فهرست مطالب

چکیده فارسی……………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول: مقدمه

1-1 سرطان    .  .. ………………………………………………………………………………………… 3

1-2 سرطان ……………………………………………………………………………………………………… 4

1-3 کولورکتال…………………………………………………………………………………………. 4

1-4 سرطان کوورکتال…………………………………………………………………………….. 4

1-4-2- عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان کولورکتال ……………………………………………………………… 5

1-4-3- تغییرات مولکولی در سرطان ……………………………………………………………. 7

1-3-4 تشخیص سرطان کولورکتال ……………………………………………………………………… 9

1-4-4- علائم و نشانه ها……………………………………. 11

1-4-6- روش های درمانی برای سرطان ……………………………………. 14

1-4-6-1- جراحی…………………………………………………………………….. 14

1-4-6-2- شیمی درمانی………………………………………………………………………14

1-4-6-3- درمان بیولوژیکی……………………………………………………………………14

1-4-6-2- پرتو درمانی (درمان با اشعه) ……………………………………………………………………….. 14

1-2 پروتئین CD166 …………………………………………………………………………………………………… 15

1-4 مساله تحقیق ………………………………………………………………………………… 17

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………… 19

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………… 24

3-1-1 باکتری مورد استفاده……………………………………………………………………………………. 24

3-1-2 پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………….. 24

3-1-3 انزیم ………………………………………………………………………………………. 25

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………… 25

3-1-5 انتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-6 محیط کشت باکتری………………………………………………………………….. 25

3-1-7 ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-8 مواد شیمیایی…………………………………………………………………………. 25

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………… 25

3-2  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه ALCAM.. ………………………………………………………………………………………………… 31

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر…………………………………………………………………………….. 31

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………………………. 32

3-3 سنتز شیمیایی DNA  ALCAM………………………………………………………………………………….. 32

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب………………………………………………………………………………………….. 32

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده…………………………………………………………………….. 32

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………….. 33

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK  حاوی DNA پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 33

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………….. 34

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli………………………………………………………….. 35

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 35

3-4-3 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………………….. 36

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK  حاوی DNAپروتئین ALCAM…………………………………………………………… 36

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 38

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………… 39

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 39

 

3-5 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………. 39

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه CD166از ژل…………………………………………. 39

3-5-2 لایگیشن……………………………………………………………………………………………………………… 43

3-5-3 ترانسفورماسیون……………………………………………………………………………………………………….. 43

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 44

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………. 45

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………….. 45

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژنپروتئین ALCAM……………………………………………………………. 46

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 48

3-6  بیان پروتئین پروتئین ……………………………………….. 48

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک …………………………………………… 49

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page……………………………………………………………………………………………………………. 49

3-6-2-1 محتویات كیت.    SDS-page     ………………………………………………………………………………………………………………… 50

3-6-2-2روش انجام  SDS_page………………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین پروتئین ALCAM…………………………………………………………. 55

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization……………………………………………………………………………….. 55

4-2 سنتز شیمیایی DNA پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………………….. 60

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSKحاوی DNA پروتئینALCAM…………………………………………………………………………… 62

4-4 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………. 63

4-5 بیان پروتئین پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………….. 66

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث…………………………….. 68

نتیجه گیری…………………………………………. 80

منابع…………………………………. 81

فهرست شکل ها

شکل1-1.  ساختار پروتئینALCAM………………………………………………………………………………………………………. 4

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ………………………………………………………………. 26

شکل 3-2.شیکر انکوباتور……………………………………………………………………………………… 27

شکل  3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 27

شکل 3-4…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ………………………………….. 28

شکل3-5. سانتریفیوژ اپندورف المان………………………………………………………………………………………… 29

شکل 3-6… بن ماری…………………………………………………………………………………………………………………………………. 29

شکل 3-7… انکوباتور………………………………………………………………………………………………………………… 30

شکل 3-8 دستگاه تصویرساز ژل……………………………………………………………………………………………………. 30

شکل 3-9 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز……………………………………………………… 36

شکل3-10 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز………………………………………… 41

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…….. 57

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد ازبهینه سازی…………………………………………. 57

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………………………………….. 57

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli…………………………………………58

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………………………………………. 60

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   ……………………………………………………………………………………………….62

شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA…………………………………………………………………………………………. 63

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی پروتئینALCAM.             ……………………………………………………………………………………… 64

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK…………………………………………………………………………………………. 64

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a……………………………………………………………………………………………. 63

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن………………………………………………………………….. 66

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………………………… 66

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………………………………………………… 67

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ……………………………………………………………………….. 68

چکیده

مقدمه :

سرطان کولورکتال به عنوان چهارمین سرطان شایع در دنیا با برآورد 2/1میلیون مورد جدید در سال می باشد. این سرطان با توجه به متاستاز به نواحی مختلف بدن به خصوص کبد و ریه در مراحل پیشرفت بیماری یکی از کشنده ترین نوع از سرطان های بدخیم می باشد.هم چنین این سرطان رتبه سومین نوع از سرطان های شایع در زنان و پنجمین نوع در میان مردان در ایران درارا می باشد.

CD166 یکی از پروتئین های سطحی سلولهای سرطانی در سرطان کولورکتال است که با سرطانی شدن سلول ها میزان بیان سطحی آن بیشتر می شود. از این جهت می توان از آن به عنوان مارکر مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما برآن شدیم که  تا با بهره گرفتن از کلون کردن و بیان پروتئین سطحی CD166 زمینه برای استفاده از آن جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیص سرطان کولورکتال فراهم شود.

روش کار :

در این مطالعه ابتدا توالی ژن موردنظر به کمک بانک های اطلاعات ژنی انتخاب شد. سپس توالی موردنظر را آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت. ژن آنالیز شدن به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با بهره گرفتن از فرایند کلوینگ ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال و تکثیریافت.

در انتها نیز بیان ژن موردنظر را در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین موردنظر به کمک تکنیک sDs-page مورد بررسی قرار گرفت.

بحث و نتیجه گیری :

ژن موردنظر توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین موردنظر را تولید کند.

از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیص سرطان کولورکتال به واسطه ی تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن ، سیستم ایمنی فرد را جهت پیشگیری از ابتلا به سرطان کولورکتال تقویت نمود.

واژه های کلیدی : سرطان کولورکتال ، CD166 ، کلونینگ

فصل اول : مقدمه

 

• تعریف سرطان :

سرطان در سلول ها که واحد سازنده بافت ها هستند شروع می شود. به طور طبیعی سلول ها رشد می کنند و در صورت نیاز بدن ما به سلول های جدید تقسیم می شوند و وقتی پیر می شوند و سلول های جدید جای آن ها را می گیرند . گاهی این مراحل اشتباه پیش می رود ، سلول های جدید در حالی که تشکیل می شوند که بدن به آنها نیاز ندارد و سلول های پیر نمی میرند این سلول ها زیادی یک توده ی بافتی تشکیل می دهند که به آن توده یا تومور می گویند.

تومورها می توانند خوش خیم یا بدخیم باشند. تومورهای خوش خیم سرطان نیستند.

تومورهای خوش خیم :

• تومورهای خوش خیم به ندرت تهدید کننده زندگی هستند.

عنوان                    فهرست مطالب                صفحه

فصل اول: کلیات

خلاصه فارسی.. 1

فصل اول: کلیات

1-1: تاریخچه. 3

1-2: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس: 4

1-3: نیازهای غذایی.. 6

1-4: دسته بندی و تیپ بندی هموفیلوس آنفلونزا 8

1-4-1: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 8

1-4-2: سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 9

1-4-3: دیگر سیستم های دسته بندی: 9

1-5: خصوصیات پاتوژنیک… 9

1-5-1: آنتی ژن کپسولی.. 9

1-5-2: فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژن های دیگر: 11

1-5-3: عوامل تشکیل کلنی و ویرولانس…. 12

1-6: علائم کلینیکی عفونتهای هوفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 13

1-6-1: مننژیت… 15

1-7:درمان: 15

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

1-8: تشخیص: 18

1-8-1: روش کشت… 18

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

1-8-3: روش مولکولی.. 19

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

1-9-1-1: منطقه I. 22

1-9-1-3: منطقه II. 22

1-9-1-2: منطقه III. 22

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

1-11: Real-time PCR.. 28

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

1-12: بیان مساله. 34

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

1-14: اهداف پژوهش…. 36

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1: محیط های کشت… 43

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

3-2: کشت نمونه ها 45

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

3-3-2: روش فریز کردن. 45

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

3-5-2: پرایمرها 48

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

3-5-3: برنامه PCR.. 49

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

3-6: استخراج PRP. 54

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

3-8:تعیین تعداد کپی cap با بهره گرفتن از Real-time PCR: 57

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

3-8-2: شرایط واکنش: 57

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با بهره گرفتن از PCR : 62

فصل چهارم: نتایج

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

5-3: پیشنهادات… 87

منابع  …   89

خلاصه انگلیسی.. 98

فهرست جداول

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

فهرست تصاویر

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67

شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C  و D.. 69

شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb  در نمونه های انتخاب شده 81

شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها 82

فهرست نمودارها

نمودار 4-1: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB…………………………………………………… 76

نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB………………………………………………….. 76

نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها……… 80

خلاصه فارسی

هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با بهره گرفتن از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با بهره گرفتن از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با بهره گرفتن از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد  Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.

کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib

فهرست مطالب

چکیده …………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

 فصل اول: مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-کلیات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-1- مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-2- میکروب­ها و دستگاه گوارش پرندگان……………………………………………………………………………………………………………. 8

1-3- تاثیر میکروارگانیسم­­ها بر فیزیولوژی دستگاه گوارش…………………………………………………………………………………… 9

1-4- موارد مصرف آنتی­بیوتیک­ها در طیور……………………………………………………………………………………………………………. 10

1-4- 1- محرک رشد آنتی­بیوتیکی و مکانیسم عمل آنتی­بیوتیک­ها………………………………………………………………….. 11

1-4- 2- آنتی­بیوتیک­ها و معایب مصرف آنها………………………………………………………………………………………………………… 12

1-4- 3- ممنوعیت مصرف آنتی بیوتیک­­های خوراکی…………………………………………………………………………………………. 13

1-4-4- افزودنی­های خوراکی جایگزین­ آنتی­بیوتیک­ها………………………………………………………………………………………… 14

1-4-4-1- اسید های آلی………………………………………………………………………………………………………………………………………. 14

1-4-4-2-پری­بیوتیک­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-4-3- پرو­بیوتیک­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-4-3-1- تعریف پرو­بیوتیک­ها………………………………………………………………………………………………………………………… 16

1-4-4-3-2- پروبیوتیک­ها و اثرات آنها……………………………………………………………………………………………………………….. 17

1-4-4-3-4- اثر مکمل­های پروبیوتیکی بر عملکرد طیور گوشتی…………………………………………………………………….. 18

1-4-4-3-5- پروبیوتیک ها و اثرات آنها بر فراسنجه های خونی………………………………………………………………………. 19

1-4-4-4- مصرف داروهای گیاهی به عنوان محرک رشد…………………………………………………………………………………… 20

1-4-4-6- چگونگی اثرگذاری ترکیبات فعال گیاهی …………………………………………………………………………………………. 22

1-4-4-7- اثرات داروهای گیاهی به عنوان محرک­رشد و چگونگی عمل آنها…………………………………………………… 27

1-4-4-8- پاسخ پرنده به محرک­های رشد گیاهی………………………………………………………………………………………………. 28

1-4-4-10- کلسترول سرم و اثرات ترکیبات گیاهی بر آن ……………………………………………………………………………… 28

1-4-4-11- محرک­های رشد گیاهی  و تاثیر آنها بر عملکرد طیور گوشتی……………………………………………………… 30

1-4-4-12- جمعیت میکروبی روده و تاثیر محرک­های رشد گیاهی بر آن……………………………………………………… 31

1-4-4- 13- خواص آنتی­­اکسیدانی محرک­های رشد گیاهی …………………………………………………………………………… 33

1-4-4-14- محرک­های رشد گیاهی و اثرات آنها بر هضم مواد مغذی…………………………………………………………….. 34

1–4-5-  محرک­های رشد گیاهی و اثر بر فراسنجه­های خونی…………………………………………………………………………… 35

1-4-5-1- عوامل مؤثر بر غلظت کلسترول پلاسما………………………………………………………………………………………………. 36

1-5- کبد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 37

1-5-1- هپاتیت ناشی از داروها و سموم……………………………………………………………………………………………………………….. 40

1-5-1-1- هپاتیت ناشی از مسکن­ها……………………………………………………………………………………………………………………. 41

1-5-1-2- هپاتیت ناشی از آنتی بیوتیک­ها و ضد ویروس­ها………………………………………………………………………………. 42

1-5-1-3- هپاتیت ناشی از  گیاهان دارویی…………………………………………………………………………………………………………. 42

1-5-2- بررسی عملکرد کبد…………………………………………………………………………………………………………………………………… 43

1-5-2-1- آنزیم های کبدی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-5-2-1-1- آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) …………………………………………………………………………………………….. 44

1-5-2-1-2- آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………………………………………. 45

1-5-2-1-3- آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………………………………………….. 46

1-5-2-2-بیلی­روبینBilirubin……………………………………………………………………………………………………………………………… 46

1-5-2-3- پروتئین تام Total Protein………………………………………………………………………………………………………………… 47

1-5-2-4- آلبومین Albumin ……………………………………………………………………………………………………………………………… 48

1-6- معرفی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

1-6-1- یونجه alfalfa…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

 

 

1-7- اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

فصل دوم: مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

2-1-مواد و روش ‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 59

2-1-1-مواد و وسایل مورد نیاز برای عصاره گیری……………………………………………………………………………………………….. 59

2-1-2- عصاره گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 60

2-2-محل و زمان اجرای طرح…………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

2– 3–موقعیت و ابعاد سالن……………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

2–4–آماده­ سازی سالن…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65

2-5- برنامه بهداشتی و واکسیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………. 66

2-6- اصول پرورش جوجه ها………………………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-7- صفات مورد بررسی در آزمایش2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………. 68

2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-7-2- فراسنجه ­های خونی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 69

2-7-3- آزمایشگاه و پارامتر ‏های خونی…………………………………………………………………………………………………………………. 72

2-8-  مدل آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

2-8-1- روش تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 73

2-8-2-  آنالیز آماری داده ­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 74

فصل سوم: نتایج……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 75

3-1- روش تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 76

3-1-1- مقایسه گروه­ها از حیث آنزیم­ های کبدی…………………………………………………………………………………………………. 77

3-1-1-1-آنزیم کبدی AST………………………………………………………………………………………………………………………………….. 80

3-1-1-2- آنزیم کبدی ALT………………………………………………………………………………………………………………………………… 81

3-1-1-3- آنزیم کبدی ALP………………………………………………………………………………………………………………………………… 83

3-1-2- مقایسه گروه ها از حیث سایر فاکتورها……………………………………………………………………………………………………… 85

3-1-2-1- مقایسه گروه­ها از نظر میزان پروتئین………………………………………………………………………………………………….. 90

3-1-2-2- مقایسه گروه­ها از نظر میزان آلبومین………………………………………………………………………………………………….. 91

3-1-2-3- مقایسه گروه­ها از نظر میزان بیلی­روبین………………………………………………………………………………………………. 92

3-1-2-4- مقایسه گروه­ها از نظر میزان تری­گلیسیرید………………………………………………………………………………………… 93

3-1-2-5- مقایسه گروه­ها از نظر میزان کلسترول………………………………………………………………………………………………… 94

3-1-2-6- مقایسه گروه­ها از نظر میزان وزن…………………………………………………………………………………………………………. 95

فصل چهارم: بحث و نتیجه ­گیری…………………………………………………………………………………………………………………………. 96

4-1- بررسی فایتوژنیک­های شناخته شده…………………………………………………………………………………………………………….. 97

4-2- استفاده از فایتوژنیک ها در جیره­ی غذایی طیور………………………………………………………………………………………… 98

4-3- سایر تحقیقات در زمینه­ استفاده از گیاهان دارویی در طیور…………………………………………………………………… 98

4-4- بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 100

4-5- نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 105

پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 108

فهرست منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 109

 

فهرست نمودارها

3-1- نمودار ستونی میزان AST در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 81

3-2- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه……………………………………………………………………………….. 82

3-3- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 84

3-4- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان پروتئین………………………………………………………………. 90

3-5- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان آلبومین………………………………………………………………. 91

3-6- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان بیلی­روبین…………………………………………………………… 92

3-7- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان تری­گلیسیرید……………………………………………………… 93

3-8- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان کلسترول…………………………………………………………….. 94

3-9- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث وزن………………………………………………………………………………… 95

فهرست جداول

1-1: تاکسونومی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

2- 1- گروه بندی تیمارها و غلظت مصرفی عصاره­ها…………………………………………………………………………………………….. 65

2- 2- برنامه واکسیناسیون جوجه­های گوشتی……………………………………………………………………………………………………… 66

2-3- روش آزمایش و کیت­های مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………….. 72

3-1: مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در سه متغیر وابسته(آنزیم های کبدی)…………. 78

3-2- تاثیرعصاره یونجه بر کاهش مسمومیت ………………………………………………………………………………………………………… 79

3-3- آزمون مقایسه­های زوجی دانت بین گروه­های آزمایشی و شاهدمسموم از نظر آنزیم کبدی AST………….. 80

3-4- آزمون مقایسه­ای زوجی دانت، بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALT…………. 82

3-5- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALP………………….. 83

3- 6- مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در شش متغیر وابسته…………………………………… 85

3-7- جدول تحلیل واریانس تاثیر کاربندی­های مختلف بر 6 متغیر وابسته………………………………………………………… 87

3-8- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر 6 متغیر وابسته………………………. 88

چکیده:

مقدمه: اکثر بیماری­های رایج در صنعت مرغداری کشورکه بطور همه­گیر جوجه­های گوشتی را مبتلا می­ کنند، عملکرد کبد را مختل می­نمایند. کبد به عنوان اندام تشخیصی بسیار مهمی در جوجه­های گوشتی مطرح است. از طرفی به دلیل تشدید متابولیسم در جوجه­های گوشتی به منظور افزایش تولید و راندمان، کبد به عنوان مرکز مهم درگیر در متابولیسم و واسطه­ مهم دستگاه گوارش و خون از اهمیت خاصی برخوردار است، بطوری­که هر گونه آسیب کبدی در جوجه­های گوشتی در نخستین گام روی تغذیه و نهایتاٌ راندمان تولید جوجه­ها تاثیر خواهد داشت.

روش بررسی: تعداد 120 قطعه جوجه یک‏روزه به‏طور تصادفی به دو گروه مسموم و غیر مسموم با سه تیمار برای هر گروه و 20 تکرار برای هر تیمار تقسیم شدند. تیمارها شامل: کنترل شاهد، یونجه1رقیق، یونجه2غلیظ؛ شاهد مسموم، یونجه1رقیق مسموم، یونجه2غلیظ مسموم می­باشد؛ که در پایان دوره پرورش، آنزیم‏های شاخص عملکرد کبد(AST,ALT,ALP) به همراه فاکتورهای خونی: پروتئین تام، آلبومین و بیلیروبین، کلسترول و تری­گلیسیرید سرم تعیین شدکه نتایج به شرح زیر می­باشد: از لحاظ آماری یونجه 1/0 ٪ برای آنزیم کبدی AST در سطح P<0/05 و آنزیم کبدی ALP در سطح01/0P< بطور معنی­دار کاهش نشان داد. آنزیم ALT کاهش معنی­داری نداشت. فاکتور بیلی­روبین در دوز 15/0 ٪ بطور معنی­داری در سطح P<0/05 افزایش نشان داد. فاکتور پروتئین تام نیز کاهش معنی­داری در سطح01/0P< داشت. فاکتور آلبومین تغییر معنی­داری نسبت به شاهد مسموم نشان نداد. فاکتور تری­گلیسیرید بطور معنی­داری درسطح01/0P< کاهش یافت. کلسترول به همراه متغیر وزن، افزایش معنی­داری در سطح01/0P< داشتند.

نتیجه گیری: عصاره الکلی یونجه در غلظت 1/0 درصد در شرایط مسمومیت اثر حافظتی بر کبد دارد و سبب کاهش آنزیم­ های کبدیASTوALTوALP در جوجه­های گوشتی می­گردد و در غلظت بالاتر ممکن است به­ دلیل افزایش بیلی­روبین و کاهش پروتئین تام، باعث تشدید مسمومیت گردد.

واژگان کلیدی: عصاره­یونجه، آنزیم‏های عملکردی کبد، فاکتورهای خونی، مسمومیت، طیور گوشتی.

فصل اول: مقدمه

 

1-کلیات

 

1-1-مقدمه

گوشت طیور یکی از منابع اصلی تامین کننده نیازهای پروتئین حیوانی در تغذیه­ جوامع انسانی بشمار می­رود و امروزه با پیشرفت­هایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را بخود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(39) در سالهای اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149) از جمله اقدامات انجام شده در این زمینه، مصرف آنتی­بیوتیک­ها و افزودنی­ها، جهت ضدعفونی و مکمل در تغذیه طیور می­باشد که علاوه بر اثر پیشگیرانه و درمانی، در دوز پایین در مراحل اولیه دوره رشد، باعث افزایش رشد نیز می­گردد(9).

طیور، کارآمدترین راه تبدیل محصولات فرعی و ضایعات کشاورزی به گوشت و تخم‏مرغ برای مصرف انسان می‏باشد. بنابراین پرورش طیور و افزایش تولیدات آنها یکی از مهم‏ترین و عملی‏ترین راه‏های تأمین پروتئین حیوانی در کشور ما است. پرورش طیور صنعتی توسعه یافته می‏باشد، به­ طوری­که قادر است غذای قابل مصرف بیشتر و با هزینه­ کمتر، برای جمعیت کشور فراهم سازد(39).کشور ایران هفتمین کشور تولیدکننده مرغ جهان با تولید 2 میلیون تن مرغ آماده طبخ در سال1392 بوده است(19). استان فارس چهارمین استان تولیدکننده مرغ گوشتی با سهم 5/7 درصدی به­شمار می‏آید و پیش بینی می­ شود به استان دوم کشور در سال 1393 تبدیل شود(5). گوشت مرغ مهم‏ترین منبع تأمین کننده پروتئین حیوانی مردم کشور با مصرف سرانه 25 کیلوگرم در سال، محسوب می­ شود(5). سند امنیت غذایی کشور و چشم‏انداز توسعه صنعت مرغداری کشور، نشان­دهنده افزایش تولید و مصرف این محصول در سال‏های آتی است(34). با پیشرفتهایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را به­خود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(38). در سال­های اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149). امروزه از مواد افزودنی خوراکی ضد­میکروبی، بطور گسترده در پرورش حیوانات مزرعه­ای، برای افزایش بهره­وری و فراهم نمودن شرایط اکولوژیکی مناسب سیستم گوارشی به­منظور افزایش سرعت رشد، کاهش ریسک در برابر خطر بیماری­ها، استفاده می­ شود(209). افزایش توجه به توسعه مقاومت آنتی­بیوتیکی در باکتری­ ها و احتمال وجود بقایای آنتی­بیوتیکی در فرآورده ­های طیور و همچنین ایجاد سمیت کبدی ناشی از مصرف آنتی­بیوتیک­ها در دوز بالا، تلاش محققان برای یافتن راه­های دیگری غیر از استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در جیره­ی غذایی طیور را سبب شده است(51).

با توجه به مشکلات استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در تغذیه جوجه­های گوشتی، نظر محققان به سمت مواد افزودنی دیگری به عنوان جانشین آنتی­بیوتیک­ها در غذای طیور معطوف شد، که این مواد افزودنی باعث سلامتی و بهبود میکرو فلور دستگاه گوارش طیور شوند(102).

از این رو محققین، ترکیبات گیاهی مختلفی را به عنوان جایگزین آنتی­بیوتیک­ها در مواد تولیدی حیوانی مورد مطالعه قرار داده­اند؛ که باعث بهبود سیستم ایمنی و عملکرد ارگان­های مهم بدن مانند کبد شده و نهایتاٌ سبب افزایش در عملکرد تولیدی آنها نیز شده است(149). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها از جمله­ این افزودنی­های طبیعی هستند که می­توان از آنها به عنوان آنتی­بیوتیک­های طبیعی استفاده کرد(11) گیاهان دارویی به عنوان افزودنی­های خوراکی طبیعی؛ اخیراً در جیره غذایی طیور جهت بهبود عملکرد و افزایش پاسخ­های ایمنی پرندگان به جای آنتی بیوتیک­ها مطرح شده است(69و71).

تمایل به استفاده از گیاهان دارویی در تغذیه دام و طیور را می­توان به صورت افزایش معنی­دار مقالات علمی چاپ شده از سال 2000 به بعد مشاهده کرد(175). عامل اصلی این رخداد، شروع ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در اتحادیه اروپا از سال 1999 و قطع کامل آن در سال 2006 بوده است(163). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها، یکی از جایگزین­های مطرح آنتی­بیوتیک­ها هستند که در سال­های اخیر به خاطر ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها، مورد توجه قرار گرفته­اند(188).

گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها به دلیل عواملی چون؛ ارزش بالای اقتصادی و کم­هزینه بودن تولید آنها، نداشتن اثرات تخریبی بر محیط زیست، ارگانیک بودن این داروها، کم بودن عوارض جانبی در مقایسه با داروهای شیمیایی،

 

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

چکیده ………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول : مقدمات وکلیات تحقیق…………………………………………………………………………… 2

1-1 بافت شناسی تخمدان……………………………………………………………………………………… 2

1-2 تعریف استرس……………………………………………………………………………………………… 5

1-3 استرس و گلوکوکورتیکوئید ها………………………………………………………………………….. 5

1-4 استرس های دوران بارداری……………………………………………………………………………… 6

1-5 انواع استرس………………………………………………………………………………………………… 7

1-6 علائم استرس……………………………………………………………………………………………….. 7

1-7 اثرات استرس……………………………………………………………………………………………….. 8

1-7-1 اثر استرس بر روی تخمدان………………………………………………………………………….. 8

1-8 استرس اکسیداتیو………………………………………………………………………………………… 10

1-8-1 ارتباط بین استرس اکسیداتیو و عملکرد تخمدان……………………………………………… 13

1-9 تعریف پروپولیس……………………………………………………………………………………….. 15

1-9-1 ترکیبات پروپولیس………………………………………………………………………………….. 16

1-9-2 تاثیر بره موم بر روی اینترفرون ها……………………………………………………………….. 18

1-9-3 مصارف بره موم………………………………………………………………………………………. 18

1-10 ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………… 19

1-10-1 اهداف………………………………………………………………………………………………… 20

1-10-2 فرضیات ……………………………………………………………………………………………. 21

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده…………………………………………………………………. 23

فصل سوم: مواد و روش ها…………………………………………………………………………………… 28

3-1 تهیه و تزریق عصاره پروپولیس به حیواانات……………………………………………………….. 28

3-1-1 تهیه عصاره آبی – الکلی پروپولیس……………………………………………………………… 28

3-2 حیوانات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………… 31

3-2-1 گرو های مورد مطالعه در این طرح……………………………………………………………… 31

3-3 نمونه گیری………………………………………………………………………………………………… 32

3-4 روش سنجش هورمونی………………………………………………………………………………… 33

3-5 روش بافت شناسی و شمارش فولیکول ها………………………………………………………… 34

3-5-1 روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین……………………………………………………… 34

3-5-2 روش رنگ آمیزیPAS…………………………………………………………………………….. 36

3-6 روش ارزیابی آپوپتوز(مرگ برنامه ریزی شده سلول)……………………………………………. 37

3-6-1 روش کار …………………………………………………………………………………………….. 38

3-6-2 نتیجه رنگ آمیزی تانل……………………………………………………………………………… 39

فصل چهارم: نتایج………………………………………………………………………………………………. 41

4-1 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر وزن بدن و وزن تخمدان نوزادان…………. 41

4-2 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر سطح سرمی کورتیکوسترون……………….. 42

4-3 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر سطح سرمی 17بتا- استرادیول……………. 43

4-4 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد و قطر اووسیت و تعداد انواع
فولیکولهای تخمدانی نوزادان…………………………………………………………………………………. 44

4-5 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد فولیکولهای آترتیک تخمدان ………. 45

4-6 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر قطر اووسیت………………………………….. 46

 

4-7 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد اووسیت………………………………… 47

4-8 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس بر تعداد سلولهای گرانولوزای تانل مثبت ….. 54

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری …………………………………………………………………………… 61

5-1 بحث……………………………………………………………………………………………………….. 61

5-1-1 یافته‎های اصلی تحقیق………………………………………………………………………………. 61

5-1-2 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر وزن بدن و وزن تخمدان
موشهای صحرایی……………………………………………………………………………………………….. 62

5-1-3 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر سطح 17- بتا استرادیول…….. 64

5-1-4 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر تعداد انواع فولیکولهای
تخمدانی و فرایند آترزی فولیکولی…………………………………………………………………………. 65

5-1-5 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر تعداد و قطر اووسیت………… 66

5-1-6 اثر استرس مزمن دوران نوزادی و عصاره پروپولیس بر فرایند مرگ برنامه ریزی شده
(آپوپتوزیس) سلولهای گرانولوزا……………………………………………………………………………. 67

5-2 نتیجه گیری ………………………………………………………………………………………………. 69

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………… 70

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………. 71

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………….. 78

فهرست جدول ها

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

جدول 4-1 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر وزن بدن حیوان……………… 41

جدول4-2 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر تعداد و قطر اووسیت……….. 45

جدول 4-3 اثر استرس پس از تولد و عصاره پروپولیس ایرانی بر میانگین تعداد فولیکول ها…. 46

فهرست نمودار ها

عنوان…………………………………………………………………………………………………………… صفحه

نمودار 4-1 اثر پروپولیس بر سطح سرمی کورتیکوسترون(نانوگرم/میلی لیتر) نوزادان موش های
صحرایی تحت استرس دوری از مادر…………………………………………………………………….. 42

نمودار 4-2 اثر پروپولیس بر سطح سرمی 17بتا- استرادیول(نانوگرم/میلی لیتر) نوزادان موش های
صحرایی تحت استرس دوری از مادر……………………………………………………………………… 43

نمودار 4-3 اثر پروپولیس بر قطر اووسیت (میکرومتر) نوزادان موش های صحرایی
تحت استرس دوری از مادر………………………………………………………………………………….. 46

نمودار 4-4 اثر پروپولیس بر تعداد اووسیت(در 022/0 میلیمتر مربع سطح تخمدان) نوزادان
موش های صحرایی تحت استرس دوری از مادر……………………………………………………….. 47

نمودار 4-5 اثر پروپولیس بر تعداد سلولهای گرانولوزای تانل مثبت تخمدان نوزادان
موش های صحرایی تحت استرس دوری از مادر………………………………………………………. 54

فهرست شکل ها

عنوان ………………………………………………………………………………………………………….. صفحه

شکل1-1 بافت های تخمدانی…………………………………………………………………………………. 4

شکل1-2 انواع فولیکول ها در مقطع تخمدان، بزرگنمایی ×٤۰…………………………………………. 4

شکل3-1 پروپولیس…………………………………………………………………………………………… 30

شکل3-2 تزریق پروپولیس…………………………………………………………………………………… 32

شکل3-3نمونه گیری از بافت تخمدان…………………………………………………………………….. 33

شکل3-4 خون گیری از ناحیه قلب………………………………………………………………………… 34

شکل4-1 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه سالم………………………………………………. 49

شکل4-2 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه سالم………………………………………………. 50

شکل 4-3 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 50……………………… 51

شکل 4-4 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 100……………………. 52

شکل 4-5 تصویر تخمدان موش صحرایی در گروه استرس+پروپولیس 200……………………. 53

شکل 4-6 گروه سالم با رنگ آمیزی TUNEL  ………………………………………………………… 56

شکل 4-7 گروه استرس با رنگ آمیزی TUNEL  …………………………………………………….. 57

شکل 4-8 گروه استرس + پروپولیس 50 با رنگ آمیزی TUNEL  ………………………………. 58

شکل 4-9 گروه استرس + پروپولیس100 با رنگ آمیزی TUNEL  ……………………………… 59

شکل 4-10 گروه استرس + پروپولیس200 با رنگ آمیزی TUNEL  ……………………………. 60

 

چکیده فارسی

سابقه و هدف: هدف از این تحقیق بررسی اثر عصاره آبی – الکلی پروپولیس بر تغییرات ساختاری
و تکاملی تخمدان موش صحرائی به دنبال استرس دوران نوزادی می باشد.

روش بررسی: تعداد 48 سر موش صحرایی ماده با سن 15 روز و میانگین وزنی 20-15 گرم تهیه و به طور تصادفی به شش گروه هشت تایی تقسیم شدند. کلیه آزمایش ها از روز 15 بعد از تولد شروع و در روز 21 بعد از تولد پایان یافتند. گروه اول (کنترل منفی) شامل نوزادان 21 روزه بدون هرگونه مداخله، گروه دوم (کنترل مثبت) شامل نوزادانی که در طی دوره کنار مادرشان بودند و به صورت روزانه 1/0 میلی لیتر محلول سالین دریافت کردند، گروه سوم (گروه استرس) شامل موش هایی که روزانه شش ساعت در طی دوره
از مادرشان جدا شدند، گروه چهارم، پنجم و ششم شامل موش هایی هستند که علاوه براسترس دوری
از مادر روزانه به ترتیب به میزان mg/kg 50 ،100و 200 عصاره پروپولیس دریافت کرده اند. 24 ساعت بعد از آخرین تزریق تحت بیهوشی عمیق، خون گیری برای اندازه گیری سطح کورتیکوسترون و 17 -بتااسترادیول انجام شد و سپس تخمدانها خارج شده و بعد از ثابت سازی و آماده سازی، برشهای تهیه شده با روش های H&E، PAS و Tunel رنگ آمیزی شدند. مقاطع با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مجهز به نرم افزار آنالیز تصاویر بافتی، فولیکولها سالم و اترتیک، اووسیت و سلولهای گرانولوزا  هیستومورفومتری شدند.

یافته ها: استرس دوری از مادر باعث افزایش سطح کورتیکوسترون و کاهش سطح 17- بتا استرادیول سرم خون نوزادان گردید. استفاده از عصاره آبی– الکلی پروپولیس باعث کاهش سطح کورتیکواسترون و افزایش 17- بتا استرادیول سرم خون نوزادان به دنبال استرس شد. همچنین عصاره پروپولیس از کاهش تعداد انواع فولیکول های تخمدان و اووسیت، کاهش قطر اووسیت و افزایش تعداد فولیکول های آترتیک و سلولهای گرانولوزای آپوپتوتیک تخمدان به دنبال استرس جلوگیری کرد.

نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که عصاره آبی– الکلی پروپولیس ایرانی بطور قابل ملاحظه ای از تغییرات ساختاری و تکاملی تخمدان نوزادان موش صحرائی به دنبال استرس جلوگیری می کند. این اثر احتمالاً ناشی از وجود ترکیباتی مثل پلی فنلها و فلاونوئیدها در پروپولیس با توان آنتی اکسیدانی بالا می باشد.

واژگان کلیدی: پروپولیس، استرس دوران نوزادی، تخمدان، کورتیکواسترون، 17- بتا استرادیول.

فصل اول: مقدمات و کلیات تحقیق

1-1. بافت شناسی تخمدان

هر تخمدان توسط اپی تلیوم ساده مکعبی به نام اپی تلیوم زایا که امتدادی از مزوتلیوم بر روی کپسولی از جنس بافت همبند متراکم (تونیکا آلبوژینه) است دربر گرفته شده است. بیشترین بخش تخمدان را منطقه قشری آن تشکیل می دهد که یک بافت همبند پرسلول است  و فولیکولهای تخمدانی فراوانی دارد. داخلی ترین قسمت تخمدان منطقه مرکزی آن است که از بافت همبند سست و رگهای خونی که از طریق مزانتر آویزان کننده تخمدان به آن وارد شده اند ، تشکیل شده است (شکل 1-1). بین منطقه قشری و مرکزی مرز مشخصی وجود ندارد.

هر فولیکول تخمدان از یک اووسیت که با یک یا چند لایه سلولهای اپی تلیالی احاطه
شده اند، تشکیل می شود. در انسان فولیکول هایی که در زمان زندگی رویانی تشکیل شده اند، فولیکول بدوی نامیده می شوند که شامل یک اووسیت اولیه همراه با یک لایه سلول فولیکولی پهن است. این فولیکولها در نواحی سطحی منطقه قشری تخمدان دیده می شوند. اووسیت درون فولیکول بدوی سلول کروی شکلی است که در حدود ۲۵ میکرومتر قطر دارد (مسشر، جان کوئیرا[6] 2013). در جوندگانی مثل موش صحرایی (موش سفید بزرگ آزمایشگاهی، رت)

فهرست مطالب

عنوان           صفحه

چکیده 1

مقدمه. 2

فصل اول: کلیات

1-1-معرفی گیاه آرتیشو یا کنگر فرنگی.. 4

1-1-1- تاریخچه. 5

1-1-2- گیاه شناسی.. 5

1-1-2-1- نام های مختلف گیاه آرتیشو. 5

1-1-2-2- انواع واریته های موجود کنگر فرنگی.. 7

1-1-2-3- اندام دارویی.. 8

1-1-2-4- مواد موجود در گیاه کنگر فرنگی.. 8

1-1-2-5- فلاونوئیدهای موجود در کنگر فرنگی.. 9

1-1-2-5-1- خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها 10

1-1-2-5-2- فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند 11

1-1-2-6-آثار فارماکولوژیکی گیاه آرتیشو یا کنگر فرنگی.. 12

1-1-2-7- عوارض جانبی گیاه کنگر فرنگی.. 12

1-1-2-8- دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان. 13

1-1-2-9- اعمال مهم آنتی اکسیدان ها 13

1-1-2-10-رادیکال های آزاد 14

1-1-2-10-1- استرس اکسیداتیو. 14

1-2- استامینوفن. 15

1-2-1- تاریخچه کشف استامینوفن. 15

1-2-2- کاربرد های استامینوفن. 17

1-2-3- نام آیوپاک… 18

1-2-4- اشکال دارویی استامینوفن. 18

1-2-5- مکانیسم اثر استامینوفن. 18

1-2-7- عوارض جانبی استامینوفن. 19

1-3- کبد 19

1-3-1- کبد و سم زدایی.. 20

1-3-2- نقش كبد در دفع. 21

1-3-3- آمینو ترانسفراز ها 21

1-3-3-1- چه داروهایی باعث ایجاد سطح غیرطبیعی آمینوترانسفرازها می گردند 23

1-3-3-2- سایر آنزیم های کبدی چگونه هستند 24

1-3-3-3- موارد سطح غیر طبیعی آنزیم های کبدی چه هستند 24

1-3-4- بیماری های کبد 26

1-3-4-1- نکروز کبدی ماسیو و مفرط.. 26

1-3-4-2- بیماری کبدی القا شده توسط دارو و توکسین. 27

1-5- پیشینه تحقیق.. 28

فصل دوم: روش تحقیق

2-1- مواد و و وسایل و تركیبات شیمیائی مصرفی.. 34

2-2- دستگاه ها، لوازم و تجهیزات غیر مصرفی.. 37

2-3- روشها و مراحل اجرای آزمایش… 38

2-3-1- نحوه انتخاب و شرایط نگهداری حیوانات مورد آزمایش… 38

 

 

2-3-2-گروه بندی حیوانات مورد آزمایش… 39

2-3-3- چگونگی تهیه و تجویز عصاره هیدروالکلی گیاه آرتیشو. 40

2-3-4- طریقه گاواژ كردن حیوان. 41

2-3-5- القاء مسمومیت توسط استامینوفن در موش های صحرایی.. 42

2-3-6- خون گیری.. 43

2-3-7- روش تهیه ی سرم 44

2-3-8- تست های آزمایشگاهی بر روی نمونه های سرم خون. 44

2-3-8-1- اندازه گیری آنزیم های آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) و آسپارتات آمینو ترانسفراز(AST) 44

2-3-9- روش های تجزیه وتحلیل و محاسبه آماری.. 45

فصل سوم: نتایج

3-1- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) در  گروه های مورد بررسی  47

3-2- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) در گروه های مورد بررسی  55

3-3- مقایسه نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) در گروه های مورد بررسی  63

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری.. 80

پیشنهادها 80

منابع و مآخذ

منابع فارسی.. 82

منابع انگلیسی.. 84

ABSTRACT.. 93

فهرست جداول

جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 48

جدول 3-2 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 49

جدول 3-3 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز ALT)…51

جدول 3-4 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 53

جدول 3-5 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 55

جدول 3-6 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 57

جدول 3-7 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 59

جدول 3-8 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 61

جدول 3-9 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 63

جدول 3-10 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 65

جدول 3-11 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 67

جدول 3-12مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 69

فهرست نمودار ها

نمودار3-1- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 48

نمودار 3-2- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 50

نمودار 3-3- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 52

نمودار3-4- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) 54

نمودار 3-5- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 56

نمودار 3-6- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 58

نمودار 3-7- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 60

نمودار 3-8- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) 62

نمودار 3-9- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 64

نمودار 3-10- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 66

نمودار 3-11- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 68

نمودار 3-12 مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) 70

فهرست شکل‌ها

شکل (1-1) گیاه آرتیشو(کنگر فرنگی) 7

شکل (1-2) ساختار شیمیایی پاراستامول. 18

شکل (2-1)محل نگهداری حیوانات… 38

شکل (2-2) روش وزن کردن رت ها 40

شکل (2-3) دستگاه روتاری. 41

شکل (2-4) روش تجویز دارو به صورت گاواژ. 42

شکل (2-5) نحوه خون گیری مستقیم از قلب موش های صحرایی. 43

شکل (2-6) سانتریفیوژ. …44

چکیده

استامینوفن یک داروی متداول ضد درد و تب است که در دوزهای بالا منجر به نکروز کبدی و کلیوی در انسان و حیوان می گردد. آرتیشو گیاهی  با ترکیبات فلاونوئیدی، آلکالوئیدی و خواص آنتی اکسیدانی است. در تحقیق حاضر اثر محافظت کبدی عصاره هیدروالکلی گیاه آرتیشو در مسمومیت حاد کبدی ناشی از استامینوفن مورد بررسی قرار گرفته است.

48 سر موش صحرایی نر از نژاد ویستار به طور تصادفی در 6 گروه تقسیم شدند شامل: کنترل، گروه دریافت کننده استامینوفن(mg/kg 700)، گروه های دریافت کننده استامینوفن(mg/kg 700)+عصاره آرتیشو با دوز(600,800,1000mg/kg)، و گروه دریافت کننده آرتیشو با دوز (mg/kg 1000). دارو و عصاره به شکل دهانی تجویز گردیدند. بعد از 24 ساعت نمونه گیری انجام شد و با روش کالریمتریک میزان آنزیم های ALT وAST وALP سنجیده شد. در پایان داده ها با نرم افزار spss  ویرایش 18 و تست آماری توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج نشان دهنده افزایش معنی دار آنزیم های ALT،AST و ALP (p≤0.001)در گروه دریافت کننده استامینوفن می باشد. به طوری که این پارامترها در گروه های دریافت کننده عصاره کاهش یافت.

نتیجه گیری: مصرف آرتیشو می تواند اثرات سمی استامینوفن را بر آنزیم های کبدی کاهش دهد.

کلمات کلیدی: استامینوفن، آرتیشو، کبد، موش صحرایی

مقدمه

نارسایی حاد کبد در اثر عوامل متعددی از جمله هپاتیت های ویروسی، آسیب های توکسیک ناشی از سموم و داروها و همچنین ایسکمی ایجاد می شود. کبد اولین سد دفاعی بدن را در برابر آسیب ناشی از مواد بیولوژیک برون زاد تشکیل می دهد که خود ممکن است به نکروز سلول های کبدی بیانجامد. در آسیب های توکسیک کبد، استرس های اکسیداتیو نقشی اساسی را بر عهده دارند.

كبد مكان استراتژیک وصول مواد غذایی جذب شده و همچنین مولكول های جذب شده مضر، داروها و سم باكتری ها می باشد (65). به طور کلی کبد اعمال حیاتی مهمی همچون سم زدایی، سوخت و ساز کربوهیدرات ها، ترشح صفرا، سنتز فیبرینوژن و پروترومبین پلاسما، تنظیم گلوکز و چربی خون و… را به عهده دارد و مخزن موادی مثل گلوکز(به صورت گلیکوژن)، چربی، ویتامین ها و آهن می باشد.

همان طور که عنوان شد یکی از مهم ترین اعمال كبد علاوه بر سوخت و ساز مواد مختلف، سم زدایی مواد آلوده كننده محیطی و داروهای شیمیایی می باشد. در اكثر موارد در طی عمل سم زدایی، فعال سازی متابولیكی توسط آنزیم های سیتوكروم P450  میكروزوم های كبدی باعث ایجاد متابولیت های سمی و فعال می‌شود كه این می تواند موجب آسیب بافت های مختلف از جمله كبد شود. تیواستامید، تتراكلریدكربن، اتانول و استامینوفن از جمله موادی هستند