….. روش تهیه محیط کشت اولیه برای رشد. 53

3-3-2-1 ……… محیط BHI 53

3-3-2-2 ……… محیط MHA.. 53

3-3-2-3 ……… محیط BA.. 53

3-3-3 ………….. فعال کردن باکتری ها و انتقال آن ها به محیط کشت… 54

3-3-4 ………….. روش تهیه محلول سوسپانسیون میکروبی.. 54

3-3-5 ………….. روش ساخت کدورت های استاندارد مک فارلند. 54

3-3-6 ………….. تعیین MIC با روش میکرودایلوشن.. 55

3-3-6-1 ……… روش علمی تعیین MIC.. 55

3-3-7 ………….. تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری یا MBC.. 57

3-3-8 ………….. روش انتشار در آگار (دیسک کاغذی) 57

3-3-8-1 ……… دیسک های آنتی بیوتیک مورد آزمایش (شاهد مثبت) 58

3-3-9 ………….. روش انتشار در آگار (چاهک) 58

4-1 ………………. شرح مختصری از مطالعه. 61

4-2 ………………. نتایج FTIR ترکیبات نانواسانس ها 61

4-3 ………………. نتایج حاصل از پراکندگی نور دینامیکی برای مطالعه اندازه نانوذرات… 63

4-4 ………………. نتایج microscope Scanning electron مربوط به اسانس های نانوکپسول شده 64

4-5 ………………. نتایج microscope Transmission electronمربوط به اسانس های نانو کپسول شده 65

4-6 ………………. نتایج آزمون تعیین حساسیت… 66

4-6-1-1 ……… نتایج MIC نانواسانس ها 68

4-6-1-2 ……… نتایج MIC اسانس ها 68

4-6-1-3 ……… نتایج MBC اسانس ها و نانواسانس ها 69

4-6-2 ………….. نتایج اثرات ضد میکروبی نانواسانس ها به روش انتشار دیسک و مقایسه با چند آنتی بیوتیک رایج   75

4-6-3 ………….. نتایج آزمایش انتشار در آگار(چاهک) 78

5-1 ………………. بحث.. 83

5-2 ………………. نتیجه گیری.. 89

5-3 ………………. پیشنهادات.. 89

. .. 90

چکیده لاتین..95

فهرست جداول

جدول 3-1       روش تهیه استاندارد لوله های مک فارلند. 55

جدول 4-1       نتایج آزمایش MIC و MBC نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد. 67

جدول 4-2       نتایج آزمایش MIC و MBC اسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین بر حسب میکروگرم
بر میلی لیتر μg⁄ml 68

جدول 4-3       قطر هاله عدم رشد سویه های میکروبی مورد آزمایش در برابر تعدادی از دیسک های آنتی بیوتیکی متداول در آزمایش دیسک دیفیوژن 77

فهرست نمودارها

نمودار 4-1       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-2       نمودار حداقل غلظت کشندگی ( MBC ) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

نمودار 4-3       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-4       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

نمودار 4-5       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-6       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

نمودار 4-7       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

نمودار 4-8       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

فهرست شکل ها

شکل 1-1         سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت… 3

شکل 1-2         استرپتوکوک پیوژن رشد یافته در کشت خون. 11

شکل 1-3         رنگ آمیزی گرم از خلط که در آن استرپتوکوک پنومونیه. 13

شکل 1-4         رنگ آمیزی گرم استافیلوکوک اورئوس… 17

شکل 1-5         رنگ آمیزی گرم پسودوموناس آئروژینوزا 20

شکل 1-6         گیاه درمنه. 24

شکل 1-7         گیاه اسطوخودوس… 25

شکل 1-8         گیاه دارچین.. 28

شکل 1-9         چوب و پودر دارچین.. 28

شکل 1-10       گیاه مورد. 31

شکل 1-11       ساختار شیمیایی پلیمر کیتوزان. 34

شکل 1-12       ساختار مولکولی کیتین.. 35

شکل 3-1         اسانس های تهیه شده از شرکت باریج اسانس کاشان. 51

شکل 3-2         دستگاه اولترا سونی کیت در مرکز ژنتیک… 52

شکل 4-1         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب بیوپلی ساکاریدی کیتوزان. 62

شکل 4-2         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب اسید میرستیک… 62

شکل 4-3         نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز دو ترکیب کیتوزان و اسید میرستیک در کنار هم. 63

شکل 4-4         توزیع اندازه نانوذرات ترکیبات اسانس نانوکپسول شده با بهره گرفتن از دستگاه DLS. 64

شکل 4-5         تصویر ساختار نانوکپسول های کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-6         تصویر ساختار نانوکپسول کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

شکل 4-7         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 66

شکل 4-8         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 67

شکل 4-9         پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس اسطوخودوس بر روی استرپتوکوک پیوژن بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-10       پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس دارچین بر روی استرپتوکوک پنومونیه بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

شکل 4-11       پلیت های کشت شده مربوط به تأثیر اسانس اسطوخودوس بر روی استافیلوکوک اورئوس بر روی محیط آگار برای تعیین MBC.. 70

شکل 4-12       پلیت های کشت داده شده مربوط به تأثیر اسانس مورد بر روی پسودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط آگار برای تعیین MBC، رقت شماره 3 رقت MIC.. 70

شکل 4-13       پلیت های تلقیح شده با باکتری پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های کاغذی آغشته به غلظت های مختلف نانواسانس اسطوخودوس… 76

شکل 4-14       پلیت های تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های کاغذی آغشته با غلظت های مختلف نانواسانس دارچین.. 76

شکل 4-15       پلیت تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 77

شکل 4-16       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-17       پلیت تلقیح شده با باکتری استرپتوکوک پیوژن حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

شکل 4-18       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   79

شکل 4-19       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   80

شکل 4-20       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا با غلظت های مختلفی از نانواسانس درمنه. 80

شکل 4-21       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس با غلظت های مختلفی از نانواسانس مورد. 80

خلاصه فارسی

سینوزیت یکی از شایع ترین موارد در بین مراجعان به پزشک عمومی است که احتیاج به تجویز آنتی بیوتیک دارد. از جمله باکتری های شایع در ایجاد این بیماری می توان به استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا اشاره کرد. امروزه با توجه به اثرات مضر داروهای شیمیایی بر بدن انسان، استفاده از روش های نوین فرمولاسیون مانند نانوکپسول کردن اسانس های گیاهی به دلیل کارایی بیشتر و همچنین کاهش عوارض سوء ناشی از کاربرد مستقیم آن ها مورد توجه قرار گرفته است. در این مطالعه که به روش in vitro می باشد، اثر ضدمیکروبی چهار نوع نانواسانس گیاهی بر روی میکروارگانیسم های استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا که از عوامل مهم سینوزیت می باشد در مقایسه با اسانس های طبیعی آن ها بررسی گردید، ابتدا تست کمی حداقل غلظت مهار کننده رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) و سپس تست کیفی (دیسک دیفیوژن) انجام گرفت. نتایج تست کمی MIC از نانواسانس های مورد بررسی در مورد استرپتوکوک پنومونیه با نانواسانس اسطوخودوس 097/0، استرپتوکوک پیوژن با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  097/0، استافیلوکوک اورئوس با نانواسانس درمنه  562/1 و در پسودوموناس آئروژینوزا با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  125/3 بدست آمد و نتایج بدست آمده در مقایسه با اسانس های طبیعی، تأثیر کمتر نانواسانس ها را نشان داد. و در تست دیسک دیفیوژن معلوم شد که نانواسانس ها قدرت رهایش از دیسک های کاغذی و انتشار در محیط جامد را ندارد.

نتایج، بیانگر اثرات خوب نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین بر روی چهار میکروارگانیسم های عامل سینوزیت می باشد و می توانیم به ساخت داروهای مناسب برای از بین بردن این میکروارگانیسم ها با منشأ گیاهی و با عوارض بسیار کمتر دارویی امیدوار باشیم.

واژه های کلیدی: نانواسانس، اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین، MIC، MBC

فصل اول

 

کلیات

 

1-1 سینوزیت

فهرست مطالب

عنوان                صفحه

. 1

.. 1

1-1 تعریف زخم و انواع آن. 2

۱-۲ سوختگی.. 2

۱-۳ زخم بستر. 2

۱-۴ ترمیم زخم. 3

۱-۵ التهاب.. 4

۱-۶ شکل‌گیری بافت.. 5

۱-۷ بلوغ و بازسازی بافت.. 6

۱-۸ روش‌های درمانی برای تسریع و بهبود فرایند ترمیم زخم. 6

۱-۹ پلاکت و نقش آن درروند ترمیمی زخم. 7

۱-۱۰ ساختمان و عملکرد پلاکت‌ها 8

۱-۱۱ مزایای استفاده از خون‌بند ناف.. 11

۱-۱۲ مزیت فرآورده‌های پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف نسبت به خون محیطی.. 12

۱-۱۳ انواع محصولات مشتق از پلاکت.. 12

۱-۱۴ پلاسمای غنی از پلاکت.. 12

۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13

۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14

۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14

۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

 

۲-۸ جمع‌ آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد‌ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68

شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف:

مواد مفید زیستی  مشتق از پلاکت ها نقش محوری در بهبود زخم ایفا می کنند. برای بررسی مکانیسم های سلولی ومولکولی بهبود زخم اثر عصاره پلاکت خون مشتق از خون بند ناف(UCB-PL)  بر فیبروبلاست ها، به عنوان سلول های قوی در بهبود زخم مورد مطالعه قرار گرفت. لذا به دلیل اینکه (UCB-PL)  دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها:

عصاره پلاکتی مشتق از پلاسمای خون بند ناف را تهیه، و سپس فیبروبلاست ها توسط غلظت های مختلف (UCB-PL)   تحت تیمار قرار گرفتند. زنده ماندن سلولها، میزان گسترش و بهبود زخم با بهره گرفتن از  روش  manualمورد بررسی قرار گرفت. سپس مشخصات بیان ژن با بهره گرفتن از روش  real-time PCR انجام شد. در نهایت وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2 / 3، smad2 / 3  از مسیر سیگنالینگ مورد استفاده قرار گرفت.

یافته ها:

نتایج نشان می دهد که افزایش  تکثیر سلولی در غلظت 10٪ (UCB-PL)   بدون اثر بر زنده ماندن سلولها می باشد.در همان غلظت(UCB-PL)  افزایش قابل توجهی از میزان بسته شدن زخم در 6-12 و 24 ساعت پس از تیمار دیده شد. همچنین تغییر نسبت بیان ژن در ژن Smad3 و Smad2 در غلظت10٪ از UCB- PL مقایسه با کنترل مثبت و منفی افزایش قابل توجهی داشت. روش وسترن بلات نشان داد که UCB- PL  اثر قابل توجهی بر سطوح پروتئین های Smad2، Smad3،Psmad2وPsamd3دارد.

نتایج:
UCB- PL باعث تحریک رشد و مهاجرت فیبروبلاست می شودکه موجب بهبود زخم از طریق فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ های مختلف از جمله، SMAD 2/3 مسیر سیگنالینگ می گردد.

واژه‌های کلیدی: ترمیم زخم، عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف، فیبروبلاست، مسیر سیگنالینگ smad

مقدمه

فرآورده عصاره پلاکتی[1] PL مشتق از خون‌بند ناف محصولی هست که از فرآورده پلاسمای غنی از پلاکتی PRP به دست می‌آید.. این ماده به علت غنی بودن از مواد مفید زیستی در ترمیم زخم‌ مورداستفاده قرار می‌گیرد. به دلیل اینکه PL دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.

 

سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM حاوی غلظت‌های ۵%، ۸%، ۱۰%، ۱۵% و ۲۰% از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوی FBS 10% و کنترل منفی که خالی از هر ۲ (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنین از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوی از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعیین مقدار مناسب و مؤثر بر تکثیر و درصد بقاء سلولی توسط شمارش سلولی با تریپان‌بلو در زمان‌های متفاوت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بررسی شد. هم‌چنین برای تعیین مقدار مناسب برای مهاجرت سلولی از تکنیک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتی با غلظت‌های متفاوت بر بیان ژن‌های smad2-smad3 در سلول‌های فیبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسی قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسی اثر عصارهی پلاکتی بر مسیر سیگنالینگ Smad، مقدار بیان پروتئین‌های  Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنیک