فهرست مطالب

چکیده …………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

 فصل اول: مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-کلیات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-1- مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-2- میکروب­ها و دستگاه گوارش پرندگان……………………………………………………………………………………………………………. 8

1-3- تاثیر میکروارگانیسم­­ها بر فیزیولوژی دستگاه گوارش…………………………………………………………………………………… 9

1-4- موارد مصرف آنتی­بیوتیک­ها در طیور……………………………………………………………………………………………………………. 10

1-4- 1- محرک رشد آنتی­بیوتیکی و مکانیسم عمل آنتی­بیوتیک­ها………………………………………………………………….. 11

1-4- 2- آنتی­بیوتیک­ها و معایب مصرف آنها………………………………………………………………………………………………………… 12

1-4- 3- ممنوعیت مصرف آنتی بیوتیک­­های خوراکی…………………………………………………………………………………………. 13

1-4-4- افزودنی­های خوراکی جایگزین­ آنتی­بیوتیک­ها………………………………………………………………………………………… 14

1-4-4-1- اسید های آلی………………………………………………………………………………………………………………………………………. 14

1-4-4-2-پری­بیوتیک­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-4-3- پرو­بیوتیک­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-4-3-1- تعریف پرو­بیوتیک­ها………………………………………………………………………………………………………………………… 16

1-4-4-3-2- پروبیوتیک­ها و اثرات آنها……………………………………………………………………………………………………………….. 17

1-4-4-3-4- اثر مکمل­های پروبیوتیکی بر عملکرد طیور گوشتی…………………………………………………………………….. 18

1-4-4-3-5- پروبیوتیک ها و اثرات آنها بر فراسنجه های خونی………………………………………………………………………. 19

1-4-4-4- مصرف داروهای گیاهی به عنوان محرک رشد…………………………………………………………………………………… 20

1-4-4-6- چگونگی اثرگذاری ترکیبات فعال گیاهی …………………………………………………………………………………………. 22

1-4-4-7- اثرات داروهای گیاهی به عنوان محرک­رشد و چگونگی عمل آنها…………………………………………………… 27

1-4-4-8- پاسخ پرنده به محرک­های رشد گیاهی………………………………………………………………………………………………. 28

1-4-4-10- کلسترول سرم و اثرات ترکیبات گیاهی بر آن ……………………………………………………………………………… 28

1-4-4-11- محرک­های رشد گیاهی  و تاثیر آنها بر عملکرد طیور گوشتی……………………………………………………… 30

1-4-4-12- جمعیت میکروبی روده و تاثیر محرک­های رشد گیاهی بر آن……………………………………………………… 31

1-4-4- 13- خواص آنتی­­اکسیدانی محرک­های رشد گیاهی …………………………………………………………………………… 33

1-4-4-14- محرک­های رشد گیاهی و اثرات آنها بر هضم مواد مغذی…………………………………………………………….. 34

1–4-5-  محرک­های رشد گیاهی و اثر بر فراسنجه­های خونی…………………………………………………………………………… 35

1-4-5-1- عوامل مؤثر بر غلظت کلسترول پلاسما………………………………………………………………………………………………. 36

1-5- کبد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 37

1-5-1- هپاتیت ناشی از داروها و سموم……………………………………………………………………………………………………………….. 40

1-5-1-1- هپاتیت ناشی از مسکن­ها……………………………………………………………………………………………………………………. 41

1-5-1-2- هپاتیت ناشی از آنتی بیوتیک­ها و ضد ویروس­ها………………………………………………………………………………. 42

1-5-1-3- هپاتیت ناشی از  گیاهان دارویی…………………………………………………………………………………………………………. 42

1-5-2- بررسی عملکرد کبد…………………………………………………………………………………………………………………………………… 43

1-5-2-1- آنزیم های کبدی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-5-2-1-1- آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) …………………………………………………………………………………………….. 44

1-5-2-1-2- آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………………………………………. 45

1-5-2-1-3- آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………………………………………….. 46

1-5-2-2-بیلی­روبینBilirubin……………………………………………………………………………………………………………………………… 46

1-5-2-3- پروتئین تام Total Protein………………………………………………………………………………………………………………… 47

1-5-2-4- آلبومین Albumin ……………………………………………………………………………………………………………………………… 48

1-6- معرفی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

1-6-1- یونجه alfalfa…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

 

 

1-7- اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

فصل دوم: مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

2-1-مواد و روش ‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 59

2-1-1-مواد و وسایل مورد نیاز برای عصاره گیری……………………………………………………………………………………………….. 59

2-1-2- عصاره گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 60

2-2-محل و زمان اجرای طرح…………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

2– 3–موقعیت و ابعاد سالن……………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

2–4–آماده­ سازی سالن…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65

2-5- برنامه بهداشتی و واکسیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………. 66

2-6- اصول پرورش جوجه ها………………………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-7- صفات مورد بررسی در آزمایش2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………. 68

2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-7-2- فراسنجه ­های خونی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 69

2-7-3- آزمایشگاه و پارامتر ‏های خونی…………………………………………………………………………………………………………………. 72

2-8-  مدل آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

2-8-1- روش تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 73

2-8-2-  آنالیز آماری داده ­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 74

فصل سوم: نتایج……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 75

3-1- روش تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 76

3-1-1- مقایسه گروه­ها از حیث آنزیم­ های کبدی…………………………………………………………………………………………………. 77

3-1-1-1-آنزیم کبدی AST………………………………………………………………………………………………………………………………….. 80

3-1-1-2- آنزیم کبدی ALT………………………………………………………………………………………………………………………………… 81

3-1-1-3- آنزیم کبدی ALP………………………………………………………………………………………………………………………………… 83

3-1-2- مقایسه گروه ها از حیث سایر فاکتورها……………………………………………………………………………………………………… 85

3-1-2-1- مقایسه گروه­ها از نظر میزان پروتئین………………………………………………………………………………………………….. 90

3-1-2-2- مقایسه گروه­ها از نظر میزان آلبومین………………………………………………………………………………………………….. 91

3-1-2-3- مقایسه گروه­ها از نظر میزان بیلی­روبین………………………………………………………………………………………………. 92

3-1-2-4- مقایسه گروه­ها از نظر میزان تری­گلیسیرید………………………………………………………………………………………… 93

3-1-2-5- مقایسه گروه­ها از نظر میزان کلسترول………………………………………………………………………………………………… 94

3-1-2-6- مقایسه گروه­ها از نظر میزان وزن…………………………………………………………………………………………………………. 95

فصل چهارم: بحث و نتیجه ­گیری…………………………………………………………………………………………………………………………. 96

4-1- بررسی فایتوژنیک­های شناخته شده…………………………………………………………………………………………………………….. 97

4-2- استفاده از فایتوژنیک ها در جیره­ی غذایی طیور………………………………………………………………………………………… 98

4-3- سایر تحقیقات در زمینه­ استفاده از گیاهان دارویی در طیور…………………………………………………………………… 98

4-4- بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 100

4-5- نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 105

پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 108

فهرست منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 109

 

فهرست نمودارها

3-1- نمودار ستونی میزان AST در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 81

3-2- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه……………………………………………………………………………….. 82

3-3- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 84

3-4- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان پروتئین………………………………………………………………. 90

3-5- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان آلبومین………………………………………………………………. 91

3-6- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان بیلی­روبین…………………………………………………………… 92

3-7- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان تری­گلیسیرید……………………………………………………… 93

3-8- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان کلسترول…………………………………………………………….. 94

3-9- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث وزن………………………………………………………………………………… 95

فهرست جداول

1-1: تاکسونومی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

2- 1- گروه بندی تیمارها و غلظت مصرفی عصاره­ها…………………………………………………………………………………………….. 65

2- 2- برنامه واکسیناسیون جوجه­های گوشتی……………………………………………………………………………………………………… 66

2-3- روش آزمایش و کیت­های مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………….. 72

3-1: مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در سه متغیر وابسته(آنزیم های کبدی)…………. 78

3-2- تاثیرعصاره یونجه بر کاهش مسمومیت ………………………………………………………………………………………………………… 79

3-3- آزمون مقایسه­های زوجی دانت بین گروه­های آزمایشی و شاهدمسموم از نظر آنزیم کبدی AST………….. 80

3-4- آزمون مقایسه­ای زوجی دانت، بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALT…………. 82

3-5- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALP………………….. 83

3- 6- مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در شش متغیر وابسته…………………………………… 85

3-7- جدول تحلیل واریانس تاثیر کاربندی­های مختلف بر 6 متغیر وابسته………………………………………………………… 87

3-8- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر 6 متغیر وابسته………………………. 88

چکیده:

مقدمه: اکثر بیماری­های رایج در صنعت مرغداری کشورکه بطور همه­گیر جوجه­های گوشتی را مبتلا می­ کنند، عملکرد کبد را مختل می­نمایند. کبد به عنوان اندام تشخیصی بسیار مهمی در جوجه­های گوشتی مطرح است. از طرفی به دلیل تشدید متابولیسم در جوجه­های گوشتی به منظور افزایش تولید و راندمان، کبد به عنوان مرکز مهم درگیر در متابولیسم و واسطه­ مهم دستگاه گوارش و خون از اهمیت خاصی برخوردار است، بطوری­که هر گونه آسیب کبدی در جوجه­های گوشتی در نخستین گام روی تغذیه و نهایتاٌ راندمان تولید جوجه­ها تاثیر خواهد داشت.

روش بررسی: تعداد 120 قطعه جوجه یک‏روزه به‏طور تصادفی به دو گروه مسموم و غیر مسموم با سه تیمار برای هر گروه و 20 تکرار برای هر تیمار تقسیم شدند. تیمارها شامل: کنترل شاهد، یونجه1رقیق، یونجه2غلیظ؛ شاهد مسموم، یونجه1رقیق مسموم، یونجه2غلیظ مسموم می­باشد؛ که در پایان دوره پرورش، آنزیم‏های شاخص عملکرد کبد(AST,ALT,ALP) به همراه فاکتورهای خونی: پروتئین تام، آلبومین و بیلیروبین، کلسترول و تری­گلیسیرید سرم تعیین شدکه نتایج به شرح زیر می­باشد: از لحاظ آماری یونجه 1/0 ٪ برای آنزیم کبدی AST در سطح P<0/05 و آنزیم کبدی ALP در سطح01/0P< بطور معنی­دار کاهش نشان داد. آنزیم ALT کاهش معنی­داری نداشت. فاکتور بیلی­روبین در دوز 15/0 ٪ بطور معنی­داری در سطح P<0/05 افزایش نشان داد. فاکتور پروتئین تام نیز کاهش معنی­داری در سطح01/0P< داشت. فاکتور آلبومین تغییر معنی­داری نسبت به شاهد مسموم نشان نداد. فاکتور تری­گلیسیرید بطور معنی­داری درسطح01/0P< کاهش یافت. کلسترول به همراه متغیر وزن، افزایش معنی­داری در سطح01/0P< داشتند.

نتیجه گیری: عصاره الکلی یونجه در غلظت 1/0 درصد در شرایط مسمومیت اثر حافظتی بر کبد دارد و سبب کاهش آنزیم­ های کبدیASTوALTوALP در جوجه­های گوشتی می­گردد و در غلظت بالاتر ممکن است به­ دلیل افزایش بیلی­روبین و کاهش پروتئین تام، باعث تشدید مسمومیت گردد.

واژگان کلیدی: عصاره­یونجه، آنزیم‏های عملکردی کبد، فاکتورهای خونی، مسمومیت، طیور گوشتی.

فصل اول: مقدمه

 

1-کلیات

 

1-1-مقدمه

گوشت طیور یکی از منابع اصلی تامین کننده نیازهای پروتئین حیوانی در تغذیه­ جوامع انسانی بشمار می­رود و امروزه با پیشرفت­هایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را بخود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(39) در سالهای اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149) از جمله اقدامات انجام شده در این زمینه، مصرف آنتی­بیوتیک­ها و افزودنی­ها، جهت ضدعفونی و مکمل در تغذیه طیور می­باشد که علاوه بر اثر پیشگیرانه و درمانی، در دوز پایین در مراحل اولیه دوره رشد، باعث افزایش رشد نیز می­گردد(9).

طیور، کارآمدترین راه تبدیل محصولات فرعی و ضایعات کشاورزی به گوشت و تخم‏مرغ برای مصرف انسان می‏باشد. بنابراین پرورش طیور و افزایش تولیدات آنها یکی از مهم‏ترین و عملی‏ترین راه‏های تأمین پروتئین حیوانی در کشور ما است. پرورش طیور صنعتی توسعه یافته می‏باشد، به­ طوری­که قادر است غذای قابل مصرف بیشتر و با هزینه­ کمتر، برای جمعیت کشور فراهم سازد(39).کشور ایران هفتمین کشور تولیدکننده مرغ جهان با تولید 2 میلیون تن مرغ آماده طبخ در سال1392 بوده است(19). استان فارس چهارمین استان تولیدکننده مرغ گوشتی با سهم 5/7 درصدی به­شمار می‏آید و پیش بینی می­ شود به استان دوم کشور در سال 1393 تبدیل شود(5). گوشت مرغ مهم‏ترین منبع تأمین کننده پروتئین حیوانی مردم کشور با مصرف سرانه 25 کیلوگرم در سال، محسوب می­ شود(5). سند امنیت غذایی کشور و چشم‏انداز توسعه صنعت مرغداری کشور، نشان­دهنده افزایش تولید و مصرف این محصول در سال‏های آتی است(34). با پیشرفتهایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را به­خود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(38). در سال­های اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149). امروزه از مواد افزودنی خوراکی ضد­میکروبی، بطور گسترده در پرورش حیوانات مزرعه­ای، برای افزایش بهره­وری و فراهم نمودن شرایط اکولوژیکی مناسب سیستم گوارشی به­منظور افزایش سرعت رشد، کاهش ریسک در برابر خطر بیماری­ها، استفاده می­ شود(209). افزایش توجه به توسعه مقاومت آنتی­بیوتیکی در باکتری­ ها و احتمال وجود بقایای آنتی­بیوتیکی در فرآورده ­های طیور و همچنین ایجاد سمیت کبدی ناشی از مصرف آنتی­بیوتیک­ها در دوز بالا، تلاش محققان برای یافتن راه­های دیگری غیر از استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در جیره­ی غذایی طیور را سبب شده است(51).

با توجه به مشکلات استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در تغذیه جوجه­های گوشتی، نظر محققان به سمت مواد افزودنی دیگری به عنوان جانشین آنتی­بیوتیک­ها در غذای طیور معطوف شد، که این مواد افزودنی باعث سلامتی و بهبود میکرو فلور دستگاه گوارش طیور شوند(102).

از این رو محققین، ترکیبات گیاهی مختلفی را به عنوان جایگزین آنتی­بیوتیک­ها در مواد تولیدی حیوانی مورد مطالعه قرار داده­اند؛ که باعث بهبود سیستم ایمنی و عملکرد ارگان­های مهم بدن مانند کبد شده و نهایتاٌ سبب افزایش در عملکرد تولیدی آنها نیز شده است(149). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها از جمله­ این افزودنی­های طبیعی هستند که می­توان از آنها به عنوان آنتی­بیوتیک­های طبیعی استفاده کرد(11) گیاهان دارویی به عنوان افزودنی­های خوراکی طبیعی؛ اخیراً در جیره غذایی طیور جهت بهبود عملکرد و افزایش پاسخ­های ایمنی پرندگان به جای آنتی بیوتیک­ها مطرح شده است(69و71).

تمایل به استفاده از گیاهان دارویی در تغذیه دام و طیور را می­توان به صورت افزایش معنی­دار مقالات علمی چاپ شده از سال 2000 به بعد مشاهده کرد(175). عامل اصلی این رخداد، شروع ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در اتحادیه اروپا از سال 1999 و قطع کامل آن در سال 2006 بوده است(163). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها، یکی از جایگزین­های مطرح آنتی­بیوتیک­ها هستند که در سال­های اخیر به خاطر ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها، مورد توجه قرار گرفته­اند(188).

گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها به دلیل عواملی چون؛ ارزش بالای اقتصادی و کم­هزینه بودن تولید آنها، نداشتن اثرات تخریبی بر محیط زیست، ارگانیک بودن این داروها، کم بودن عوارض جانبی در مقایسه با داروهای شیمیایی،

 

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

چکیده ………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول : مقدمات وکلیات تحقیق…………………………………………………………………………… 2

1-1 بافت شناسی تخمدان……………………………………………………………………………………… 2

1-2 تعریف استرس……………………………………………………………………………………………… 5

1-3 استرس و گلوکوکورتیکوئید ها………………………………………………………………………….. 5

1-4 استرس های دوران بارداری……………………………………………………………………………… 6

1-5 انواع استرس………………………………………………………………………………………………… 7

1-6 علائم استرس……………………………………………………………………………………………….. 7

1-7 اثرات استرس……………………………………………………………………………………………….. 8

1-7-1 اثر استرس بر روی تخمدان………………………………………………………………………….. 8

1-8 استرس اکسیداتیو………………………………………………………………………………………… 10

1-8-1 ارتباط بین استرس اکسیداتیو و عملکرد تخمدان……………………………………………… 13

1-9 تعریف پروپولیس……………………………………………………………………………………….. 15

1-9-1 ترکیبات پروپولیس………………………………………………………………………………….. 16

1-9-2 تاثیر بره موم بر روی اینترفرون ها……………………………………………………………….. 18

1-9-3 مصارف بره موم………………………………………………………………………………………. 18

1-10 ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………… 19

1-10-1 اهداف………………………………………………………………………………………………… 20

1-10-2 فرضیات ……………………………………………………………………………………………. 21

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده…………………………………………………………………. 23

فصل سوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………… 28

3-1 تهیه و تزریق عصاره پروپولیس به حیواانات……………………………………………………….. 28

3-1-1 تهیه عصاره آبی – الکلی پروپولیس……………………………………………………………… 28

3-2 حیوانات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………… 31

3-2-1 گرو های مورد مطالعه در این طرح……………………………………………………………… 31

3-3 نمونه گیری………………………………………………………………………………………………… 32

3-4 روش سنجش هورمونی………………………………………………………………………………… 33

3-5 روش بافت شناسی و شمارش فولیکول ها………………………………………………………… 34

3-5-1 روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین……………………………………………………… 34

3-5-2 روش رنگ آمیزیPAS…………………………………………………………………………….. 36

3-6 روش ارزیابی آپوپتوز(مرگ برنامه ریزی شده سلول)……………………………………………. 37

3-6-1 روش کار …………………………………………………………………………………………….. 38

3-6-2 نتیجه رنگ آمیزی تانل……………………………………………………………………………… 39

فصل چهارم: نتایج………………………………………………………………………………………………. 41

4-1 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر وزن بدن و وزن تخمدان نوزادان…………. 41

4-2 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر سطح سرمی کورتیکوسترون……………….. 42

4-3 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر سطح سرمی 17بتا- استرادیول……………. 43

4-4 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد و قطر اووسیت و تعداد انواع
فولیکولهای تخمدانی نوزادان…………………………………………………………………………………. 44

4-5 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد فولیکولهای آترتیک تخمدان ………. 45

4-6 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر قطر اووسیت………………………………….. 46

 

4-7 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد اووسیت………………………………… 47

4-8 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد سلولهای گرانولوزای تانل مثبت ….. 54

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری …………………………………………………………………………… 61

5-1 بحث……………………………………………………………………………………………………….. 61

5-1-1 یافته‎های اصلی تحقیق………………………………………………………………………………. 61

5-1-2 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر وزن بدن و وزن تخمدان
موشهای صحرایی……………………………………………………………………………………………….. 62

5-1-3 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر سطح 17- بتا استرادیول…….. 64

5-1-4 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر تعداد انواع فولیکولهای
تخمدانی و فرایند آترزی فولیکولی…………………………………………………………………………. 65

5-1-5 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر تعداد و قطر اووسیت………… 66

5-1-6 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر فرایند مرگ برنامه ریزی شده
(آپوپتوزیس) سلولهای گرانولوزا……………………………………………………………………………. 67

5-2 نتیجه گیری ………………………………………………………………………………………………. 69

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………… 70

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………. 71

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………….. 78

فهرست جدول ها

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

جدول 4-1 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر وزن بدن حیوان……………… 41

جدول4-2 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر تعداد و قطر اووسیت……….. 45

جدول 4-3 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر میانگین تعداد فولیکول ها…. 46

فهرست نمودار ها

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

نمودار 4-1 اثر پروپولیس بر سطح سرمی کورتیکوسترون(نانوگرم/میلی لیتر) نوزادان موش های
صحرایی تحت استرس دوری از مادر…………………………………………………………………….. 42

نمودار 4-2 اثر پروپولیس بر سطح سرمی 17بتا- استرادیول(نانوگرم/میلی لیتر) نوزادان موش های
صحرایی تحت استرس دوری از مادر……………………………………………………………………… 43

نمودار 4-3 اثر پروپولیس بر قطر اووسیت (میکرومتر) نوزادان موش های صحرایی
تحت استرس دوری از مادر………………………………………………………………………………….. 46

نمودار 4-4 اثر پروپولیس بر تعداد اووسیت(در 022/0 میلیمتر مربع سطح تخمدان) نوزادان
موش های صحرایی تحت استرس دوری از مادر……………………………………………………….. 47

نمودار 4-5 اثر پروپولیس بر تعداد سلولهای گرانولوزای تانل مثبت تخمدان نوزادان
موش های صحرایی تحت استرس دوری از مادر………………………………………………………. 54

فهرست شکل ها

عنوان ………………………………………………………………………………………………………….. صفحه

شکل1-1 بافت های تخمدانی…………………………………………………………………………………. 4

شکل1-2 انواع فولیکول ها در مقطع تخمدان، بزرگنمایی ×٤۰…………………………………………. 4

شکل3-1 پروپولیس…………………………………………………………………………………………… 30

شکل3-2 تزریق پروپولیس…………………………………………………………………………………… 32

شکل3-3نمونه گیری از بافت تخمدان…………………………………………………………………….. 33

شکل3-4 خون گیری از ناحیه قلب………………………………………………………………………… 34

شکل4-1 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه سالم………………………………………………. 49

شکل4-2 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه سالم………………………………………………. 50

شکل 4-3 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 50……………………… 51

شکل 4-4 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 100……………………. 52

شکل 4-5 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 200……………………. 53

شکل 4-6 گروه سالم با رنگ آمیزی TUNEL  ………………………………………………………… 56

شکل 4-7 گروه استرس با رنگ آمیزی TUNEL  …………………………………………………….. 57

شکل 4-8 گروه استرس + پروپولیس 50 با رنگ آمیزی TUNEL  ………………………………. 58

شکل 4-9 گروه استرس + پروپولیس100 با رنگ آمیزی TUNEL  ……………………………… 59

شکل 4-10 گروه استرس + پروپولیس200 با رنگ آمیزی TUNEL  ……………………………. 60

 

چکیده فارسی

سابقه و هدف: هدف از این تحقیق بررسی اثر عصاره آبی – الکلی پروپولیس بر تغییرات ساختاری
و تکاملی تخمدان موش صحرائی به دنبال استرس دوران نوزادی می باشد.

روش بررسی: تعداد 48 سر موش صحرایی ماده با سن 15 روز و میانگین وزنی 20-15 گرم تهیه و به طور تصادفی به شش گروه هشت تایی تقسیم شدند. کلیه آزمایش ها از روز 15 بعد از تولد شروع و در روز 21 بعد از تولد پایان یافتند. گروه اول (کنترل منفی) شامل نوزادان 21 روزه بدون هرگونه مداخله، گروه دوم (کنترل مثبت) شامل نوزادانی که در طی دوره کنار مادرشان بودند و به صورت روزانه 1/0 میلی لیتر محلول سالین دریافت کردند، گروه سوم (گروه استرس) شامل موش هایی که روزانه شش ساعت در طی دوره
از مادرشان جدا شدند، گروه چهارم، پنجم و ششم شامل موش هایی هستند که علاوه براسترس دوری
از مادر روزانه به ترتیب به میزان mg/kg 50 ،100و 200 عصاره پروپولیس دریافت کرده اند. 24 ساعت بعد از آخرین تزریق تحت بیهوشی عمیق، خون گیری برای اندازه گیری سطح کورتیکوسترون و 17 -بتااسترادیول انجام شد و سپس تخمدانها خارج شده و بعد از ثابت سازی و آماده سازی، برشهای تهیه شده با روش های H&E، PAS و Tunel رنگ آمیزی شدند. مقاطع با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مجهز به نرم افزار آنالیز تصاویر بافتی، فولیکولها سالم و اترتیک، اووسیت و سلولهای گرانولوزا  هیستومورفومتری شدند.

یافته ها: استرس دوری از مادر باعث افزایش سطح کورتیکوسترون و کاهش سطح 17- بتا استرادیول سرم خون نوزادان گردید. استفاده از عصاره آبی– الکلی پروپولیس باعث کاهش سطح کورتیکواسترون و افزایش 17- بتا استرادیول سرم خون نوزادان به دنبال استرس شد. همچنین عصاره پروپولیس از کاهش تعداد انواع فولیکول های تخمدان و اووسیت، کاهش قطر اووسیت و افزایش تعداد فولیکول های آترتیک و سلولهای گرانولوزای آپوپتوتیک تخمدان به دنبال استرس جلوگیری کرد.

نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که عصاره آبی– الکلی پروپولیس ایرانی بطور قابل ملاحظه ای از تغییرات ساختاری و تکاملی تخمدان نوزادان موش صحرائی به دنبال استرس جلوگیری می کند. این اثر احتمالاً ناشی از وجود ترکیباتی مثل پلی فنلها و فلاونوئیدها در پروپولیس با توان آنتی اکسیدانی بالا می باشد.

واژگان کلیدی: پروپولیس، استرس دوران نوزادی، تخمدان، کورتیکواسترون، 17- بتا استرادیول.

فصل اول: مقدمات و کلیات تحقیق

1-1. بافت شناسی تخمدان

هر تخمدان توسط اپی تلیوم ساده مکعبی به نام اپی تلیوم زایا که امتدادی از مزوتلیوم بر روی کپسولی از جنس بافت همبند متراکم (تونیکا آلبوژینه) است دربر گرفته شده است. بیشترین بخش تخمدان را منطقه قشری آن تشکیل می دهد که یک بافت همبند پرسلول است  و فولیکولهای تخمدانی فراوانی دارد. داخلی ترین قسمت تخمدان منطقه مرکزی آن است که از بافت همبند سست و رگهای خونی که از طریق مزانتر آویزان کننده تخمدان به آن وارد شده اند ، تشکیل شده است (شکل 1-1). بین منطقه قشری و مرکزی مرز مشخصی وجود ندارد.

هر فولیکول تخمدان از یک اووسیت که با یک یا چند لایه سلولهای اپی تلیالی احاطه
شده اند، تشکیل می شود. در انسان فولیکول هایی که در زمان زندگی رویانی تشکیل شده اند، فولیکول بدوی نامیده می شوند که شامل یک اووسیت اولیه همراه با یک لایه سلول فولیکولی پهن است. این فولیکولها در نواحی سطحی منطقه قشری تخمدان دیده می شوند. اووسیت درون فولیکول بدوی سلول کروی شکلی است که در حدود ۲۵ میکرومتر قطر دارد (مسشر، جان کوئیرا[6] 2013). در جوندگانی مثل موش صحرایی (موش سفید بزرگ آزمایشگاهی، رت)

فهرست مطالب

عنوان           صفحه

چکیده 1

مقدمه. 2

فصل اول: کلیات

1-1-معرفی گیاه آرتیشو یا کنگر فرنگی.. 4

1-1-1- تاریخچه. 5

1-1-2- گیاه شناسی.. 5

1-1-2-1- نام های مختلف گیاه آرتیشو. 5

1-1-2-2- انواع واریته های موجود کنگر فرنگی.. 7

1-1-2-3- اندام دارویی.. 8

1-1-2-4- مواد موجود در گیاه کنگر فرنگی.. 8

1-1-2-5- فلاونوئیدهای موجود در کنگر فرنگی.. 9

1-1-2-5-1- خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها 10

1-1-2-5-2- فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند 11

1-1-2-6-آثار فارماکولوژیکی گیاه آرتیشو یا کنگر فرنگی.. 12

1-1-2-7- عوارض جانبی گیاه کنگر فرنگی.. 12

1-1-2-8- دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان. 13

1-1-2-9- اعمال مهم آنتی اکسیدان ها 13

1-1-2-10-رادیکال های آزاد 14

1-1-2-10-1- استرس اکسیداتیو. 14

1-2- استامینوفن. 15

1-2-1- تاریخچه کشف استامینوفن. 15

1-2-2- کاربرد های استامینوفن. 17

1-2-3- نام آیوپاک… 18

1-2-4- اشکال دارویی استامینوفن. 18

1-2-5- مکانیسم اثر استامینوفن. 18

1-2-7- عوارض جانبی استامینوفن. 19

1-3- کبد 19

1-3-1- کبد و سم زدایی.. 20

1-3-2- نقش كبد در دفع. 21

1-3-3- آمینو ترانسفراز ها 21

1-3-3-1- چه داروهایی باعث ایجاد سطح غیرطبیعی آمینوترانسفرازها می گردند 23

1-3-3-2- سایر آنزیم های کبدی چگونه هستند 24

1-3-3-3- موارد سطح غیر طبیعی آنزیم های کبدی چه هستند 24

1-3-4- بیماری های کبد 26

1-3-4-1- نکروز کبدی ماسیو و مفرط.. 26

1-3-4-2- بیماری کبدی القا شده توسط دارو و توکسین. 27

1-5- پیشینه تحقیق.. 28

فصل دوم: روش تحقیق

2-1- مواد و و وسایل و تركیبات شیمیائی مصرفی.. 34

2-2- دستگاه ها، لوازم و تجهیزات غیر مصرفی.. 37

2-3- روشها و مراحل اجرای آزمایش… 38

2-3-1- نحوه انتخاب و شرایط نگهداری حیوانات مورد آزمایش… 38

 

 

2-3-2-گروه بندی حیوانات مورد آزمایش… 39

2-3-3- چگونگی تهیه و تجویز عصاره هیدروالکلی گیاه آرتیشو. 40

2-3-4- طریقه گاواژ كردن حیوان. 41

2-3-5- القاء مسمومیت توسط استامینوفن در موش های صحرایی.. 42

2-3-6- خون گیری.. 43

2-3-7- روش تهیه ی سرم 44

2-3-8- تست های آزمایشگاهی بر روی نمونه های سرم خون. 44

2-3-8-1- اندازه گیری آنزیم های آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) و آسپارتات آمینو ترانسفراز(AST) 44

2-3-9- روش های تجزیه وتحلیل و محاسبه آماری.. 45

فصل سوم: نتایج

3-1- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) در  گروه های مورد بررسی  47

3-2- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) در گروه های مورد بررسی  55

3-3- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) در گروه های مورد بررسی  63

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری.. 80

پیشنهادها 80

منابع و مآخذ

منابع فارسی.. 82

منابع انگلیسی.. 84

ABSTRACT.. 93

فهرست جداول

جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 48

جدول 3-2 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 49

جدول 3-3 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز ALT)…51

جدول 3-4 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 53

جدول 3-5 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 55

جدول 3-6 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 57

جدول 3-7 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 59

جدول 3-8 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 61

جدول 3-9 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 63

جدول 3-10 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 65

جدول 3-11 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 67

جدول 3-12مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 69

فهرست نمودار ها

نمودار3-1- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 48

نمودار 3-2- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 50

نمودار 3-3- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 52

نمودار3-4- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 54

نمودار 3-5- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 56

نمودار 3-6- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 58

نمودار 3-7- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 60

نمودار 3-8- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 62

نمودار 3-9- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 64

نمودار 3-10- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 66

نمودار 3-11- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 68

نمودار 3-12 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 70

فهرست شکل‌ها

شکل (1-1) گیاه آرتیشو(کنگر فرنگی) 7

شکل (1-2) ساختار شیمیایی پاراستامول. 18

شکل (2-1)محل نگهداری حیوانات… 38

شکل (2-2) روش وزن کردن رت ها 40

شکل (2-3) دستگاه روتاری. 41

شکل (2-4) روش تجویز دارو به صورت گاواژ. 42

شکل (2-5) نحوه خون گیری مستقیم از قلب موش های صحرایی. 43

شکل (2-6) سانتریفیوژ. …44

چکیده

استامینوفن یک داروی متداول ضد درد و تب است که در دوزهای بالا منجر به نکروز کبدی و کلیوی در انسان و حیوان می گردد. آرتیشو گیاهی  با ترکیبات فلاونوئیدی، آلکالوئیدی و خواص آنتی اکسیدانی است. در تحقیق حاضر اثر محافظت کبدی عصاره هیدروالکلی گیاه آرتیشو در مسمومیت حاد کبدی ناشی از استامینوفن مورد بررسی قرار گرفته است.

48 سر موش صحرایی نر از نژاد ویستار به طور تصادفی در 6 گروه تقسیم شدند شامل: کنترل، گروه دریافت کننده استامینوفن(mg/kg 700)، گروه های دریافت کننده استامینوفن(mg/kg 700)+عصاره آرتیشو با دوز(600,800,1000mg/kg)، و گروه دریافت کننده آرتیشو با دوز (mg/kg 1000). دارو و عصاره به شکل دهانی تجویز گردیدند. بعد از 24 ساعت نمونه گیری انجام شد و با روش کالریمتریک میزان آنزیم های ALT وAST وALP سنجیده شد. در پایان داده ها با نرم افزار spss  ویرایش 18 و تست آماری توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج نشان دهنده افزایش معنی دار آنزیم های ALT،AST و ALP (p≤0.001)در گروه دریافت کننده استامینوفن می باشد. به طوری که این پارامترها در گروه های دریافت کننده عصاره کاهش یافت.

نتیجه گیری: مصرف آرتیشو می تواند اثرات سمی استامینوفن را بر آنزیم های کبدی کاهش دهد.

کلمات کلیدی: استامینوفن، آرتیشو، کبد، موش صحرایی

مقدمه

نارسایی حاد کبد در اثر عوامل متعددی از جمله هپاتیت های ویروسی، آسیب های توکسیک ناشی از سموم و داروها و همچنین ایسکمی ایجاد می شود. کبد اولین سد دفاعی بدن را در برابر آسیب ناشی از مواد بیولوژیک برون زاد تشکیل می دهد که خود ممکن است به نکروز سلول های کبدی بیانجامد. در آسیب های توکسیک کبد، استرس های اکسیداتیو نقشی اساسی را بر عهده دارند.

كبد مكان استراتژیک وصول مواد غذایی جذب شده و همچنین مولكول های جذب شده مضر، داروها و سم باكتری ها می باشد (65). به طور کلی کبد اعمال حیاتی مهمی همچون سم زدایی، سوخت و ساز کربوهیدرات ها، ترشح صفرا، سنتز فیبرینوژن و پروترومبین پلاسما، تنظیم گلوکز و چربی خون و… را به عهده دارد و مخزن موادی مثل گلوکز(به صورت گلیکوژن)، چربی، ویتامین ها و آهن می باشد.

همان طور که عنوان شد یکی از مهم ترین اعمال كبد علاوه بر سوخت و ساز مواد مختلف، سم زدایی مواد آلوده كننده محیطی و داروهای شیمیایی می باشد. در اكثر موارد در طی عمل سم زدایی، فعال سازی متابولیكی توسط آنزیم های سیتوكروم P450  میكروزوم های كبدی باعث ایجاد متابولیت های سمی و فعال می‌شود كه این می تواند موجب آسیب بافت های مختلف از جمله كبد شود. تیواستامید، تتراكلریدكربن، اتانول و استامینوفن از جمله موادی هستند

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                         صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 3

فصل اول: کلیات

اهداف و انگیزه……………………………………………………………………………………………………………………….        5

1-1.گیاه کرفس……………………………………………………………………………………………………… …7

1-1-1. نام های گیاه………………………………………………………………………………………………. …7

1-1-2. آثار فارماکولوژیکی……………………………………………………………………………………………………….       8

1-1-3. ریخت شناسی…………………………………………………………………………………………………………….        8

1-1-4. ترکیبات شیمیایی………………………………………………………………………………………………………..         8

1-1-5. ترکیبات آنتی اکسیدان………………………………………………………………………………………………….         9

1-1-6. دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان……………………………………………………………   9

1-1-7. اعمال مهم آنتی اکسیدان ها……………………………………………………………………………. 10

1-1-8. آنزیم های آنتی اکسیدان……………………………………………………………………………….. .10

1-1-8-1.سوپراکسید دیسموتاز (SOD)……………………………………………………………………. 10

1-1-8-2.کاتالاز……………………………………………………………………………………………………. 11

1-1-8-3.گلوتاتیون پراکسیداز(GSH)………………………………………………………………………. 11

1-1-9. پلی فنول…………………………………………………………………………………………………… 12

1-1-9-1-گروه های اصلی ترکیبات فنولی………………………………………………………………….. 13

1-1-10. فلاونوئیدها……………………………………………………………………………………………… 13

1-1-10-1.خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها……………………………………………………………… 13

1-1-10-2. شیمی گیاه فلاونوئیدها……………………………………………………………………………. 15

1-1-10-3. آپیژنین……………………………………………………………………………………………….. 16

1-1-10-4. فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند…………………………………….. 16

1-1-10-5. فارماکودینامی فلاونوئیدها……………………………………………………………………….. 17

1-1-10-6. جهش زایی و سمیّت ژنی مصرف زیاد فلاونوئیدها……………………………………….. 17

1-1-11. رادیکال های آزاد……………………………………………………………………………………… 18

1-1-11-1. استرس اکسیداتیو………………………………………………………………………………….. 18

1-1-11-2. واکنش های رادیکال های آزاد………………………………………………………………….. 20

1-1-11-3. تقسیم بندی انواع رادیکال های آزاد…………………………………………………………… 21

1-1-11-4. انواع گونه های رادیکالی اکسیژن و نیتروژن…………………………………………………. 22

1-1-11-5. روش های مختلف تولید گونه های اکسیژن و نیتروژن……………………………………. 22

1-1-11-6. اثر رادیکال های آزاد بر روی چربی ها………………………………………………………. 23

1-1-11-7. سیستم های مقابله با آسیب رادیکال های آزاد………………………………………………. 23

1-2. کبد………………………………………………………………………………………………………………. 24

1-2-1. ساختمان کبد……………………………………………………………………………………………… 24

1-2-2. تشریح و آناتومی کبد……………………………………………………………………………………. 25

1-2-3. بافت شناسی کبد…………………………………………………………………………………………. 27

1-2-4. سلول های كبدی………………………………………………………………………………………….. 27

1-2-5. نقش سیستم لنفاوی در عملکرد کبد…………………………………………………………………. 30

1-2-6. ترمیم بافت در کبد افراد بزرگسال……………………………………………………………………. 31

1-2-7. اعمال ترشّحی و دفع كبد……………………………………………………………………………….. 31

1-2-7-1. متابولیسم و دفع گزنوبیوتیک ها…………………………………………………………………… 32

1-2-8. متابولیسم کربوهیدرات ها………………………………………………………………………………. 33

1-2-9. متابولیسم لیپید ها………………………………………………………………………………………… 34

1-2-10. اختلال هموستاز در بیماری های کبدی…………………………………………………………… 35

1-2-10-1. آنزیم های رها شده از بافت کبدی بیمار……………………………………………………… 36

1-2-10-2. ویژگی بافتی………………………………………………………………………………………… 37

1-2-10-3. توزیع داخل سلولی آنزیم ها……………………………………………………………………. 38

1-2-10-4. فعایت نسبی در کبد و پلاسما………………………………………………………………….. 38

1-2-10-4. مکانیسم آزاد سازی……………………………………………………………………………….. 39

1-2-10-5. سرعت پاکسازی آنزیم ها از پلاسما…………………………………………………………… 40

1-2-11. انواع بیماری های کبد………………………………………………………………………………….. 40

1-2-11-1. مکانیسم ها و الگو های آسیب………………………………………………………………….. 41

1-2-12. آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) (GPT) (SGPT) (ALAT)……………………… 42

1-2-13. آنزیم آسپارات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………….. 43

1-2-14. آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………….. 44

1-2-15. پروتئین تام……………………………………………………………………………………………….. 46

 

1-2-15-1. میزان پروتئین های خون……………………………………………………………………………. 46

1-2-16. اندازه گیری آلبومین پلاسما……………………………………………………………………………. 48

1-2-17. بیلی روبین پلاسما………………………………………………………………………………………. 48

1-2-17-1. بیلی روبین و انواع آن………………………………………………………………………………. 49

1-2-18. وظایف عملی پروتئین های پلاسما…………………………………………………………………. 49

1-2-19. ساخت پروتئین های پلاسما………………………………………………………………………….. 50

1-2-20. ازت اوره خون…………………………………………………………………………………………. 51

1-2-21. کراتینین………………………………………………………………………………………………….. 51

1-3. تتراکلرید کربن و سمّیت آن……………………………………………………………………………….. 53

1-3-1. مکانیسم ها ی فعال سازی متابولیکی تتراکلرید کربن…………………………………………….. 54

1-3-2. پراکسیداسیون چربی ها…………………………………………………………………………………. 56

1-3-3. نقص در ساخت پروتئین………………………………………………………………………………. 57

1-3-4. به هم خوردن تعادل کلسیم……………………………………………………………………………. 57

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1. دستگاه‌ها و لوازم و تجهیزات مورد استفاده…………………………………………………………….. 60

2-2. تركیبات شیمیایی و مواد مصرفی…………………………………………………………………………. 61

2-3.دستگاه پرکولاتور……………………………………………………………………………………………………………62

2-4. روش تهیه عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس…………………………………………………………….. 63

2-5. حیوانات مورد استفاده و نحوة ‌نگهداری آنها…………………………………………………………… 65

2-6. گروه بندی حیوانات…………………………………………………………………………………………. 66

2-7. روش دادن عصاره…………………………………………………………………………………………… 68

2-8. روش تجویز دارو……………………………………………………………………………………………. 68

2-9. خونگیری از قلب …………………………………………………………………………………………… 69

2-10. روش تعیین فعالیت آنزیم آسپارتات آمنیوترانسفراز (AST/GOT) و آنزیم الانین آمینوترانسفراز (GPT/ALT)……………… 70

2-11. روش تعیین فعالیت آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………….. 71

2-12. روش تعیین میزان ‌ آلبومین و بیلی روبین در سرم خون………………………………………….. 71

2-12. روش های تجزیه و تحلیل آماری………………………………………………………………………… 73

فصل سوم: نتایج

3-1. نتایج مربوط به غلظت آنزیم  AST در گروه های آزمایشی………………………………………. 75

3-2. نتایج مربوط به غلظت آنزیم  ALT در گروه های آزمایشی………………………………………. 78

3-3. نتایج مربوط به غلظت آلکالین فسفاتاز در گروه های آزمایشی……………………………………. 82

3-4. نتایج مربوط به غلظت آلبومین در گروه های آزمایشی………………………………………………. 85

3-5. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین توتال (T.Billi) در گروه های آزمایشی…………………… 88

3-6. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین مستقیم (D.Billi) در گروه های آزمایشی………………… 91

3-7. مقایسه نتایج مربوط به  وزن موشهای صحرایی در پایان آزمایش در گروه های آزمایشی…… 93

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1. بحث……………………………………………………………………………………………………………. 98

4-2. نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………….. 107

4-3.پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………. 108

فهرست منابع

منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………………. 110

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………….112

Abstract…………………………………………………………………………………………………………. 122

فهرست جداول

جدول2 -1: گروه بندی نمونه ها بر اساس مصرف عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس و تتراکلرید کربن…………………………………….. 66

جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد………………………………………..76

جدول 3-2: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز……………………………….. 77

جدول 3-3 : مقایسه میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد……………………………………..79

جدول3-4: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصارههیدروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز  80

جدول 3-5: مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروه کنترل و شاهد…………………………82

جدول 3-6: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز…………………………….. …..83

جدول 3-7: مقایسه میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………………….85

جدول 3-8: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آلبومین   86

جدول 3-9: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد………………………………..88

جدول3-10: اثر تزریق درن صفاقی(IP) عصاره هیدروالکی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت بیلی روبین توتال……………………… 89

جدول 3-11: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد…………………………..91

جدول3-12: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان بیلی روبین مستقیم………………………… 92

جدول 3-13: مقایسه میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد……………………………94

جدول3-14: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان وزن………………………… 95

فهرست نمودارها

نمودار (3-1): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد…………………………76

نمودار (3-2): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST……………………………………………….. …………78

نمودار(3-3): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد………………………….80

نمودار (3-4): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT ……………………………………………………….81

نمودار(3-5): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALP در گروه کنترل و شاهد……………………….83

نمودار (3-6): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلکالین فسفاتاز ………………………………………………………84

نمودار(3-7): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………86

نمودار (3-8): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین …………………………………………………………………87

نمودار(3-9): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال  در گروه کنترل و شاهد………………….89

نمودار (3-10): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال …………………………………………………90

نمودار(3-11): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم  در گروه کنترل و شاهد……………..92

نمودار (3-12): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم ……………………………………………….93

نمودار(3-13): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی  در گروه کنترل و شاهد……………..95

نمودار (3-14): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در پایان آزمایش………………………..       96

فهرست شکل ها

شکل (1-1): گیاه کرفس………………………………………………………………………………………………………………… 7

شکل (1-2-): ساختار فلاونوئیدها…………………………………………………………………………………………..  16

شکل (1-3-): آسیب بافتی توسط رادیکال ها……………………………………………………………………………   21

شکل (1-4): ساختمان هپاتوسیت ها و سلول های کبدی……………………………………………………………     29

شکل (1-5): کبد اندامی است که متابولیسم کربوهیدرات را انجام می دهد……………………………………       34

شکل (1-6): متابولیسم لیپیدها………………………………………………………………………………………………… 35

شکل(2-1):دستگاه پرکولاتور…………………………………………………………………………………………………..63

شکل (2-2): نحوه عصاره گیری………………………………………………………………………….. ………………….64

شکل (2-3): تصویر قفس های نگهداری مو……………………………………………………………………………..   65

شکل (2-4): طرز گاواژ………………………………………………………………………………………………………….          67

شکل (2-5): نحوه تزریق تتراکلریدکربن و روغن زیتون……………………………………………………………..    69

چکیده:

مشکلات استفاده از داروهای شیمیایی و آثار بجامانده از عوارض جانبی بعضی از داروها منجر به فزونی استفاده از گیاهان دارویی شده است. یافتن دارویی موثر در درمان این اختلالات مورد توجه محققین و پزشکان می باشد. گیاه کرفس (Apium graveolens) از خانوادهApiaceae) ) است که در ایران از این گیاه استفاده غذایی می نمایند و بر این باورند که خواص دارویی مفیدی نیز دارد. لذا این مطالعه با هدف بررسی اثرات محافظت کبدی گیاه کرفس بر مسمومیت القایی ناشی از مصرف تتراکلریدکربن (CCl4) درموش های سفید بزرگ آزمایشگاهی نر از نژاد اسپیراگوداولی انجام شد. بنابراین تعداد 40 سر موش به تعداد مساوی به پنج گروه هشت تایی تقسیم شدند. یک گروه به عنوان کنترل و در چهار گروه دیگر توسط CCl4  سمیت کبدی (هپاتوتوکسیک) ایجاد شد. از این چهار گروه، یک گروه به عنوان شاهد و در سه گروه دیگر روزانه به ترتیب 200، 400 و 600 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن حیوان از عصاره هیدروالکلی کرفس به صورت دهانی (گاواژ) داده شد. چهل روز بعد از شروع مطالعه در کلیه گروه ها آنزیم های آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، آسپارتات امینوترانسفراز (AST) و آلکالین فسفاتاز (ALP) و همچنین غلظت های سرمی آلبومین، بیلی روبین توتال و مستقیم که از شاخص های آسیب های کبدی هستند اندازه گیری و با بهره گرفتن از آزمون آماری ANOVA و T-testتجزیه و تحلیل گردید. تزریق درون صفاقی تتراکلریدکربن باعث افزایش فعالیت های AST ,ALT ,ALP و کاهش غلظت آلبومین و افزایش غلظت بیلی روبین توتال و مستقیم در مقایسه باگروه کنترل شد. مصرف عصاره گیاه کرفس سبب گردید این فاکتور به طور معنی داری(05/0P≤) به وضعیت نرمال نزدیک شود. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس در برابر آسیب های کبدی ایجاد شده توسط تتراکلریدکربن دارای اثرات محافظتی است، که احتمالاً بواسطه اثر آنتی اکسیدانی ترکیبات پلی فنلی آن در مهار فعالیّت CCl4 و

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                  صفحه

خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول: كلیات

1-1. بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-2. ضروریت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-3. اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-4. سئوالات و فرضیه‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 9

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-1-1. تاریخچه لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………. 12

2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………… 15

2-1-2-1. آنتی ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O)…………………………………………………………………………………. 17

2-1-2-2. الیگو ساکارید مرکزی………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-1-2-3. لیپید A……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18

2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19

2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19

2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21

2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

2-6-1. تاریخچه‌ هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

2-8.

 پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67

2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71

2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93

3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

3-11-2. منحنی استاندارد H2O2……………………………………………………………………………………………………….. 98

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110

3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده…………………………………………. 111

3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 111

3-18-2. منحنی استاندارد H2O2…………………………………………………………………………………………………….. 111

3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112

3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده……………………………………….. 112

3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده………………………………………………………………………. 113

3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113

فصل چهارم: نتایج

4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116

4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با بهره گرفتن از روش XTT….. 117

4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)      118

4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   119

4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)       121

4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)     122

4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)     123

4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   124

4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)  125

4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)………….. 126

4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف……………………………………………….. 127

4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف…………………………………………….. 128

4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف………………………………………… 129

4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست……………………………………………………… 138

5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo…………………………………………………………… 142

5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro………………………………………………… 144

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 149

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 162

فهرست جداول

جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135

فهرست نمودارها

نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116

نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117

نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118

نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119

نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120

نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120

نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)       121

نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122

نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)     123

نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124

نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125

نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126

نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم       127

نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم     128

نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم  129

فهرست اشكال

شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14

شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15

شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16

شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19

شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28

شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31

شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33

شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول…………………………………………………………… 34

شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها……………………………………………………………………………………………… 36

شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40

شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE2………………………………………………………………………………………………….. 41

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42

شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47

شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48

شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50

شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52

شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57

شکل  2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58

شكل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک‌های داخلی فیبروبلاست……………………………………………………….. 60

شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی……………………………………………………………………………………………… 63

شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم……………………………………………………………………………. 65

شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی)……………………………………………………………………………………………… 66

شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی)…………………………………………. 66

شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها      72

شکل 2-25. اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم……………………………………………………………………………… 73

شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال…………………. 80

شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن………………………………………………………………………… 84

شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی……………………………………………………………………. 94

شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………. 101

شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص…………………………………….. 105

شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم………………………………………………………………………………… 107

شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………….. 108

شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی…………….. 109

شکل 4-1. عکس‌های حاصل از نمونه‌های پاتولوژیک………………………………………………………………………. 134

 

خلاصه فارسی

اندوتوکسین‌ها از عمده‌ترین فاکتور‌های ویرولانس باکتری‌های گرم منفی هستند که به دلیل اثرات ایمونولوژیکی، پاتو فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی بر سلول‌های یوکاریوتی، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترمیم زخم ممکن است به دلیل نقص در مولکول‌های میانجی متوقف شود. لیپو پلی ساکارید (LPS) یکی از اصلی‌ترین محرک‌های تولید میانجی‌های التهابی به شمار می‌آید. هدف اصلی این تحقیق، بررسی اثر تجویز موضعی LPS سالمونلا انتریکا بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنین اثر آن بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست پوست می‌باشد. نمونه‌گیری از بافت‌های پوستی مربوط به گروه‌های شاهد و تیمار طی روز‌های 1، 2، 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، به منظور بررسی‌های بیوشیمیایی و پاتولوژیکی انجام شد. میزان حیات سلولی با بهره گرفتن از روش XTT برای سلول‌های فیبروبلاست صورت گرفت. زخم‌های تیمار شده با LPS (100μg) نسبت به گروه شاهد، افزایش ارتشاح سلول‌های التهابی به محل زخم و افزایشی جزئی در میزان ضخامت لایه‌ی اپیتلیوم نشان دادند. سنجش سیکلو اکسیژناز-2 (COX-2)، هیدروژن پراکسید (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) به منظور اثر احتمالی آنها در ترمیم زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. در سنجش‌های بیوشیمیایی میزان NO، COX-2، H2O2 افزایش یافت (P˂0.001). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسی میزان حیات سلول‌های فیبروبلاست تفاوت معنادار بین گروه‌های شاهد و تیمار مشاهده شد که البته این تفاوت وابسته به دوز مصرفی LPS و مدت زمان انکوباسیون بود. نتایج نشان می‌دهند که LPS با تحریک تولید میانجی‌های التهابی، توانایی افزایش مرحله‌ی التهابی ترمیم زخم را دارد. مطالعات گسترده‌تر با طراحی دوز‌های مختلف از LPS استرین‌های باکتریایی مختلف، فهم بهتری از مکانیسم اثر LPS در ترمیم زخم در مدل حیوانی نشان خواهد داد. به احتمال زیاد این یافته‌ها در توسعه‌ی روش‌های جدید برای درمان زخم‌ها ارزشمند خواهد بود.

واژگان کلیدی: زخم، لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا، التهاب، نیتریک اکسید، سیکلو اکسیژناز-2، هیدروژن پر اکسید، فیبروبلاست

فصل اول

كلیات

1-1. بیان مسئله

سالمونلا انتریکا از دسته‌ی باکتری‌های گرم منفی بی‌هوازی اختیاری داخل سلولی است که سالانه باعث 1.3 میلیارد مورد بیماری در جهان می‌شود. از میان 6 زیر گونه‌ی سالمونلا که بر اساس تفاوت در فلاژل، کربوهیدرات و لیپوپلی ساکارید دسته‌بندی شده‌اند، بیش از 2500 سرووار مربوط به سالمونلا انتریکا شناخته شده است. سالمونلا می‌تواند طیف وسیعی از سلول‌ها مثل دندریتیک سل‌ها، ماکروفاژها، هپاتوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها، کولونوسیت‌ها و سلول‌های اپی‌تلیال را مورد حمله قرار دهد. LPS سالمونلا از محرک‌های قوی پاسخ التهابی در ماکروفاژ‌ها محسوب می‌شود.

التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند، در موش مورد مطالعه قرار گرفته است. با تزریق داخل پوستی LPS S-form و لیپید A سالمونلا تیفی موریوم به موش ddy، بعد از 12 ساعت میزان نفوذپذیری رگها در آن منطقه تغییر می‌کند و باعث ادم می‌شود و به دنبال آن بعد از 24 تا 72 ساعت منجر به نکروز هموراژیک می‌شود. القای التهاب پوستی توسط LPS و لیپید A به ترتیب از بیشترین تاثیر تا کمترین تاثیر بدین صورت هستند:

Re-form LPS > Rc-form LPS > lipid A > Ra-form LPS > S-form LPS

ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند. جزیره‌ی بیماریزایی 2 سالمونلا (SPI2) برای فرار از ماکروفاژ‌ها و ایجاد عفونت سیستمیک در موش‌ها لازم می‌باشد. سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 (سیکلواکسیژناز-2) شود. سایتوکاین‌ها و ایکوزانوئیدهایی چون پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها در نحوه‌ی عملکرد ماکروفاژ‌ها تاثیر می‌گذارند. پروستاگلاندین‌ها (PGs) که در انواع مختلفی از سلول‌ها ساخته می‌شوند از جمله میانجی‌های مهم التهاب و پاسخ ایمنی محسوب می‌شوند. مرحله‌ی محدود کننده‌ی سرعت در سنتز PGs توسط COX کاتالیز می‌شود. COX-2 در انواع کمتری از سلول‌ها بیان می‌شود ولی به شدت با محرک‌های مختلفی مثل میتوژن‌ها، سایتوکاین‌ها، هورمون‌ها و انکوژن‌ها القا می‌شود، همچنین لیپو پلی ساکارید‌ها در القای بیان COX-2 در مونوسیت‌ها و ماکروفاژ‌ها سهیم هستند که این نوع از القا که با LPS ایجاد می‌شود، توسط مسیر سیگنال‌دهی انتقالی پروتئین