فهرست مطالب

1     مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده2

1-1     تکوین پیش از لانه­گزینی در موش3

1-1-1    لقاح.. 3

1-1-2     تکوین اولیه. 5

1-1-3     مکانیسم­های مولکولی دخیل در لایه­زایی رویان. 9

1-1-3-1     جدایی دو رده­ی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی.. 10

1-1-3-2     جدایی دو رده­ی سلولی اپی­بلاست و اندودرم اولیه. 11

1-2     تکنیک­های کمک باروری13

1-2-1     لقاح آزمایشگاهی.. 13

1-2-1-1      کیفیت سلول تخم. 14

1-2-2     کشت آزمایشگاهی رویان. 15

1-2-3     انجماد. 16

1-2-3-1     اصول انجماد. 17

1-2-3-2     مواد سرما محافظ.. 18

1-2-3-3     روش­های انجماد. 19

1-2-3-3-1     انجماد آهسته. 20

1-2-3-3-2     انجماد شیشه ­ای.. 21

1-2-4     سوراخ کردن مصنوعی.. 22

2     مواد و روش­ها…………………..25

2-1     حیوان.25

2-2     تولید رویان آزمایشگاهی26

2-2-1     استحصال اسپرم. 26

2-2-1-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 26

2-2-1-2     جابجایی مهره­ی گردنی.. 27

2-2-1-3     تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28

2-2-1-4     جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم. 29

2-2-2     استحصال تخمک… 31

2-2-2-1     تحریک تخمک­گذاری.. 31

2-2-2-1-1      تزریق داخل صفاقی.. 31

2-2-2-2     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 32

2-2-2-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 32

2-2-2-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر. 32

2-2-2-5     جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس… 33

2-2-3     لقاح آزمایشگاهی.. 34

2-2-3-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 34

2-2-3-2     لقاح.. 35

2-2-4     کشت آزمایشگاهی.. 35

2-2-4-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 35

2-2-4-2     کشت رویان. 36

2-3     تولید رویان درون­تنی37

2-3-1     تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

2-3-2     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 37

2-3-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 37

2-3-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی.. 37

2-3-5     استحصال بلاستوسیست… 38

2-4     سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

2-4-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 39

2-4-2     آماده ­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری.. 40

2-4-3     روش کار. 40

2-5     انجماد رویان41

 

2-5-1     انجماد شیشه ­ای.. 41

2-5-1-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 41

2-5-1-2   روش کار. 42

2-5-2        یخ­گشایی.. 43

2-5-2-1     آماده ­سازی محیط و قطرات… 43

2-5-2-2   روش کار. 44

2-6     بررسی بیان ژن.45

2-6-1     استخراج RNA از بلاستوسیست… 45

2-6-2     ساخت cDNA.. 46

2-6-3      طراحی پرایمر. 47

2-6-4     رقیق­سازی پرایمرها 47

2-6-5     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48

2-6-6     ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49

2-6-7     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49

2-7     طراحی آزمایش52

2-7-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه ­ای52

2-7-2     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه ­ای..52

2-7-3     آنالیز آماری.. 52

3     نتایج.54

3-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه ­ای 54

3-1-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

. 56

3-1-2-1     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56

3-1-2-2     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57

3-2      کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه ­ای.62

3-2-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

. 64

4     بحث و نتیجه ­گیری67

5     فهرست منابع..76

6     پیوست­ها83

فهرست جداول

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه ­ای بلاستوسیست موش.. 42

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش.. 44

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR. 50

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش.. 55

جدول ‏3‑2:  میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش. 63

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش.. 2

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر. 3

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی. 4

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران. 5

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش. 6

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ 8 به 16 سلولی. 7

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل. 7

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه ­ای شدن محیط انجماد. 21

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل. 24

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی. 28

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

شکل ‏2‑6: نحوه­ جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ قطره­ی محیط کشت.. 30

شکل ‏2‑7: نحوه­ ترزیق داخل صفاقی موش.. 31

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر. 33

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس.. 34

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF. 34

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

شکل ‏2‑13: نحوه­ قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی. 38

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی. 39

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40

شکل ‏2‑17: نحوه­ سوراخ کردن حفره­ی بلاستوسیست.. 41

شکل ‏2‑18: نحوه­ قطره­گذاری محلول­های انجماد شیشه ­ای. 42

شکل ‏2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43

شکل ‏2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخ­گشایی. 44

شکل ‏3‑1: بلاستوسیست­های درون­تنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM.. 56

شکل ‏3‑2: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. 57

58

. 59

. 60

. 61

. 62

شکل ‏3‑8: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانه­گزینی. 63