فهرست مطالب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: کلیات
چکیده فارسی	1
مقدمه	2
1-1 آنزیم ال-آسپاراژیناز	4
1-2   میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌	6
1-3   مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز	10
1-4  کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز	11
1-5  روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز	12
1-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز	12
1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز	12
1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز	14
1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز	15
1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز	17
1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی	18
1-7-1-آنزیم‌های بومی	18
1-7-1-1  ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی	18
1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا	19
1-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG)  -آسپاراژیناز)	20
1-8  کاربرد ال – آسپاراژینازها	22
1-8- 1  مکانیسم عمل به‌عنوان یک کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی	23
1-8-2  مکانیسم عمل به‌عنوان یک دارو	25
1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو	26
1-10 نیمه‌عمر دارو	26
1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز	27
1-11-1 عوارض ایمونولوژیک	27
1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز	27
1-11-3 سمیت دارو	28
1-12 فارموکینیتیک	29
فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام‌شده
2_1 تحقیقات انجام‌شده در ایران و خارج از ایران	32
2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز	32
2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی	34
2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با بهره گرفتن از محیط کشت اختصاصی M9	37
2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با بهره گرفتن از روش نسلریزاسیون	38
2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات	39
2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش  SDS-PAGE	39
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1 غربالگری سویه‌های مولد آنزیم از خاک	42
3-2   جداسازی و کشت باکتری	42
3-2-1   مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک	42
3-2-2   کشت	43
3-3   فعالیت آنزیم	45
3-4 روش‌های اندازه‌گیری آمونیاك	45
3-5    مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم	45
3-6    معرف آزمایش	46
3-7 خواندن جذب لوله‌های Test و Blank	46
3-8 مراحل کلونینگ	47
3-9  شرح مراحل کلونینگ	48
فصل چهارم: نتایج
4-1   نتایج مربوط به جداسازی	60
4-1-1   نتایج کشت	60
4-1-2   نتایج رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های بیوشیمیایی	61
4-1-3   نتایج بررسی فعالیت آنزیمی	63
4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته	66
4-1-5  نتایج مربوط به مستعد سازی	66
4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس	66
4-1-7 نتایج تست Quick- check	67
4-1-8 نتایج استخراج پلازمید	68
4-1-9 نتایج PCR تاییدی	69
4-1-10  نتایج تعیین توالی نمونه   : Bacillus cereus strain	69
4-1-11  نتایج تعیین توالی نمونه  : Bacillus thuringiensis strain	74
4-1-12  نتایج تعیین توالی نمونه  : Oerskovia turbata	79
فصل 5  نتایج
5-1 نتیجه	83
5-2 جمع بندی	83
5-3 محدودیت ها	83
5-4 پیشنهادها	84
منابع	85

 

فهرست جداول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز	7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن	8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز	19
جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده	20
جدول1-5 مقایسه‌ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی و PEG	29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی	31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت	42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکس PCR با در نظر گرفتن + n	51
جدول 3-3   شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها	51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ 0/2 cc	54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله ی Quick-check	57
جدول4-1  قطر هاله تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط  برحسب میلی‌متر	61
جدول4-2 رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های آنزیم مثبت	62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن‌های بیوشیمیایی نمونه‌های آنزیم مثبت	63
جدول4-4 جذب  نمونه های مولد آنزیم در طول‌موج 600 نانومتر	64
جدول4-5  جذب نمونه‌های مولد آنزیم در طول‌موج 480 نانومتر	72
جدول4-6  نتایج در سطح جنس و گونه	80

 

فهرست نمودار ها

 

 

 

نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز	11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر	64
نمودار 4- 2  میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر	65

 

فهرست شکل‌ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1  ساختار ال- آسپاراژیناز	3
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )	6
شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی	11
شکل 1-4  هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز	13
شکل1-5 توپولوژی از ال-آسپاراژیناز	14
شکل1-6  تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم	14
شکل1-7  این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C	15
شکل1-8 باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند)	15
شکل1-9  اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر	16
شکل1-10  ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز	17
شکل1-11 شکل نواری از آنزیم	17
شکل ‏1-12 واکنش میلارد. شاخه Z در اسیدآمینه آسپاراژین، CH2CONH2	25
شکل ‏1-13نقش کاتالیزوری آنزیم آسپاراژیناز در شکستن آسپاراژین	25
شکل1-14  مکانیسم عمل ال-آسپاراژیناز(نارتا و همکاران 2007)	26
شکل3-1 محیط  MMYبراث	44
شکل3-2 لوله‌های آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتری	46
شکل4-1 تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم	61
شکل4-2مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها	62
شکل4-3 محصول PCR مورد تائید برای کلونینگ	66
شکل4- 4 رشد باکتری حاوی پلازمید نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار	66
شکل4-5 گسترش باکتری نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار جدید	67
شکل4 -6 کشت باکتری نوترکیب در LB برای PEX	67
شکل4 – 7 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% –    8 R	67
شکل4 – 8 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 5 R	68
شکل4-9  پلازمید نوترکیب استخراج شده برروی ژل 1%	68
شکل4-10 تکثیر قطعه هدف از روی پلازمید نوترکیب استخراجی	69
شکل 4-11  هم تراز سازی توالی نمونه  5 R	71
شکل 4-12 هم تراز سازی توالی نمونه ی  8 R	77

 

 

چکیده فارسی

آنزیم آسپاراژیناز به‌طور عمده در پزشکی برای درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد[1]  و در صنایع غذایی برای کاهش تولید اکریل‌آمید در مواد غذایی نشاسته داری که سرخ یا برشته می‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژیناز[2]  جداشده از باکتری‌های مختلف دارای اثرات ضد سرطانی متفاوتی بوده است، جستجو برای یافتن میکروارگانیسم‌های تولیدکننده این آنزیم، یکی از راه‌های اصلی جهت دستیابی به آنزیمی با خصوصیات درمانی ایده آل می‌باشد. هدف این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکننده ال-آسپاراژیناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌های خاک از منابع مختلف نظیر جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهیه سوسپانسیون روی محیط کشت کشت داده شدند. کلنی‌های تولیدکننده‌ی آنزیم ال-آسپاراژیناز ، بر اساس تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی متمایز گردیدند. میزان فعالیت آن بر اساس روش نسلر موردبررسی قرار گرفت. باکتری‌های‌ تولیدکننده آنزیم دارای فعالیت مطلوب، پس از شناسایی بیوشیمیایی با روش مولکولی PCR مورد شناسایی قرار گرفتند و ‌توالی rRNA S 16نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده ،  بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتری های باسیلوس تورنجسیس و باسیلوس سرئوس و Oerskovia turbata  می باشد. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد نمونه های خاک حاوی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز می باشد.

کلمات کلیدی: آسپاراژیناز ،لوسمی،باکتری‌های مولد، نمونه‌های خاک

فصل اول

 

کلیات

 

مقدمه

آنزیم‌ها به‌عنوان تسریع‌کننده‌های واکنش‌های شیمیایی نقش مهمی در شکل‌گیری حیات سلولی  به‌نحوی‌که امروزه می‌شناسیم  ایفا می‌کنند. به‌کارگیری هدفمند آنزیم‌ها به‌منظور مداخله در سیر واکنش‌های شیمیایی و بیوشیمیایی همواره یکی از موضوعات موردتوجه در صنعت و پزشکی بوده است( رائو، 1999)

باکتری‌ها از اصلی‌ترین منابع تولید آنزیم به شمار می‌رود.. در این تحقیق باکتری‌های جداشده از خاک‌های مناطق  مختلف استان گلستان (مزرعه، جنگل، باغ) ازنظر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز خارج سلولی موردبررسی قرار گرفتند.

خاک یکی از مکان‌های عمده میکروارگانیسم‌ها محسوب می‌شود. فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌ها در خاک، باکتری‌ها هستند. خاک باغچه در هر گرم محتوی میلیون‌ها باکتری است. درجاهای عمیق تعداد آن‌ ها کاهش می‌یابد. قارچ‌ها به تعداد کمتر از باکتری‌ها در خاک یافت می‌شوند.( رائو، 1999)