فهرست مطالب

چکیده—————– 1

فصل اول

مقدمه—————– 2

فصل دوم

بررسی و مرور منابع— 5

2-1- تاریخچه زنبور عسل و پرورش آن در جهان و ایران———– 6

2-2- ارزش اقتصادی زنبور عسل—– 8

2-3- جایگاه سیستماتیک زنبور عسل-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 9

2-4- اصلاح نژاد در زنبور عسل—– 10

2-5- ژنوم زنبور عسل————— 12

2-6- تعریف نشانگر—————– 13

2-6-1- نشانگرهای مرفولوژیک—- 13

2-6-1-1- نشانگرهای مرفولوژیک و زنبور عسل-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 14

2-6-2- نشانگرهای مولکولی——- 16

2-7- نشانگرهای مولکولی و حشرات-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 17

2-8- کاربرد اصلی نشانگرهای مولکولی در مطالعات اکولوژیکی حشرات———- 18

2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبان-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 19

2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 21

2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها—– 22

2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئید-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 23

2-8-5- سیستماتیک مولکولی—– 24

2-8-6- حشرات تراریخته———- 25

2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده———— 26

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری— 30

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 31

2-11-1- نمونه DNA————— 32

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 32

2-11-3- روش کشف————— 33

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR—- 34

2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکی—- 34

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 34

2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکی——– 34

2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)———- 35

2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 35

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————— 36

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 37

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 38

فصل سوم

مواد و روش‌ها——– 40

3-1- جمع آوری نمونه‌ها———— 41

3-2- استخراج DNA زنبور عسل— 43

3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 45

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 45

3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 46

3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت  ng/µl25—— 47

3-4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 47

3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 49

3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR———— 50

3-7- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل————- 51

3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه‌های ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 54

3-9- روش های گروهبندی داده ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 55

 

 

3-10- تجزیه خوشه ای————- 56

3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک———– 56

3-12- تجزیه به مولفه های اصلی— 57

3-13- آنالیز داده‌های مولکولی—– 58

3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی—- 58

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی——– 60

3-16- آنالیز داده‌های مورفولوژیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 61

فصل چهارم

نتایج—————– 62

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——– 63

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایرانبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 63

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران—————- 64

4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—— 65

4-5- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مرفومتریکبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 66

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—— 67

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه– 72

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل—————- 72

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—— 73

4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—- 74

4-11- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مولكولی– 74

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسلبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 76

4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل در زنبورهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 77

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک————— 78

فصل پنجم

بحث و نتیجه‌گیری— 79

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 81

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه————- 87

پیشنهادات:———- 90

منابع—————– 91

فهرست جداول

جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

جدول 3-2 مواد واكنش، ‌حجم و غلظت نهایی اجزای واكنش زنجیره پلیمراز 48

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده 59

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل- 65

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی  و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه- 72

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل  بر اساس نشانگر ISSR- 74

جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

فهرست اشکال

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل- 41

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل- 42

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات– 43

شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات– 44

شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد- 46

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA- 47

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجیره‌ای پلیمراز 49

شکل 3-8: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات– 49

شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات– 50

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز 50

شکل 3-11: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR- 51

شکل 3-12: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز- 51

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده 60

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr   66

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با بهره گرفتن از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی- 67

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1  با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 69

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 70

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 70

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 71

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 71

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73

شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده 73

شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-12: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل 77

شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی- 78

فهرست معادلات

معادله 3-1: محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-2: میزان چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-3: ارزشمندی باندها 53

معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-5: میانگین قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر- 53

معادله 3-7: شاخص نشانگری- 54

معادله 3-8: ضریب تشابه جاکارد- 55

 

چکیده

نشانگر مولکولی ISSR به منظور جداسازی نژادهای زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهای كارگر با بهره گرفتن از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیق سازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد نمره‌دهی و آنالیز صورت گرفت. نتایج نشان داد که باندهای آغازگرهای مورد مطالعه شده

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

فصل اول مقدمه

میکروبیولوژی هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………………………..1

مطالعات ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………………………2

جهش در ژنهای کد کننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول……….4

نقشه ژنتیکی………………………………………………………………………………………………………………………5

تولید مثل واسپورزایی………………………………………………………………………………………………………….6

اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………………………………6

پروموتورهای مورد استفاده در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11………………………………………..7

HARS1…………………………………………………………………………………………………………………………..8

بیان همزمان……………………………………………………………………………………………………………………….9

ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال……………………………………………………………………..10

تولید واکسن نوترکیب……………………………………………………………………………………………………….10

مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی………………………………………………………………………..11

ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBS………………………………………………………11

تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی………………………………………………………………………………….11

انتقال وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………12

جداسازی سویه های نوترکیب…………………………………………………………………………………………….12

تنظیم متابولیسم متانول……………………………………………………………………………………………………….12

فاکتور محرک رشد کلنی (G-CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

 

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با بهره گرفتن از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی  pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

 

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

 

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR  اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR  اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست

فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66

پیوست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………75

 

مقدمه

تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده  با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.

هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.

مواد و روش ها

cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده  مربوط به هانسونلا پلی مورفا  که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.

نتایج

ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با بهره گرفتن از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.

بحث

پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.

کلید واژه ها

هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک

فصل اول : مقدمه

در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:

1. رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
2. تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
3. تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.

1-1میکروبیولوژی هانسونلا

این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.

سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.

تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha

هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

چکیده

فصل اول : کلیات

1-1مقدمه…………… 2

1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق…….5

1-2-1 آنزیم ها 5

آنزیم ها واهمیت آن. 6

1-2-3 منابع آنزیمی.. 7

1-2-3-1 میکروارگانیزم ها به عنوان عمده ترین منابع آنزیمی.. 7

1-2-3-2 موقعیت تاکسونومیک تولید کننده های شناخته شده آنزیمی.. 8

1-2-3-3 میکروارگانیسم هایGRAS.. 8

به عنوان منابع میکروارگانیسم ها 9

1-2- 5 بازار جهانی آنزیم. 10

1-2-6 پروتئازها 11

1-2-6-1 اعمال پروتئازها. 12

1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها. 17

1-2-7 کاربرد پروتئازها 22

1-2-7-1 صنعت شوینده. 22

1-2-7-2 صنعت چرم. 23

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

نوترکیب و اهمیت آن. 29

1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن. 30

1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن) 31

.. 32

-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب.. 34

هدف از انجام پروژه 36

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

فصل سوم: روش شناسی

3-1مواد شیمیایی.. 42

3-2 میكروارگانیسم ها ومحیط های كشت مورد استفاده 43

3-2-1 میكروارگانیسم ها و پلاسمیدها. 43

3-2-2محیط های كشت میكروبی.. 44

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

العات اولیه آنزیم شناسی.. 46

3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-3 دمای بهینه. 47

3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیكی آنزیم.. 47

3-5 جداسازی باکتری.. 48

 

 

3-5-1 استخراج  DNAژنومی.. 48

3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR… 48

 3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A  . 50

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

3-6 روش های الکتروفورزی.. 53

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

نوتركیب.. 54

3-7-1 ساختار ناقل كلونینگ…. 54

3-7-2 آماده سازی قطعهDNA  برای انتقال به درون وكتور. 55

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل.. 56

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

3-7-5 مستعدکردن باکتری  DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α . 59

3-8 بافرCracking. 60

3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب… 62

3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با بهره گرفتن از روش الکتروفورز. 63

3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب.. 66

نیاز تخلیص پروتئین نوترکیب… 66

3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب… 67

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

4-1 جداسازی باکتری.. 70

DNAژنومی.. 70

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+) 71

4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب.. 75

4-6 منحنی استاندارد. 77

روی فعالیت آنزیم. 77

4-8 دمای بهینه آنزیم. 78

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

5-2 پیشنهادات.. 88

 منابع و مأخذ. 89

فهرست منابع انگلیسی….89

فهرست جداول

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با بهره گرفتن از NCBI…………………………………………………………..71

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74

شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75

شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77

نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78

نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79

نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80

فصل اول

 

کلیات

 

مقدمه

پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قلیایی شدن بیش از حد خون می باشد بطوریكه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای

چکیده

هدف اصلی این پژوهش ارزیابی کمّی و کیفی بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران در اولویت­های علم و فناوری منتخب از نقشه جامع علمی کشور شامل فناوری­های نانو، زیست و انرژی هسته­ای با بهره گرفتن از داده ­های بخش­های نمایه استنادی گسترش یافته علوم و همایش­های علوم پایگاه وب آو ساینس در طی سال­های 2002 تا 2011 در مقایسه با کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404 بوده است. همچنین بررسی کمّی و کیفی میزان همکاری­های بین ­المللی ایران، دانشگاه­ها و نویسندگان برتر ایرانی و وضعیت مجلات علمی بین ­المللی که به چاپ تولیدات علمی ایرانیان پرداخته­اند، از دیگر اهداف این پایان نامه می­باشد. این پژوهش از نوع مطالعات علم­سنجی است که با بهره گرفتن از روش تحلیل استنادی انجام می­گیرد. از روش تطبیقی و هم­چنین نرم­افزارهای SPSSو Excel برای تجزیه تحلیل اطلاعات استفاده شده است. بروندادهای علمی ایران در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی در طی ده سال مذکور رشد صعودی داشته است؛ به طوری که نرخ رشد متوسط تولیدات علمی ایران در حوزه های اولویت­دار فناوری نانو 57 درصد، زیست فناوری 29 درصد و در انرژی هسته­ای 42 درصد می­باشد. در رتبه ­بندی بر اساس تعداد تولیدات علمی در زمینه فناوری نانو، کشور ایران در بین 136 کشور جهان، با تعداد 2325 تولیدات علمی حدود 26/1 درصد از کل تولیدات علمی جهان در این زمینه را دارا می­باشد و رتبه نوزدهم را دارد. در زیست فناوری در بین 186 کشور جهان، در رتبه 25 و با تعداد تولیدات 2162 در حدود 9/0 تولیدات کل جهان را دارا است. در انرژی هسته­ای هم از بین 137 کشور جهان، ایران با تعداد 933 تولیدات و حدود 79/0 درصد از کل تولیدات جهان، در رتبه 29 می­باشد. بیشترین همکاری علمی بین ­المللی کشور ایران در هر سه اولویت علم و فناوری منتخب با کشور آمریکا می­باشد و میانگین ضریب همکاری گروهی بین نویسندگان ایرانی در حوزه زیست فناوری با 66/0 بیشتر از دو حوزه دیگر و در حوزه انرژی هسته­ای با 64/0 بیشتر از حوزه فناوری نانو با 59/0 می­باشد. مطالعه ارتباط بین تعداد انتشارات و تعداد استنادات، تعداد انتشارات و شاخص اچ، تعداد نویسندگان و تعداد استنادات، و تعداد کشورهای همکار در تولید بروندادهای علمی و استنادات در کشورهای رقیب مورد بررسی، وجود رابطه مستقیم و معناداری را نشان می­دهد. بین تعداد استنادات دریافتی در سه حوزه اولویت­دار مورد بررسی هم تفاوت معناداری وجود دارد.

کلیدواژه‌ها: ارزیابی بروندادهای علمی، ایران، اولویت­های علم و فناوری، نقشه جامع علمی کشور، همکاری علمی بین­المللی، شاخص ­های ارزیابی مجلات

 فهرست مطالب

عنوان……….. صفحه

چکیده أ‌

فهرست جدول‌ها ص‌

فهرست شکل­ها ک‌

فصل اول: کلیات پژوهش… 1

1-1. مقدمه. 2

1-2. بیان مسأله. 4

1-3. اهداف پژوهش… 6

1-3-1. هدف کلی.. 6

1-3-2. اهداف فرعی.. 7

1-4. اهمیت موضوع پژوهش… 10

1-4-1. اهمیت و ضرورت نظری پژوهش: 10

1-4-2. اهمیت کاربردی پژوهش: 11

1-5. سؤالات پژوهش… 11

1-5-1. سؤال اصلی پژوهش… 11

1-5-2. سؤالات فرعی پژوهش… 12

1-6. تعاریف متغیرهای پژوهش… 15

1-6-1. تعاریف نظری اجزای مسأله. 15

1-6-1-1. بروندادهای علمی.. 15

1-6-1-2. اولویت­های علم و فناوری نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 15

1-6-1-3. همکاری علمی.. 16

1-6-2. تعاریف عملیاتی اجزای مسأله. 16

1-6-2-1. بروندادهای علمی.. 16

1-6-2-2. اولویت­های علم و فناوری منتخب(فناوریهای نانو، زیست و انرژی هسته­ای) 16

1-6-2-3. همکاری علمی.. 17

1-7. جمع­بندی.. 17

فصل دوم. 18

مبانی نظری و پیشینه پژوهش… 18

2-1. مقدمه. 19

2-2.علم­سنجی و ارزیابی بروندادهای علمی.. 20

2-2-1. تعریف علم­سنجی.. 20

2-2-2. تاریخچه پیدایش علم­سنجی.. 22

2-2-3. تعریف کتابسنجی.. 24

2-2-4. ارتباط علم­سنجی با کتاب­سنجی.. 25

2-2-5. استناد. 26

2-2-6. کاربرد تحلیل استنادی.. 27

2-3. شاخص ­های ارزیابی بروندادهای علمی.. 31

2-3-1. تاریخچه پیدایش شاخص ­های ارزیابی.. 31

2-3-2. اهمیت انجام مقایسه و نرمالسازی با رویکرد علم سنجی.. 35

2-4. تحلیل بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 38

2-4-1. موانع توسعه علم و فناوری در کشور جمهوری اسلامی ایران. 40

2-5. اهمیت ارزیابی پژوهشگران و مؤسسات پژوهشی.. 41

2-5-1. شاخص ­های بهنجار شده موجود برای ارزیابی دانشمندان و مؤسسات پژوهشی.. 43

2-5-1-1. شاخص اچ.. 43

2-5-1-2. شاخص جی.. 45

2-5-1-3. شاخص اچ جی.. 46

2-5-1-4. شاخص پی.. 46

2-6. اهمیت مجلات… 46

2-6-1. شاخص ­های ارزیابی مجلات… 47

2-6-1-2. ایجاد طرح وزندهی کردن. 49

2-6-1-3. کاربرد عملی نفوذ مجلات نارین و ضریب تأثیر گارفیلد در علم­سنجی.. 50

2-7. همکاری­های علمی.. 52

2-7-1. ضریب همکاری گروهی.. 54

2-8.چشم­انداز و نقشه جامع علمی کشور ایران. 54

2-8-1. چشم­انداز جمهوری اسلامی ایران در افق 1404 هجری شمسی.. 54

2-8-2. مفهوم شناسی نقشه جامع علمی کشور به عنوان چشم­انداز علمی کشور. 56

2-8-3. دسته­بندی حوزه های اولویت دار. 57

2-8-4. نرخ تولید علم و کیفیت تولید علم در نقشه جامع علمی کشور. 58

2-8-5. چشم­انداز کشور ترکیه. 59

2-9.اولویت­های علم و فناوری منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 60

 

 

2-9-1. اهمیت فناوری­های نوین در جهان. 60

2-9-1-1. فناوری نانو(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 60

2-9-1-2. زیست­فناوری(تعریف، تاریخچه، اهمیت) 63

2-9-1-3. انرژی هسته ای.. 67

2-10.معرفی پایگاه­های استنادی مورد استفاده 68

2-10-1. وب آو ساینس… 69

شکل 2-2. صفحه جستجوی پیشرفته پایگاه وب آو ساینس… 69

جدول2-1. انواع مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس(برگرفته از صفحه جستجوی پایگاه وب آو ساینس) 70

جدول 2-2 . انواع مختلف قالب مدارک نمایه شده در پایگاه وب آو ساینس… 71

2-10-2. پایگاه اطلاعاتی جی سی آر. 72

شکل 2-3 . صفحه اصلی پایگاه استنادی نشریات… 72

2-10-3. پایگاه ای اس آی.. 73

شکل 2- 4. صفحه اصلی پایگاه اطلاعاتی ESI 73

2-11. جمع بندی مبانی نظری.. 74

2-12. پیشینه پژوهش… 75

2-12-1. پیشینه در داخل ایران. 75

2-12-1-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف منتخب از نقشه جامع علمی کشور. 75

2-12-1-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه های مختلف علم و فناوری.. 78

2-12-1-3. بررسی جایگاه ایران در علوم جهانی.. 87

2-12-1-4. ارزیابی بروندادهای علمی دانشگاه­ها و مؤسسات… 93

2-12-2. پیشینه در خارج از ایران. 96

2-12-2-1. ارزیابی بروندادهای علمی در اولویت­های علم و فناوری سطح الف نقشه جامع علمی کشور جمهوری اسلامی ایران. 96

2-12-2-2. ارزیابی بروندادهای علمی در حوزه های مختلف علم و فناوری.. 108

2-13. جمع­بندی از مرور پیشینه­ها 117

فصل سوم. 120

3-1. مقدمه. 121

3-2. روش پژوهش… 121

3-3. جامعه آماری پژوهش… 122

3-4. روش نمونه گیری و حجم نمونه. 123

3-5. ابزار گردآوری داده ­ها 123

3-6. روش جمعآوری داده ­ها 124

3-7. روش تجزیه تحلیل داده ­ها 127

3-8. جمع­بندی.. 128

فصل چهارم. 129

4-1. مقدمه. 130

4-2. پاسخ به سؤالات پژوهش… 131

4-2-1. تعداد و سهم کل بروندادهای علمی کشورهای جهان در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی در دوره زمانی2002-2011 به تفکیک قاره­های جهان. 131

4-2-2. برترین کشورها از نظر کمّیت تولیدات علمی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری منتخب   134

4-2-3. بروندادهای علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از حوزه های اولویت­دار علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 138

4-2-3-1. تعداد کل بروندادهای علمی، سهم جهانی از بروندادهای علمی و رتبه جهانی و منطقه­ای کشورهای مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار منتخب… 139

4-2-3-2. رتبه منطقه­ای بروندادهای علمی ایران و سایر کشورهای رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار مورد بررسی به طور کلی و بدون اعمال محدودیت زمانی برای شناسایی جایگاه واقعی کشور ایران در حوزه های مذکور. 143

4-2-4. میزان رشد بروندادهای علمی جهانی در سال­های مختلف مورد بررسی در اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 144

4-2-4-1. تعداد و میزان رشد بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 147

4-2-5. میزان کیفیت بروندادهای علمی 23 کشور مورد بررسی در هر یک از اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 148

4-2-6. تعداد نویسندگان، دانشگاه ها، کشورهای همکار و تعداد نشریات در کشورهای مورد بررسی برای ارائه فرمولی برای پیش ­بینی آینده 155

4-2-6-1. آزمون رگرسیون. 158

4-2-6-1-1. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 158

4-2-6-1-2. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در رشته فناوری نانو. 160

4-2-6-1-3. بررسی عوامل مؤثر بر رشد استنادات در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 161

4-2-7. دستهبندیهای موضوعی مرتبط با اولویت­های علم و فناوری در بروندادهای علمی کشور ایران  163

4-2-8. وضعیت شاخصهای کیفی علمسنجی مانند شاخص اچ، جی، اچجی، پی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هستهای بروندادهای علمی کشور ایران. 166

4-2-9. میزان همکاریهای علمی بین المللی ایران در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای با سایر کشورهای جهان. 167

2-4-9-1. کشورهای برتر از نظر تعداد همکاریهای علمی بین ­المللی با کشور ایران و همچنین شاخصهای ارزیابی کیفیت مانند تعداد استنادات، میانگین استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ در اولویت­های علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 168

2-4-9-1-1. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه زیست فناوری.. 168

2-4-9-1-2. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه فناوری نانو. 169

2-4-9-1-3. کشورهای برتر همکاری کننده با ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 170

4-2-9-2. مقایسه بروندادهای علمی با همکاری­های علمی بین المللی و ملّی بر اساس شاخص ­های کمّی و کیفی در هر یک از اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای.. 171

4-2-10. شبکه هم­نویسندگی برای بروندادهای علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بین المللی در هر یک از حوزه های اولویتدار مورد بررسی در طی سالهای 2002 تا 2011. 172

4-2-10-1. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه زیست فناوری.. 173

4-2-10-2. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه فناوری نانو. 174

4-2-10-3. شبکه هم­نویسندگی بروندادهای علمی ایران در حوزه انرژی هسته­ای.. 175

4-2-11. ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در طی سال­های 2002 تا 2011. 176

4-2-12. وضعیت نویسندگان برتر ایرانی در اولویتهای علم و فناوری زیست، نانو و انرژی هسته­ای بر اساس شاخص ­های ارزیابی کمّی و کیفی.. 177

جدول 4-23. وضعیت کمّی و کیفی نویسندگان ایرانی در حوزه اولویتدار زیست فناوری در سال­های 2002 تا 2011  177

4-2-13. برترین دانشگاه ها و مؤسسات ایرانی در حوزه های اولویتدار زیست، نانو و انرژی هسته­ای در دوره زمانی 2002 تا 2011. 180

4-2-13-1. دانشگاه ها و مؤسسات برتر ایرانی از لحاظ دارا بودن بیشترین تعداد بروندادهای علمی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری و بررسی کیفیت آنها بر اساس شاخص ­های بروندادی.. 180

4-2-14. مجلات معتبر بین ­المللی که بیشترین تولیدات علمی نویسندگان ایرانی در زمینه ­های موضوعی مذکور در آنها چاپ شده است، کدامند؟. 186

4-2-15. مجلاتی که تولیدات علمی ایرانیان در آنها به چاپ رسیده اند در مقایسه با مجلات بین المللی ، در حوزه های موضوعی مورد بررسی به صورت تفکیک سال­های مورد بررسی از نظر شاخص ­های مختلف ارزیابی کیفیت در چه وضعیتی قرار دارند؟. 192

4-2-16. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) 198

4-2-16-1. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  198

4-2-16-2. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  198

4-2-16-3. ارتباط بین میزان انتشارات(کمّیت) و استنادات(کیفیت) در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  199

4-2-17. بررسی ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 199

4-2-17-1. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای.. 199

جدول4-38. ضریب همبستگی اسپیرمن بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  199

4-2-17-2. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو. 200

4-2-17-3. ارتباط بین تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 200

4-2-18. بررسی ارتباط بین تعداد استنادات به ازای انتشارات و شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویتدار علم و فناوری انرژی هسته­ای ، نانو و زیست… 200

4-2-18-1. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار انرژی هسته­ای  201

4-2-18-2. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  201

4-2-18-3. رابطه بین تعداد استنادات به ازای تعداد انتشارات و شاخص اچ در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  202

4-2-19. بررسی ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری انرژی هسته­ای، فناوری نانو و زیست فناوری.. 202

4-2-19-1. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای  202

4-2-19-2. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار فناوری نانو  203

4-2-19-3. ارتباط بین تعداد نویسندگان و تعداد استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری  203

4-2-20. بررسی ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در حوزه های اولویت­دار انرژی هسته­ای ، نانو و زیست فناوری.. 203

4-2-20-1. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولید بروندادهای علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویتدار انرژی هسته­ای.. 204

4-2-20-2. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در زمینه فناوری نانو  204

4-2-20-3. ارتباط بین تعداد کشورهای همکاری کننده در تولیدات علمی و استنادات دریافتی در حوزه اولویت­دار زیست فناوری.. 205

4-2-21. آزمون­های آماری مربوط به بررسی وجود و یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری در شاخصهای ارزیابی بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 205

4-2-21-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی 23 کشور رقیب مورد بررسی در سه حوزه اولویت­دار علم و فناوری منتخب… 205

4-2-21-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص تعداد استنادات به ازای انتشارات 23 کشور رقیب مورد بررسی.. 206

4-2-22. آزمونهای بررسی تفاوت برای بروندادهای علمی کشور ایران. 207

4-2-22-1. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار میان میزان رشد بروندادهای علمی کشور ایران در هر یک از اولویت­های علم و فناوری نانو، زیست و انرژی هسته­ای.. 207

4-2-22-2. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری تفاوت بین میزان استناد به بروندادهای علمی ایران در اولویت­های علم و فناوری.. 207

4-2-22-3. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین نسبت بین استنادات و انتشارات نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی.. 208

4-2-22-4. بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار بین بروندادهای علمی اولویت­های علم و فناوری و میزان استنادات دریافتی نویسندگان برتر ایرانی.. 208

4-2-22-5.بررسی وجود یا عدم وجود تفاوت معنادار آماری بین شاخص اچ بروندادهای علمی نویسندگان برتر ایرانی در اولویت­های علم و فناوری مورد بررسی 209

فصل پنجم. 210

5-1. مقدمه. 211

5-2. نتیجه ­گیری از یافته­ های پژوهش… 211

5-2-1. کمّیت و سهم بروندادهای علمی جهان به تفکیک قاره­های مختلف در حوزه های اولویت­دار علم و فناوری چگونه می­باشد؟. 212

5-2-2. برترین کشورهای جهان از نظر تعداد بروندادهای علمی و بررسی زبان و قالب بروندادهای علمی جهانی و ایرانی کدامند؟ 212

5-2-3. رتبه جهانی و منطقه­ای ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، بر اساس کمّیت و سهم جهانی بروندادهای علمی آنها، در طی ده سال مذکور به چه نحوی میباشد؟. 213

5-2-4. ضریب رشد تولیدات علمی کشورهای مورد بررسی در هر یک از سه اولویت منتخب در طی سال­های مذکور چقدر است؟. 213

5-2-5. وضعیت کیفی بروندادهای علمی کشور جمهوری اسلامی ایران و کشورهای رقیب در چشم­انداز 1404، به چه نحو میباشد؟. 214

5-2-6. وضوعاتی که بیشترین تعداد بروندادهای علمی را در هر یک از حوزه های اولویت­دار مورد بررسی دارا می­باشند کدامند؟ 215

5-2-7. کمّیت و کیفیت تولیدات علمی کشور ایران با همکاری­های علمی بین المللی و ملّی در اولویت­های منتخب علم و فناوری به چه نحوی میباشد؟. 215

5-2-8. میانگین ضریب همکاری گروهی نویسندگان ایرانی در هر یک از سه حوزه اولویتدار مورد بررسی در دوره زمانی 2002 تا 2011 به چه میزانی میباشد؟. 217

5-2-9. برترین نویسندگان ایرانی از نظر تعداد بروندادهای علمی و بررسی وابستگی سازمانی و کیفیت بروندادهای علمی آنها کدامند؟. 217

5-2-10. مجلات بین ­المللی که بیشترین تولیدات علمی محققان ایرانی در آنها به چاپ رسیده است کدامند و کیفیت و نفوذ آنها به چه نحوی می­باشد؟. 218

5-2-11. آیا بین شاخص ­های مختلف بروندادی در 23 کشور رقیب مورد بررسی رابطه معناداری وجود دارد؟ 218

5-4. پیشنهادهای حاصل از پژوهش… 219

5-4-1. پیشنهادهای اجرایی.. 219

5-4-2 پیشنهادهایی برای پژوهش­های آینده 220

فهرست منابع. 221

پیوست الف… 230

چکیده انگلیسی.. 232

مقدمه

علم و فناوری زیربنای توسعه پایدار هر کشور محسوب می­ شود؛ از این رو ارزیابی آن در سطح بین ­المللی به عنوان فرایندی رو به رشد در سال­های اخیر، مورد توجه قرار گرفته است و هم­اکنون در بیشتر کشورهای صنعتی به طور منظم و توسط مؤسساتی در بخش عمومی یا خصوص انجام می­ شود؛ زیرا بدین طریق می­توان نظام علم و فناوری هر کشور را توصیف و ساختار آن را شناسایی و نقاط ضعف و قوت آن را مشخص کرد تا بتوان با تعیین راهبردها و برنامه ­ریزی­های دقیق و منظم و اجرای عملی آنها به توسعه پایدار دست یافت(خالقی، 1386).

سیاست­ها، برنامه­ها و فعالیت­های علوم و تکنولوژی در کشورهای مختلف مبین این حقیقت است که دستیابی به اهداف عالی توسعه علم وتکنولوژی، بدون سیاست­ها و برنامه ­های روشن و مشخص و ساختاری مناسب ممکن نبوده و اتلاف

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: مقدمه	1
1-1-مقدمه	2
1-2-انجماد	2
1-2-1-تاریخچه ی انجماد	3
1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی	3
1-2-2-1-انجماد آهسته	4
1-2-2-2-انجماد شیشه ای	5
1-2-3-محلول های انجمادی	5
1-2-3-1-ضدیخ ها	5
1-2-3-2-سرم	7
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه	7
3- 1-3-پیوند	9
4- 1-4-کشت	10
5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد	11
1-5-1-آپوپتوزیس	12
1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن	13
1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن	14
1-5-1-3-P53	16
1-5-1-4-کاسپاز 3	17
1-6-هدف	18
1-7-پرسش پژوهشی	18
1-8-فرضیات	18
فصل دوم : مواد و روش ها	19
2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه	20
2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه	21
2-2-1-روش تهیه محیط پایه	21
2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای	21
2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I	21
2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II	22
2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای	22
2-2-3-1-روش انجمادی I	22
2-2-3-2-روش انجمادی II	23
2-2-4-ذوب بافت بیضه	23
2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب	23
2-2-4-2-مراحل ذوب	23
2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه	24
2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی	26
2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه	26
2-6-1-1-هضم مکانیکی	27
2-6-1-2-هضم آنزیمی	27
2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با بهره گرفتن از رنگ PI	27
2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری	28
2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی	29
2 -7-کشت بافت بیضه	30
2-7-1-آماده سازی آگار	30
2-7-2-آماده سازی محیط کشت	31
2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI	31
2-7-3-کشت بافت بیضه	32
2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی	32
2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later	32
2-8-2-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول	32
2-8-2-1-هموژن کردن بافت   2-8-2-2-مرحله ی جداسازی	33   33
2-8-2-3-رسوب RNA	33
2-8-2-4-شستشو RNA	33
2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده	34
2-8-4-تیمار نمونه­یRNA  با بهره گرفتن از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی	34
2-8-5-سنتز cDNA	35
2-8-6-پرایمر	37
2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها	37
2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها	39
2-8-7-الکتروفورز	39
2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE	39
2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1	40
2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز	40
2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر	40
-8-7-4-بررسی کیفیت RNA	41
2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر	41
2-8-9 Real-Time PCR	42
2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش Real-Time PCR	43
2-9-آنالیز آماری داده	44
فصل سوم: نتایج	45
3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	46
3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب	46
3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	47
3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	48
3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه	48
3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت	49
3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی	49
3-4-2-Bax	49
3-4-3-BCL2	49
3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2	50
3-4-5-Caspase3	50
3-4-6-Fas	50
3-4-7-Fas Ligand	51
3-4-8-P53	51
27- فصل چهارم: بحث	66
4-1-کلیات	67
4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه	68
4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه	69
4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه	71
4-5-نتیجه گیری	75
4-6-پیشنهادات	76

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی  هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان  BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand   Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز	16
شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری	28
شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز	30
شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر	59
شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر	60
شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت	61
شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت	62
شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	63
شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	64
شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	65

چکیده

گرچه انجماد بافت بیضه روشی مناسب جهت حفظ باروری در کودکان مبتلا به سرطان است اما القای آپوپتوز و مرگ سلولی تحت تاثیر فرایند انجماد نکته ی مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. هدف از انجام این پژوهش ارزیابی میزان آپوپتوز سلولی پس از انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش نابالغ با دو روش انجمادی مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.

بافت های بیضه از موش های سوری نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفی در سه گروه کنترل ، انجمادیI و انجمادی II تقسیم گردید. در گروه انجمادی I، بافت ها با بهره گرفتن از غلظت های افزایشی ضدیخ های DMSO و EG و در گروه انجمادی II، با بهره گرفتن از  غلظت افزایشی ترکیب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه های انجمادی پس از ذوب همراه با نمونه ها ی کنترل به مدت 20 ساعت در محیط کشت RPMI حاوی 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژی، بقای سلولی، میزان وقوع آپوپتوز سلولی و میزان بیان ژن ها آپوپتوزی  (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با بهره گرفتن از روش های میکروسکوپ نوری، آنالیز فلوسایتومتری و Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.

روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II از لحاظ حفظ یکپارچگی بافت و بقای سلولی مشابه نمونه ی کنترل بود. آپوپتوز اولیه ی سلولی نیز طی ساعات کشت در گروه های انجمادی به طور معناداری (P<0/05) کاهش یافت ولی آپوپتوز ثانویه ی سلولی در گروه های انجمادی در ساعت 3 پس از کشت در مقایسه با زمان صفر به طور معناداری (P<0/05) افزایش یافت در حالی که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در گروه انجمادی I و گروه کنترل در مقایسه با گروه انجمادی II به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. میزان بیان ژن BAX در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل در طی ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. بیان ژن BCL2 در گروه های انجمادی در طی ساعات کشت کاهش یافت ولی این کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ی گروه ها در زمان 3و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد. بیان ژن های  Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه های انجمادی در مقایسه با زمان صفر افزایش معناداری (P<0/05) یافت. میزان بیان ژن p53 در گروه های کنترل و انجمادی I در ساعت 3 و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد ولی بیان این ژن در گروه انجمادی II در طی فرایند کشت نسبتا ثابت بود.

با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد هر دو روش انجمادی به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولی از طریق مسیر نکروزی و آپوپتوزی می شوند، اما روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II مرگ سلولی را بیشتر از طریق آپوپتوز القا می کند تا نکروز. از سوی دیگر با توجه به تغییرات الگوی بیان ژن P53 در حین فرایند کشت در هر دو گروه انجمادی می توان نتیجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بیضه مستقل از ژن P53 است.