فهرست مطالب

عنوان                                                                                                         صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 3

فصل اول: کلیات

اهداف و انگیزه……………………………………………………………………………………………………………………….        5

1-1.گیاه کرفس……………………………………………………………………………………………………… …7

1-1-1. نام های گیاه………………………………………………………………………………………………. …7

1-1-2. آثار فارماکولوژیکی……………………………………………………………………………………………………….       8

1-1-3. ریخت شناسی…………………………………………………………………………………………………………….        8

1-1-4. ترکیبات شیمیایی………………………………………………………………………………………………………..         8

1-1-5. ترکیبات آنتی اکسیدان………………………………………………………………………………………………….         9

1-1-6. دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان……………………………………………………………   9

1-1-7. اعمال مهم آنتی اکسیدان ها……………………………………………………………………………. 10

1-1-8. آنزیم های آنتی اکسیدان……………………………………………………………………………….. .10

1-1-8-1.سوپراکسید دیسموتاز (SOD)……………………………………………………………………. 10

1-1-8-2.کاتالاز……………………………………………………………………………………………………. 11

1-1-8-3.گلوتاتیون پراکسیداز(GSH)………………………………………………………………………. 11

1-1-9. پلی فنول…………………………………………………………………………………………………… 12

1-1-9-1-گروه های اصلی ترکیبات فنولی………………………………………………………………….. 13

1-1-10. فلاونوئیدها……………………………………………………………………………………………… 13

1-1-10-1.خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها……………………………………………………………… 13

1-1-10-2. شیمی گیاه فلاونوئیدها……………………………………………………………………………. 15

1-1-10-3. آپیژنین……………………………………………………………………………………………….. 16

1-1-10-4. فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند…………………………………….. 16

1-1-10-5. فارماکودینامی فلاونوئیدها……………………………………………………………………….. 17

1-1-10-6. جهش زایی و سمیّت ژنی مصرف زیاد فلاونوئیدها……………………………………….. 17

1-1-11. رادیکال های آزاد……………………………………………………………………………………… 18

1-1-11-1. استرس اکسیداتیو………………………………………………………………………………….. 18

1-1-11-2. واکنش های رادیکال های آزاد………………………………………………………………….. 20

1-1-11-3. تقسیم بندی انواع رادیکال های آزاد…………………………………………………………… 21

1-1-11-4. انواع گونه های رادیکالی اکسیژن و نیتروژن…………………………………………………. 22

1-1-11-5. روش های مختلف تولید گونه های اکسیژن و نیتروژن……………………………………. 22

1-1-11-6. اثر رادیکال های آزاد بر روی چربی ها………………………………………………………. 23

1-1-11-7. سیستم های مقابله با آسیب رادیکال های آزاد………………………………………………. 23

1-2. کبد………………………………………………………………………………………………………………. 24

1-2-1. ساختمان کبد……………………………………………………………………………………………… 24

1-2-2. تشریح و آناتومی کبد……………………………………………………………………………………. 25

1-2-3. بافت شناسی کبد…………………………………………………………………………………………. 27

1-2-4. سلول های كبدی………………………………………………………………………………………….. 27

1-2-5. نقش سیستم لنفاوی در عملکرد کبد…………………………………………………………………. 30

1-2-6. ترمیم بافت در کبد افراد بزرگسال……………………………………………………………………. 31

1-2-7. اعمال ترشّحی و دفع كبد……………………………………………………………………………….. 31

1-2-7-1. متابولیسم و دفع گزنوبیوتیک ها…………………………………………………………………… 32

1-2-8. متابولیسم کربوهیدرات ها………………………………………………………………………………. 33

1-2-9. متابولیسم لیپید ها………………………………………………………………………………………… 34

1-2-10. اختلال هموستاز در بیماری های کبدی…………………………………………………………… 35

1-2-10-1. آنزیم های رها شده از بافت کبدی بیمار……………………………………………………… 36

1-2-10-2. ویژگی بافتی………………………………………………………………………………………… 37

1-2-10-3. توزیع داخل سلولی آنزیم ها……………………………………………………………………. 38

1-2-10-4. فعایت نسبی در کبد و پلاسما………………………………………………………………….. 38

1-2-10-4. مکانیسم آزاد سازی……………………………………………………………………………….. 39

1-2-10-5. سرعت پاکسازی آنزیم ها از پلاسما…………………………………………………………… 40

1-2-11. انواع بیماری های کبد………………………………………………………………………………….. 40

1-2-11-1. مکانیسم ها و الگو های آسیب………………………………………………………………….. 41

1-2-12. آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) (GPT) (SGPT) (ALAT)……………………… 42

1-2-13. آنزیم آسپارات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………….. 43

1-2-14. آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………….. 44

1-2-15. پروتئین تام……………………………………………………………………………………………….. 46

 

1-2-15-1. میزان پروتئین های خون……………………………………………………………………………. 46

1-2-16. اندازه گیری آلبومین پلاسما……………………………………………………………………………. 48

1-2-17. بیلی روبین پلاسما………………………………………………………………………………………. 48

1-2-17-1. بیلی روبین و انواع آن………………………………………………………………………………. 49

1-2-18. وظایف عملی پروتئین های پلاسما…………………………………………………………………. 49

1-2-19. ساخت پروتئین های پلاسما………………………………………………………………………….. 50

1-2-20. ازت اوره خون…………………………………………………………………………………………. 51

1-2-21. کراتینین………………………………………………………………………………………………….. 51

1-3. تتراکلرید کربن و سمّیت آن……………………………………………………………………………….. 53

1-3-1. مکانیسم ها ی فعال سازی متابولیکی تتراکلرید کربن…………………………………………….. 54

1-3-2. پراکسیداسیون چربی ها…………………………………………………………………………………. 56

1-3-3. نقص در ساخت پروتئین………………………………………………………………………………. 57

1-3-4. به هم خوردن تعادل کلسیم……………………………………………………………………………. 57

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1. دستگاه‌ها و لوازم و تجهیزات مورد استفاده…………………………………………………………….. 60

2-2. تركیبات شیمیایی و مواد مصرفی…………………………………………………………………………. 61

2-3.دستگاه پرکولاتور……………………………………………………………………………………………………………62

2-4. روش تهیه عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس…………………………………………………………….. 63

2-5. حیوانات مورد استفاده و نحوة ‌نگهداری آنها…………………………………………………………… 65

2-6. گروه بندی حیوانات…………………………………………………………………………………………. 66

2-7. روش دادن عصاره…………………………………………………………………………………………… 68

2-8. روش تجویز دارو……………………………………………………………………………………………. 68

2-9. خونگیری از قلب …………………………………………………………………………………………… 69

2-10. روش تعیین فعالیت آنزیم آسپارتات آمنیوترانسفراز (AST/GOT) و آنزیم الانین آمینوترانسفراز (GPT/ALT)……………… 70

2-11. روش تعیین فعالیت آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………….. 71

2-12. روش تعیین میزان ‌ آلبومین و بیلی روبین در سرم خون………………………………………….. 71

2-12. روش های تجزیه و تحلیل آماری………………………………………………………………………… 73

فصل سوم: نتایج

3-1. نتایج مربوط به غلظت آنزیم  AST در گروه های آزمایشی………………………………………. 75

3-2. نتایج مربوط به غلظت آنزیم  ALT در گروه های آزمایشی………………………………………. 78

3-3. نتایج مربوط به غلظت آلکالین فسفاتاز در گروه های آزمایشی……………………………………. 82

3-4. نتایج مربوط به غلظت آلبومین در گروه های آزمایشی………………………………………………. 85

3-5. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین توتال (T.Billi) در گروه های آزمایشی…………………… 88

3-6. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین مستقیم (D.Billi) در گروه های آزمایشی………………… 91

3-7. مقایسه نتایج مربوط به  وزن موشهای صحرایی در پایان آزمایش در گروه های آزمایشی…… 93

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1. بحث……………………………………………………………………………………………………………. 98

4-2. نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………….. 107

4-3.پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………. 108

فهرست منابع

منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………………. 110

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………….112

Abstract…………………………………………………………………………………………………………. 122

فهرست جداول

جدول2 -1: گروه بندی نمونه ها بر اساس مصرف عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس و تتراکلرید کربن…………………………………….. 66

جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد………………………………………..76

جدول 3-2: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز……………………………….. 77

جدول 3-3 : مقایسه میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد……………………………………..79

جدول3-4: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصارههیدروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز  80

جدول 3-5: مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروه کنترل و شاهد…………………………82

جدول 3-6: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز…………………………….. …..83

جدول 3-7: مقایسه میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………………….85

جدول 3-8: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آلبومین   86

جدول 3-9: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد………………………………..88

جدول3-10: اثر تزریق درن صفاقی(IP) عصاره هیدروالکی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت بیلی روبین توتال……………………… 89

جدول 3-11: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد…………………………..91

جدول3-12: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان بیلی روبین مستقیم………………………… 92

جدول 3-13: مقایسه میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد……………………………94

جدول3-14: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان وزن………………………… 95

فهرست نمودارها

نمودار (3-1): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد…………………………76

نمودار (3-2): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST……………………………………………….. …………78

نمودار(3-3): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد………………………….80

نمودار (3-4): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT ……………………………………………………….81

نمودار(3-5): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALP در گروه کنترل و شاهد……………………….83

نمودار (3-6): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلکالین فسفاتاز ………………………………………………………84

نمودار(3-7): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………86

نمودار (3-8): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین …………………………………………………………………87

نمودار(3-9): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال  در گروه کنترل و شاهد………………….89

نمودار (3-10): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال …………………………………………………90

نمودار(3-11): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم  در گروه کنترل و شاهد……………..92

نمودار (3-12): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم ……………………………………………….93

نمودار(3-13): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی  در گروه کنترل و شاهد……………..95

نمودار (3-14): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در پایان آزمایش………………………..       96

فهرست شکل ها

شکل (1-1): گیاه کرفس………………………………………………………………………………………………………………… 7

شکل (1-2-): ساختار فلاونوئیدها…………………………………………………………………………………………..  16

شکل (1-3-): آسیب بافتی توسط رادیکال ها……………………………………………………………………………   21

شکل (1-4): ساختمان هپاتوسیت ها و سلول های کبدی……………………………………………………………     29

شکل (1-5): کبد اندامی است که متابولیسم کربوهیدرات را انجام می دهد……………………………………       34

شکل (1-6): متابولیسم لیپیدها………………………………………………………………………………………………… 35

شکل(2-1):دستگاه پرکولاتور…………………………………………………………………………………………………..63

شکل (2-2): نحوه عصاره گیری………………………………………………………………………….. ………………….64

شکل (2-3): تصویر قفس های نگهداری مو……………………………………………………………………………..   65

شکل (2-4): طرز گاواژ………………………………………………………………………………………………………….          67

شکل (2-5): نحوه تزریق تتراکلریدکربن و روغن زیتون……………………………………………………………..    69

چکیده:

مشکلات استفاده از داروهای شیمیایی و آثار بجامانده از عوارض جانبی بعضی از داروها منجر به فزونی استفاده از گیاهان دارویی شده است. یافتن دارویی موثر در درمان این اختلالات مورد توجه محققین و پزشکان می باشد. گیاه کرفس (Apium graveolens) از خانوادهApiaceae) ) است که در ایران از این گیاه استفاده غذایی می نمایند و بر این باورند که خواص دارویی مفیدی نیز دارد. لذا این مطالعه با هدف بررسی اثرات محافظت کبدی گیاه کرفس بر مسمومیت القایی ناشی از مصرف تتراکلریدکربن (CCl4) درموش های سفید بزرگ آزمایشگاهی نر از نژاد اسپیراگوداولی انجام شد. بنابراین تعداد 40 سر موش به تعداد مساوی به پنج گروه هشت تایی تقسیم شدند. یک گروه به عنوان کنترل و در چهار گروه دیگر توسط CCl4  سمیت کبدی (هپاتوتوکسیک) ایجاد شد. از این چهار گروه، یک گروه به عنوان شاهد و در سه گروه دیگر روزانه به ترتیب 200، 400 و 600 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن حیوان از عصاره هیدروالکلی کرفس به صورت دهانی (گاواژ) داده شد. چهل روز بعد از شروع مطالعه در کلیه گروه ها آنزیم های آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، آسپارتات امینوترانسفراز (AST) و آلکالین فسفاتاز (ALP) و همچنین غلظت های سرمی آلبومین، بیلی روبین توتال و مستقیم که از شاخص های آسیب های کبدی هستند اندازه گیری و با بهره گرفتن از آزمون آماری ANOVA و T-testتجزیه و تحلیل گردید. تزریق درون صفاقی تتراکلریدکربن باعث افزایش فعالیت های AST ,ALT ,ALP و کاهش غلظت آلبومین و افزایش غلظت بیلی روبین توتال و مستقیم در مقایسه باگروه کنترل شد. مصرف عصاره گیاه کرفس سبب گردید این فاکتور به طور معنی داری(05/0P≤) به وضعیت نرمال نزدیک شود. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس در برابر آسیب های کبدی ایجاد شده توسط تتراکلریدکربن دارای اثرات محافظتی است، که احتمالاً بواسطه اثر آنتی اکسیدانی ترکیبات پلی فنلی آن در مهار فعالیّت CCl4 و

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                  صفحه

خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول: كلیات

1-1. بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-2. ضروریت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-3. اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-4. سئوالات و فرضیه‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 9

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-1-1. تاریخچه لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………. 12

2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………… 15

2-1-2-1. آنتی ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O)…………………………………………………………………………………. 17

2-1-2-2. الیگو ساکارید مرکزی………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-1-2-3. لیپید A……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18

2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19

2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19

2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21

2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

2-6-1. تاریخچه‌ هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

2-8.

 پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67

2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71

2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93

3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

3-11-2. منحنی استاندارد H2O2……………………………………………………………………………………………………….. 98

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110

3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده…………………………………………. 111

3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 111

3-18-2. منحنی استاندارد H2O2…………………………………………………………………………………………………….. 111

3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112

3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده……………………………………….. 112

3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده………………………………………………………………………. 113

3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113

فصل چهارم: نتایج

4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116

4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با بهره گرفتن از روش XTT….. 117

4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)      118

4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   119

4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)       121

4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)     122

4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)     123

4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   124

4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)  125

4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)………….. 126

4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف……………………………………………….. 127

4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف…………………………………………….. 128

4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف………………………………………… 129

4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست……………………………………………………… 138

5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo…………………………………………………………… 142

5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro………………………………………………… 144

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 149

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 162

فهرست جداول

جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135

فهرست نمودارها

نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116

نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117

نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118

نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119

نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120

نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120

نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)       121

نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122

نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)     123

نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124

نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125

نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126

نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم       127

نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم     128

نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم  129

فهرست اشكال

شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14

شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15

شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16

شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19

شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28

شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31

شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33

شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول…………………………………………………………… 34

شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها……………………………………………………………………………………………… 36

شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40

شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE2………………………………………………………………………………………………….. 41

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42

شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47

شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48

شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50

شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52

شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57

شکل  2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58

شكل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک‌های داخلی فیبروبلاست……………………………………………………….. 60

شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی……………………………………………………………………………………………… 63

شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم……………………………………………………………………………. 65

شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی)……………………………………………………………………………………………… 66

شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی)…………………………………………. 66

شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها      72

شکل 2-25. اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم……………………………………………………………………………… 73

شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال…………………. 80

شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن………………………………………………………………………… 84

شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی……………………………………………………………………. 94

شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………. 101

شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص…………………………………….. 105

شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم………………………………………………………………………………… 107

شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………….. 108

شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی…………….. 109

شکل 4-1. عکس‌های حاصل از نمونه‌های پاتولوژیک………………………………………………………………………. 134

 

خلاصه فارسی

اندوتوکسین‌ها از عمده‌ترین فاکتور‌های ویرولانس باکتری‌های گرم منفی هستند که به دلیل اثرات ایمونولوژیکی، پاتو فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی بر سلول‌های یوکاریوتی، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترمیم زخم ممکن است به دلیل نقص در مولکول‌های میانجی متوقف شود. لیپو پلی ساکارید (LPS) یکی از اصلی‌ترین محرک‌های تولید میانجی‌های التهابی به شمار می‌آید. هدف اصلی این تحقیق، بررسی اثر تجویز موضعی LPS سالمونلا انتریکا بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنین اثر آن بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست پوست می‌باشد. نمونه‌گیری از بافت‌های پوستی مربوط به گروه‌های شاهد و تیمار طی روز‌های 1، 2، 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، به منظور بررسی‌های بیوشیمیایی و پاتولوژیکی انجام شد. میزان حیات سلولی با بهره گرفتن از روش XTT برای سلول‌های فیبروبلاست صورت گرفت. زخم‌های تیمار شده با LPS (100μg) نسبت به گروه شاهد، افزایش ارتشاح سلول‌های التهابی به محل زخم و افزایشی جزئی در میزان ضخامت لایه‌ی اپیتلیوم نشان دادند. سنجش سیکلو اکسیژناز-2 (COX-2)، هیدروژن پراکسید (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) به منظور اثر احتمالی آنها در ترمیم زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. در سنجش‌های بیوشیمیایی میزان NO، COX-2، H2O2 افزایش یافت (P˂0.001). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسی میزان حیات سلول‌های فیبروبلاست تفاوت معنادار بین گروه‌های شاهد و تیمار مشاهده شد که البته این تفاوت وابسته به دوز مصرفی LPS و مدت زمان انکوباسیون بود. نتایج نشان می‌دهند که LPS با تحریک تولید میانجی‌های التهابی، توانایی افزایش مرحله‌ی التهابی ترمیم زخم را دارد. مطالعات گسترده‌تر با طراحی دوز‌های مختلف از LPS استرین‌های باکتریایی مختلف، فهم بهتری از مکانیسم اثر LPS در ترمیم زخم در مدل حیوانی نشان خواهد داد. به احتمال زیاد این یافته‌ها در توسعه‌ی روش‌های جدید برای درمان زخم‌ها ارزشمند خواهد بود.

واژگان کلیدی: زخم، لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا، التهاب، نیتریک اکسید، سیکلو اکسیژناز-2، هیدروژن پر اکسید، فیبروبلاست

فصل اول

كلیات

1-1. بیان مسئله

سالمونلا انتریکا از دسته‌ی باکتری‌های گرم منفی بی‌هوازی اختیاری داخل سلولی است که سالانه باعث 1.3 میلیارد مورد بیماری در جهان می‌شود. از میان 6 زیر گونه‌ی سالمونلا که بر اساس تفاوت در فلاژل، کربوهیدرات و لیپوپلی ساکارید دسته‌بندی شده‌اند، بیش از 2500 سرووار مربوط به سالمونلا انتریکا شناخته شده است. سالمونلا می‌تواند طیف وسیعی از سلول‌ها مثل دندریتیک سل‌ها، ماکروفاژها، هپاتوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها، کولونوسیت‌ها و سلول‌های اپی‌تلیال را مورد حمله قرار دهد. LPS سالمونلا از محرک‌های قوی پاسخ التهابی در ماکروفاژ‌ها محسوب می‌شود.

التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند، در موش مورد مطالعه قرار گرفته است. با تزریق داخل پوستی LPS S-form و لیپید A سالمونلا تیفی موریوم به موش ddy، بعد از 12 ساعت میزان نفوذپذیری رگها در آن منطقه تغییر می‌کند و باعث ادم می‌شود و به دنبال آن بعد از 24 تا 72 ساعت منجر به نکروز هموراژیک می‌شود. القای التهاب پوستی توسط LPS و لیپید A به ترتیب از بیشترین تاثیر تا کمترین تاثیر بدین صورت هستند:

Re-form LPS > Rc-form LPS > lipid A > Ra-form LPS > S-form LPS

ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند. جزیره‌ی بیماریزایی 2 سالمونلا (SPI2) برای فرار از ماکروفاژ‌ها و ایجاد عفونت سیستمیک در موش‌ها لازم می‌باشد. سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 (سیکلواکسیژناز-2) شود. سایتوکاین‌ها و ایکوزانوئیدهایی چون پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها در نحوه‌ی عملکرد ماکروفاژ‌ها تاثیر می‌گذارند. پروستاگلاندین‌ها (PGs) که در انواع مختلفی از سلول‌ها ساخته می‌شوند از جمله میانجی‌های مهم التهاب و پاسخ ایمنی محسوب می‌شوند. مرحله‌ی محدود کننده‌ی سرعت در سنتز PGs توسط COX کاتالیز می‌شود. COX-2 در انواع کمتری از سلول‌ها بیان می‌شود ولی به شدت با محرک‌های مختلفی مثل میتوژن‌ها، سایتوکاین‌ها، هورمون‌ها و انکوژن‌ها القا می‌شود، همچنین لیپو پلی ساکارید‌ها در القای بیان COX-2 در مونوسیت‌ها و ماکروفاژ‌ها سهیم هستند که این نوع از القا که با LPS ایجاد می‌شود، توسط مسیر سیگنال‌دهی انتقالی پروتئین

فهرست مطالب

  عنوان                                                                                                 صفحه

چكیده فارسی…………………………………………………………………………………………………… 1

فصل اول: کلیات و مروری بر پیشینه تحقیقات

1-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………….. 3

1-2- نئوپلاسم………………………………………………………………………………………………….. 4

1-3- سارکوم رحمی………………………………………………………………………………………….. 4

1-3-1- لیومیوسارکوم………………………………………………………………………………………. 4

1-4- میوم ها…………………………………………………………………………………………………… 6

1-4-1- طبقه بندی میوم ها……………………………………………………………………………….. 7

1-4-2- شیوع میوم در ایران………………………………………………………………………………. 8

1-4-3- عوامل  خطرزا…………………………………………………………………………………….. 8

1-4-4- نظریه های شکل گیری میوم ها………………………………………………………………. 11

1-4-5- ژنتیک میوم ها……………………………………………………………………………………. 12

1-5- هموستاز…………………………………………………………………………………………………. 13

1-6- تشکیل فیبرین و سیستم فیبرینولایتیک……………………………………………………………. 15

1-7- هموستاز و سرطان…………………………………………………………………………………….. 18

1-8- ترومبوز و سرطان……………………………………………………………………………………… 20

1-9- ترومبین………………………………………………………………………………………………… 21

1-9-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……….. 22

1-10- فیبرینوژن……………………………………………………………………………………………… 23

1-10-1- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز…….. 24

1-11- بازدارنده ی فعال كننده پلاسمینوژن1 (PAI-1)…………………………………………….. 25

1-11-1- ارتباط پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……. 27

1-12- اهدف …………………………………………………………………………………………………. 28

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………. 30

2-2- مواد و وسایل لازم جهت انجام آزمایشهای مولکولی ………………………………………… 31

2-3- استخراج DNA از خون…………………………………………………………………………… 33

2-4- بررسی کیفیت و کمیت ژنوم استخراج شده …………………………………………………….. 34

2-4-1- تعیین کیفیت و کمیت ژنوم با بهره گرفتن از دستگاه اسپكتروفتومتر نانودراپ …………. 34

2-4-2- تعیین میزان کیفیت ژنوم با بهره گرفتن از الکتروفورز ……………………………………….. 36

2-5- واكنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ……………………………………………………………….. 37

 

2-5-1- مراحل PCR …………………………………………………………………………………… 37

2-6- روش تکثیر متزلزل جهش ها(ARMS-PCR)  …………………………………………….. 39

2-7- کنترل داخلی……………………………………………………………………………………………… 41

2-8- تهیه مخلوط PCR ………………………………………………………………………………….. 42

2-9- الكتروفورز……………………………………………………………………………………………… 46

2-9-1- الكتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………………… 46

2-9-2- مواد مورد نیاز برای الكتروفورز با ژل آگارز………………………………………………. 47

2-10- الكتروفورز ژل آگارز بر روی محصولات PCR مورد مطالعه …………………………… 48

2-11- عكس برداری از ژل………………………………………………………………………………… 49

2-12- آنالیز آماری داده ها…………………………………………………………………………………. 49

فصل سوم: نتایج

 

 

3-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 51

3-2- اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………………. 52

3-3- بررسی یک عامل خطر در جمعیت مورد مطالعه ……………………………………………… 52

3-3-1- رابطه بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی………………………………………………. 52

3-4-  بررسی پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به میوم رحمی …………………… 54

3-4-1-  بررسی پلی مورفیسم  G20210Aدر پروموتر ژن پروترومبین ………………….. 54

3-4-1-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 55

3-4-2-  بررسی پلی مورفیسم -455G/A  FGB………………………………………………. 58

3-4-2-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم -455G/A FGB ………………………. 59

3-4-3-  بررسی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………………………………… 62

3-4-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………… 63

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 67

4-2- بحث …………………………………………………………………………………………………… 68

4-2-1- بررسی ارتباط بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی……………………………………. 68

4-2-2- ارتباط پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به سرطان………………………. 68

4-2-2-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 68

4-2-2-2- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 69

4-2-2-3- ارتباط پلی مورفیسم  PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان ………….. 70

4-2-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم های مورد مطالعه ………………………………… 71

4-2-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 71

4-2-3-2- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم FGB-455G/A ……………………….. 73

4-2-3-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) ……………… 74

4-3- نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………. 76

4-4- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 77

فهرست منابع و مأخذ ……………………………………………………………………………………….. 78

منابع فارسی ……………………………………………………………………………………………………. 78

منابع غیر فارسی…………………………………………………………………………………………………. 78

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………… 92

فهرست جداول

جدول2-1: مواد لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………………………… 31

جدول2-2: دستگاه و وسایل لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………… 32

جدول2-3: توالی آغازگرهای به کار رفته در روش ARMS-PCR………………………………. 40

جدول2-4: توالی آغازگرها، به منظور کنترل داخلی……………………………………………………… 41

جدول2-5: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن  PT G20210A………… 43

جدول2-6: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن FGB-455G/A…………. 43

جدول2-7: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن (4G/5G)  PAI-1-675 44

جدول2-8: برنامه PCR جهت تكثیر ژن فاكتور II…………………………………………………….. 44

جدول2-9: برنامه PCR جهت تكثیر ژن β- فیبرینوژن……………………………………………….. 45

جدول2-10: برنامه PCR جهت تكثیر ژن PAI-1……………………………………………………. 45

جدول3-1: اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………….. 52

جدول3-2: درصد فراوانی بیماری در گروه های مختلف سنی……………………………………….. 53

جدول3-3: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT و خطر ابتلاء به میوم رحمی….. 55

جدول3-4: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم G20210A PT ……………………. 56

جدول3-5: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT در دو گروه بیمار و شاهد…….. 57

جدول3-6: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه -455G/A FGB و خطر ابتلاء به میوم رحمی… 59

جدول3-7: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم FGB-455G/A …………………… 60

جدول3-8: توزیع ژنوتیپی وآللی در ناحیه -455G/A FGB در دو گروه بیمار و شاهد…….. 61

جدول3-9: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 و خطر ابتلاء به میوم رحمی 63

جدول3-10: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G)  ……… 64

جدول3-11: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 در دو گروه بیمار و شاهد 65

جدول4-1: توزیع آللی پلی مورفیسم PT G20210A در جمعیت های مختلف …………….. 72

جدول4-2: توزیع آللی پلی مورفیسم FGB-455G/A در جمعیت های مختلف …………….. 74

جدول4-3: توزیع آللی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) در جمعیت های مختلف ….. 75

فهرست نمودارها

نمودار3-1: با افزایش سن احتمال ابتلاء به میوم رحمی افزایش یافته است…………………………………. 53

فهرست شکل ها

شکل1-1: محل قرار گیری میوم ها در رحم……………………………………………………………….. 7

شکل1-2: نمودار طرح واره هموستاز ……………………………………………………………………… 14

شكل1-3: تشكیل لخته فیبرین……………………………………………………………………………….. 16

شكل1-4: فیبرینولایز…………………………………………………………………………………………… 17

شکل1-5 : موقعیت ژن پروترومبین (11p11)……………………………………………………………………………… 21

شکل1-6: موقعیت ژن FGB (4q28)…………………………………………………………………… 23

شکل1-7 : موقعیت ژن PAI-1(7q22.1)……………………………………………………………… 25

شکل2-1: الکتروفورز ژل آگارز DNA ………………………………………………………………….. 36

شکل2-2: روش  ARMS-PCRدارای سه پرایمر نرمال، موتانت و مشترک……………………. 39

شکل3-1: نمونه ای از الکتروفورز ژل آگارز مربوط به تعیین ژنوتیپ PT G20210A………. 54

شکل3-2: نمونه ای از الکتروفورز ژل آگارز مربوط به تعیین ژنوتیپ FGB-455G/A………. 58

شکل3-3: نمونه ای از الکتروفورز ژل آگارز مربوط به تعیین ژنوتیپ PAI-1-675 (4G/5G) 62

چكیده

مقدمه: میوم ها تومورهای خوش خیم، جامد و تک کلونی سلولهای عضله صاف دیواره رحم می باشند. میوم ها در 40% -20% از زنان در سال های باروری رخ می دهند. ترومبوآمبولی وریدی (VTE) از عوارض شایع سرطان است. درحال حاضر چندین عامل خطر ژنتیکی برای ترومبوز مرتبط با سرطان شناخته شده است، با این حال، سهم عوامل ترومبوتیک در بیماران مبتلا به سرطان نتایج متناقضی دارد. اگرچه، ارتباط ترومبوز وریدی با میوم بزرگ رحمی گزارش شده است اما پیش از این، تأثیر پلی مورفیسم های مرتبط با ترومبوز بر روی خطر بروز میوم رحمی نامشخص بوده است.

مواد و روش ها: در مطالعه حاضر، سه پلی مورفیسم ژن فاکتور انعقادی انتخاب شدند و با بهره گرفتن از روش ARMS-PCR مورد بررسی قرار گرفته است. در این مطالعه شیوع پلی مورفیسم های ژن پروترومبین(PT) (rs1799963)، بتا فیبرینوژن (rs1800790) (FGB) و بازدارنده ی فعال كننده پلاسمینوژن1 (rs1799889) (PAI-1) در 70 زن با تشخیص کلینیکی میوم رحمی و 70 زن سالم مورد بررسی قرار گرفتند. داده ها به وسیله نرم افزار (version 19)  SPSSو با کمک آنالیز آماری کای دو (2χ) تجزیه و تحلیل شدند.

نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد که پلی مورفیسم هایPT ، FGB وPAI-1 با افزایش خطر ابتلاء به میوم رحمی در جامعه مورد مطالعه ارتباطی ندارند (05/0p>). در این مطالعه نشان داده شد که شیوع میوم رحمی با افزایش سن افزایش

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                          صفحه

خلاصه فارسی …………………………………………………………………………………………………………………………………..    1

مقدمه            ……………………………………………………………………………………………………………………………………     2

فصل اول:کلیات

1-1-1- بیان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………..    5

1-1-2-ضرورت های خاص ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-1-3-اهداف عملی و کاربردی ………………………………………………………………………………………………………………………..  7

1-1-4-پرسش های اصلی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………………   7

1-1-5-فرضیه ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 8

1-2- غذاهای تخمیری و تاریخچه بشریت………………………………………………………………………………………………………..  8

1-2-1- خصوصیات غذاهای تخمیری………………………………………………………………………………………………………………   9

1-2-1-1- نگه داری………………………………………………………………………………………………………………………………………..   10

1-2-1-2- تغذیه………………………………………………………………………………………………………………………………………………   10

1-2-1-3- عملکرد……………………………………………………………………………………………………………………………………………  10

1-2-1-4- خواص ارگانولپتیکی……………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-2-1-5- منحصر به فرد بودن……………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-2-1-6- ارزش اقتصادی……………………………………………………………………………………………………………………………..    11

1-3- باکتری های لاکتیکی ………………………………………………………………………………………………………………………….    11

1-3-1- نقش باکتری های اسید لاکتیک در صنایع غذایی ………………………………………………………………………..    13

1-3-2- متابولیسم باکتری های اسید لاکتیک ……………………………………………………………………………………………    14

1-3-2-1- باکتری های اسید لاکتیک هموفرمنتاتیو (همگن)…………………………………………………………………….    14

1-3-2-2- باکتری های اسید لاکتیک هتروفرمنتاتیو (ناهمگن)…………………………………………………………………   15  1-4- لاکتوباسیل ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………  17

1-5- طبقه بندی لاکتوباسیل ها……………………………………………………………………………………………………………………..  18

1-6- تاریخچه ی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………………………………….  19

1-7- محصولات . ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..  20

1-7-1- پنیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-1- انواع پنیر ………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-2- ارزش غذایی پنیر………………………………………………………………………………………………………………………….   20

1-7-2- ماست ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….   21

1-8- باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………   22

1-8-1- نقش باکتریوفاژ در صنایع لبنی شیر ………………………………………………………………………………………………   24

1-8-1-2- منابع اصلی آلودگی فاژی در کارخانجات صنایع لبنی ……………………………………………………………….  24

1-8-3- اثر باکتریوفاژها …………………………………………………………………………………………………………………………………  24

1-8-4- تاریخچه کشف باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………….  25

1-8-5- مورفولوژی باکتریوفاژ ها ………………………………………………………………………………………………………………… 26

1-8-6- طبقه بندی باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………………..  28

1-8-7- مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………….  30

1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روی سلول باکتری ………………………………………………………………………………………  30

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتری ………………………………………………………………………………………………..  31

1-8-7-3- بیوسنتز ……………………………………………………………………………………………………………………………………….  31

1-8-7-4- رسیدگی کامل ……………………………………………………………………………………………………………………………  31

1-8-8- منشا فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9- سیکل حیاتی فاژ

 …………………………………………………………………………………………………………………………….  32

1-8-9-1- سیکل لیتیک    ………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک …………………………………………………………………………………………………………………………  32

1-8-10- روش جداسازی فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………  34

1-8-10-1- روش مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-1-روش های میکروبیولوژی …………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-2- روش مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-2 روش غیر مستقیم سنتی ………………………………………………………………………………………………………….  35

1-8-10-2-1- تست فعالیت ………………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-2- تست اندیکاتور …………………………………………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-3- فلوسایتومتری ……………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر …………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-5- سنجش پلاک – لکه و رشد – توربیدومتری …………………………………………………………………….  36

1-8-10-2-6- انواع PCR   ………………………………………………………………………………………………………………………  37

1-8-10-2-6-1- ..Mutiplex PCR……………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR ……………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-3- Traditional PCR   ……………………………………………………………………………………………….  38

1-8-11- کنترل فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………….  38

1-9- مقاومت انتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………………………………………….  40

1-9-1- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………..  42

1-9-2- انواع مقاومت  آنتی بیوتیک …………………………………………………………………………………………………………..  43

1-9-3- انتقال ژن های افقی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………….. 43

1-9-4- عوام ضد باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-9-4-1- آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

1-9-5- مکانیسم آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………………………  45

1-9-5-1- آنتی بیوتیک ها ی ممانعت کننده از سنتز دیواره سلول…………………………………………………………   47

1-9-5-1-1- آنتی بیوتیک های بتالاکتام …………………………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2- مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک بتالاکتام …………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2-1- پنی سیلین ها ……………………………………………………………………………………………………………………..  49

1-9-5-2-2- سفالوسپورین ها و سفامایسین ها ………………………………………………………………………………………..  50

1-9-5-2-3- گلیکوپپتیدها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-4- پلی پپتید ها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-5- ایزونیازید، اتیونامید، اتامبتول و سیکلوسرین ……………………………………………………………………… 52

1-9-5-3- انتی بیوتیک های مهار کننده سنتز پروتئین ………………………………………………………………………….. 52

1-9-5-3-1- آمینوگلیکوزید ها …………………………………………………………………………………………………………………  52

1-9-5-3-2- تتراسایکلین ……………………………………………………………………………………………………………………….   54

1-9-5-3-2-1- مقاومت به تتراسایکلین …………………………………………………………………………………………………   54

1-9-5-3-3- اگزازولیدین ………………………………………………………………………………………………………………………..   54

1-9-5-3-4- کلرامفنیکل …………………………………………………………………………………………………………………………  55

1-9-5-3-5- ماکرولیدها …………………………………………………………………………………………………………………………..  55

1-9-5-3-5-1- مقاومت به ماکرولید ها ………………………………………………………………………………………………….  55

1-9-3-6- کلیندامایسین …………………………………………………………………………………………………………………………. 56

1-9-3-7- استرپتوگرامین ………………………………………………………………………………………………………………………  56

1-9-5-4- آنتی بیوتیک های مهار کننده اسید نوکلوئیک ………………………………………………………………………. 57

1-9-5-4-1- کینولون ها ………………………………………………………………………………………………………………………….  57

1-9-5-4-2- ریفامپین و ریفابوتین ………………………………………………………………………………………………………..   57

1-9-5-4-3- مترانیدازول ………………………………………………………………………………………………………………………..   58

1-9-5-4-4- آنتی متابولیت ها ………………………………………………………………………………………………………………..  58

1-9-6-1- اهمیت مقاومت آنتی بیوتیک ها در دام …………………………………………………………………………………  59

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1- تاریخچه …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  62

2-2- مطالعات انجام شده در باکتریوفاژ …………………………………………………………………………………………………..  62

2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………….  64

فصل سوم: مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………..  68

3-2- لوازم مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………..  69

3-3- مواد مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………….  69

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه ……………………………………………………………………………………………………… 71

3-4-2- آماده سازی محیط های کشت ……………………………………………………………………………………………………..  71

3-4-2-1- محیط های کشت MRS  آگار ………………………………………………………………………………………………..  72

3-4-2-2- محیط های کشت نرم MRS  آگار …………………………………………………………………………………………  72

3-4-2-3- محیط کشت MRS  مایع ……………………………………………………………………………………………………….  72

3-5- کشت و آزمایشات تعین هویت باکتری  …………………………………………………………………………………………..  72

3-6- سنجش فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………..  73

3-6-1- روش دو لایه ای پلاک …………………………………………………………………………………………………………………  73

3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتو UV ……………………………………………………………………………………….  73

3-6-3- آزمون Heap and Lawrence …………………………………………………………………………………………………  74

3-7- سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………  75

3-7-2- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار ( دیسک دیفیوژن) …..  76

3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری ………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت ……………………………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-2- روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………..  77

فصل چهارم : نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه ……………………………………………………………………………………………………………….  80

4-2- نتایج ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..  80

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها …………………………………………………………………………………  81

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء  UV و میتومایسین C  ………………………………………….  83

4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C و Heap and Lawrence  ………….. 83

4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با پرتو UV و Heap and Lawrence ……………………  84

4-3- نتایج حساسیت ومقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………. 84

4-4- نتایج میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه ها به آنتی بیوتیک …………………………………………………  91

4-5-1- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به آمینوگلیکوزید ها   92

4-5-2- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سفالوسپورین ها ..  92

4-5-3- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به گلیکوپپتیدها …….  93

4-5-4- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به لینکوزامید ها …….  93

4-5-5- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به ماکرولیدها …………  94

4-5-6- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به پنی سیلین ها …..  94

4-5-7- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به کینولون ها ………..  95

4-5-8- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سولفانامید ها ………  95

4-5-9- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به تتراسایکلین ها…….. 96

4-5-10- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به دیگر آنتی بیوتیک‌ها………………  96

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری  

5-1- اهمیت جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………….   99

5-2- نتایج جستجو برای جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………  100

5-3- اهمیت الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی پروبیوتیک ها ……………………………………………………………………  102

5-4- راه های انتقال ژن های مقاومت به آنتی بیوتیکی در لاکتوباسیل ها …………………………………………….  103

5-5- نتایج تفسیر برای الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی …………………………………………………………………………   104

5-6- پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….  109

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….  111

ضمائم

پوسترهای ارائه شده در پانزدهمین کنگره بین المللی  میکروب شناسی ایران ……………………………………… 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 12۳

فهرست جداول

جدول 1-1- مورفولوژی باکتریوفاژهای اسید لاکتیک ………………………………………………………………………………  30

جدول 1-2- گروه های آنتی بیوتیکی و مکانیسم عمل آن ها ………………………………………………………………….  46

جدول 1-3- پنی سیلین ها و طیف اثر آن ها …………………………………………………………………………………………..  49

جدول 1-4- مثال های انتخابی از سفالوپورین ها و سفامایسین و طیف اثر آن ها ………………………………….  50

جدول 1-5- ماکرولیدها وتتراساسکلین …………………………………………………………………………………………………….  56

جدول1-6- کینولون ها …………………………………………………………………………………………………………………………….   57

جدول 3-1- دستگاه های مورد استفاده در تحقیق به همراه مدل آن ها ……………………………………………….  68

جدول 3-2- مواد مورد نیاز در آزماشی به همراه کشور سازنده آن ها …………………………………………………….  70

جدول 3-3- دیسک های آنتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه …………………….   75

جدول 4-1- نتایج حضور یا فقدان فاژ در سویه ها با بهره گرفتن از 3 روش مختلف …………………………………..  81

جدول 4-2- نتایج قطر هاله عدم رشد و الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی برای سویه های لاکتوباسیل بومی……….  85

جدول 4-3- میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه های به آنتی بیوتیک …………………………………………..  91

فهرست شکل ها

شکل 1-1- روش تخمیر همولاکتیکی در باکتری های اسید لاکتیک …………………………………………………….. 16

شکل 1-2- تخمیر هترولاکتیکی باکتری های اسید لاکتیک ………………………………………………………………….  17

شکل 1-3- شمای کلی باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………  23

شکل 1-4- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ …………………………………………………………………………  33

شکل 3-1- پلاک …………………………………………………………………………………………………………………………………….   74

شکل 3-2- اندازه گیری هاله عدم رشد ………………………………………………………………………………………………….  78

فهرست نمودارها

4-1- نمودار نتایج مقایسه 3 روش مختلف برای جداسازی فاژ ……………………………………………………………..  83

4-2-1- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به آمینوگلیکوزیدها ………. 92

4-2-2- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به سفالوسپورین ها……….  92

4-2-3- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به ونکومایسین ……………   93

4-2-4- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کلیندامایسین………….   93

4-2-5- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به اریترومایسین………….    94

4-2-6- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به پنی سیلین ها …………  94

4-2-7- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کینولون ها………………….95

4-2-8- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کوتریماکسازول ……….  95

4-2-9- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به تتراسایکلین ……………  96

4-2-10- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کلرامفنیکل و نیتروفورانتوئین…………    96

4-2-11- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به میتومایسین………..  97

 

خلاصه فارسی:

امروزه با افزایش جمعیت و شرایط حاكم بر زندگی شهری، نیاز به تولید غذاها و محصولات فرآوری شده تخمیری از جمله ماست و پنیر افزایش چشمگیری پیدا کرده است.  تولید روزافزون محصولات لبنی تخمیری  از یک سو و معضل فاژزدگی در این فرآورده ها از سویی دیگر، یک نیروی پیش برنده، برای بسیاری از تحقیقات بر روی کشت های آغازگر است. مهمترین باکتری های استفاده شده به عنوان ارگانیسم های آغازگر باکتری های اسید لاکتیک هستند.

باکتریوفاژها یا به اختصار فاژها، ویروس هایی هستند که به باکتری ها حمله می کنند وآنها را از بین برده، باعث كاهش یا عدم فعالیت آغازگرها می شوند. این ویروس ها مختص باکتریها هستند و تاثیر آنها بستگی به نوع فاژ، تراكم و سرعت رشد باكتریای ها دارد. آسیب کشت آغازگر توسط باکتریوفاژ می تواند باعث انجام فرایند  تخمیر با سرعت پایین و گاهی باعث شکست تخمیر شود. که در نهایت آسیب به وسیله ی فاژ باعث طولانی شدن زمان تولید و کیفیت پایین محصول نیز خواهد شد.  لذا در این راستا  آلودگی فاژ  65 سویه ی بومی لاکتوباسیل و مقایسه ی حساسیت روش های مختلف مورد بررسی قرار گرفته است  همچنین حساسیت آنتی بیوتیکی این سویه ها نسبت به 23 گروه آنتی بیوتیک مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. این باکتری ها که تحت عنوان آغازگر در صنعت لبنی استفاده می شوند به عنوان پروبیوتیک نیز بدلیل اثرات سلامت بخششان  استفاده می شوند پروبیوتیک ها نباید با انتقال ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به باکتری های دیگر باعث مقاوم شدن آنها به آنتی بیوتیک شوند. بنابراین بررسی میزان مقاومت آن ها به داروهای ضد میکروبی قبل از ورود به صنعت از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است.

برای جداسازی فاژ از سویه های بومی لاکتوباسیل از روش دو لایه ای پلاک و روش هیپ و لورنس[1]  استفاده شد و برای بررسی  حساسیت آنتی بیوتیکی گونه های لاکتوباسیل بومی، نسبت به 23 گروه آنتی بیوتیک مختلف از روش  انتشار در اگار بوسیله دیسک  استفاده  شد.

با بهره گرفتن از روش دو لایه ای پلاک 76% سویه ها، با القا سویه های لیزوژنیک توسط اشعه ماورا بنفش 38/15% سویه ها و با بهره گرفتن از روش هیپ و لورنس 52% سویه ها آلوده به فاژ هستند. نتایج نشان می دهد با بهره گرفتن از روش دیسک دیفیوژن تمامی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کینولون ها ها(نالیدیکسیک اسید و آفلوکساسین) مقاومت 100 درصد دارند و به آمینوگلیکوزید ها (کانامایسین و توبرامایسین) بیشترین میزان مقاومت را دارند و در نقطه ی مقابل بیشترین میزان حساسیت  سویه های لاکتوباسیل مربوط به گروه پنی سیلین ها (آمپی سیلین) می باشد و نسبت به آنتی بیوتیک های مورد مطالعه ی دیگر رفتار متفاوتی را از خود نشان دادند.

کلمات کلیدی: لاکتوباسیل ها، باکتریوفاژ، آنتی بیوتیک، مقاومت، پروبیوتیک

1-1-مقدمه:

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                  صفحه

.1-2بروسلا وبروسلوزیس…………………………………………….10

2-1-1.تاریخچه…………………………………………………………13

2-1-2.وضعیت بیماری در ایران……………………………………..14

2-1-3.انتشار بروسلوز در جهان……………………………………………16

2-2.اهمیت مراقبت بروسلوز ) بیماری تب مالت(…………………………..17

2-3.عامل بیماری…………………………………………………………….20

2-3-1. بروسال ملی تنسیس Brucella Melitensis (دارای 3 سروتایپ)…..20

2-3-2. بروسالا آبورتوس Brucella Abortus (دارای 7 بیوتایپ)………….21

2-3-3. بروسالا سوئیس Brucella Suis (دارای 5 بیوتایپ)…………………22

2-3-4. بروسالا کنیس Brucella Canis…………………………………….22

2-3-5.  بروسالا اوویس Brucella Ovis………………………………………….22

2-3-6.  بروسالا نئوتومه Brucella neotoma……………………………23

2-3-7.  بروسالا ماریس Brucella Maris…………………………………..23

2-4. مورفولوژی………………………………………………………………..24

2-4-1. شاخص های ویرولانس………………………………………………..25

2-4-2. ژنتیک………………………………………………………………..26

2-5. راه های سرایت بیماری………………………………………………27

2-5-2. دوره نهفتگی………………………………………………………27

2-6. علائم بیماری…………………………………………………………….28

2-7-1.  تشخیص آزمایشگاهی بیماری………………………………………..29

-7-2.  انواع تست هاى سرولوژیک بروسلوز………………………………….33

2-7-2-1 تست آگلوتیناسیون داخل لوله ای استاندارد………………………………………33

2-7-2-2  تست آگلوتیناسیون ME2……………………………………………………….33

2-7-2-3. تست آنتی گلوبولین یا كمبس رایت………………………………………………34

2-7-2-4. تست فیكساسیون كمپلمان ( ثبوت مکمل )………………………………………34

2-7-2-5و6. تست های رادیوایمونواسی و ELISA…………………………………….34

2-7-2-7. تست رزبنگال………………………………………………………………….34

2-7-3. تشخیص بروسلوزیس بر اساس روش های مولکولی………….34

2-8. آنتی ژن های سطحی……………………………………………..35

2-8-1. لیپوپلی ساکارید(LPS  )…………………………………………35

2-8-2. پروتئین غشاء خارجی(OMP)………………………………….38

2-8-3. پورین های عمومی………………………………………………….41

2-9.  واکسن های بروسلوز………………………………………………42

2-9-1. واكسن های كونژوگه و طراحی آن ها……………………………………….49

 

2-9-1-2. انتخاب پروتئین حامل…………………………………………..50

2-9-1-1.  انتخاب پلی ساكارید…………………………………………………………..50

2-9-1-3.  نسبت پلی ساکارید به پروتئین………………………………….51

2-9-1-4. تهیه ی کونژوگه های ایمونوژن هاپتن–حامل…………………….51

2-9-1-5. پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیکی..52

2-9-1-6. ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………..53

2-9-1-7. جفت شدگی شیمیایی ( اتصال) ……………………………………53

2-9-1-8. EDC یا EDAC .54

2-9-1-9. آدپیک اسید دی هیدرازید …………………………………………55

2-9-1-10. كونژوگاسیون به شیوه آمیداسیون………………………………56

3-1. تهیه میکروارگانیسم مورد نظر……………………………………….58

3-2. باز کردن سوش لیوفریزه بروسلا آبورتوس……………………..58

3-3. کنترل سوش لیوفیلیزه از نظرRough و Smooth بودن……..59

3-4. تهیه بیوماس سلولی………………………………………………….60

3-5. استخراج و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99……………….61

3-5-1. د تو کسیفیه کردن LPS با روش قلیایی…………………………..63

3-5-2. آزمون Novotny…………………………………………………..63

3-6. استخراج و خالص سازی Omp بروسلا آبورتوس RB51……………64

3-6-2. اندازه‌گیری پروتئین با روش لوری…………………………………..65

3-7. کونژوگاسیون Omp و LPS بروسلا آبورتوس………………………..68

3-8. ستون کروماتوگرافی برای تخلیص کونژوگه………………………..69

3-8-1. مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافی……………………….69

3-9. آزمون کنترل کیفی کونژوگه………………………………………71

3-9-1. کنترل تب زایی در خرگوش(in vivo test)……………………71

3-9-2. کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal Toxicity) ..72

3-10. واکسیناسیون  و سنجش ایمنی زایی کونژوگه……………………..72

3-11. آزمون بررسی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان(سرم باکتریسیدال اسیSBA)……..73

3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74

4-1. تعیین میزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتنی……77

4-2. تعیین غلظت پروتئین در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوری………….80

4-3. نتایج کنترل کیفی کونژوگه……………………………………….81

4-6. نتایج بررسی کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal toxicity)..82

4-5. نتایج کنترل تب زایی در خرگوش (in vivo test)………………..82

4-7. ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم باکتریوسیدال اسی(SBA)…………..83

فهرست شکل ها

شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسط B.abortus ……………….12

شکل(2-2)بروسلا آبورتوس دارای منشاء گاوی…………………………………………..21

شکل(2-3) بروسلا سوئیس دارای منشاء خوک……………………………………………..22

شکل(2-4) بروسلا سوئیس دارای منشاء موش صحرایی………………………………….23

شکل(2-5) بروسلا سوئیس دارای منشاء PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران دریایی……………………………….24

شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با بهره گرفتن از اکروفلاوین………………………………..60

شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61

شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62

شکل(3-4) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69

شکل(3-5): عبور کونژوگه از ستون کروماتوگرافی………………………………..71

فهرست نمودارها و جدول ها

جدول(4-1). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت LPS استاندارد……………………78

نمودار(4-1): نمودار استاندارد غلظت LPS………………………………………………79

جدول(4-2). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت Omp به روش لوری………………80

نمودار(4-2). نمودار استاندارد لوری……………………………………………………81

نمودار(4-3).کروماتو گرافی کونژوگه و فراکشن های آن……………………………..82

جدول(4-3): نتایج گشت رقت های مختلف سرم خرگوش تزریق شده با واکسن کونژوگه و واکسن زنده…….85

 

چکیده

بروسلوز مهمترین بیماری عفونی مشترك بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با بروسلا به وجود می آید. به خاطر ماندگاری بروسلوز،در دنیا سالیانه500000 نفر به این بیماری مبتلا می شوند.واکسن های مورد استفاده در بروسلوز همچون S19 و RB51 که به صورت زنده هستند، در مواردی منجر به بیماری در دام و یا انسان می شوند. مصونیت علیه بروسلوز نیازمند القای هردو پاسخ ایمنی، به خصوص ایمنی سلولی است بسیاری از آنتی ژنهای پیکره بروسلا به تنهایی خصوصیات کافی برای القای این پاسخ ها را ندارند. بدین لحاظ به نظر می رسد واکسن زیرواحد مؤثر علیه بروسلوز احتمالا ترکیبی از چند جزء آنتی ژنی خواهد بود.سویهRB51یک سویه واکسنی پایدار، خشن غنی از پروتئین غشای خارجی می باشد و مهمترین مزیت واکسیناسیون با این سویه، عدم القای آنتی بادی بر علیه زنجیرهO،LPSمی باشد یعنی ایمنی ایجاد شده بر علیه آن فقط از نوع سلولار می باشد.آنتی ژنهای غشای خارجی از خارجی ترین اجزای پیکره بروسلا هستند که درتماس مستقیم با سیستم ایمنی میزبان قرار دارند. بدین لحاظ به عقیده بسیاری از محققین این آنتی ژنها از اجزای اصلی واکسن های زیر واحد احتمالی خواهند بود.تزریقLPS نیز به تنهایی باعث القای تولید آنتی بادیهای مصونیت زا می گردد ولی سیستم ایمنی سلولی را تحریک نمی کند. این موضوع به دلیل نقشLPSبه عنوان یک آنتی ژن غیر وابسته به تیموس است. بدین لحاظ مصونیت ناشی ازLPSدر مقابل بروسلا، کوتاه مدت و ناقص است.بنابراین در این پروژه هدف آن است که با چسباندنLPSبهOMPواکسن کاملی تهیه گردد که بتواند هم ایمنی هومورال وهم سلولار را تحریک نماید.به این منظور بروسلا آبورتوسS99وRB51در محیط کشت بروسلا آگار کشت می گردد. سپس، سلول های کشت شده باPBSشسته شده و توده سلولی هر کدام جمع آوری می گردد.OMPاز طریق روش سدیم لوریل سارکوزینات از سویهRB51تخلیص می گردد و نیزLPS ، سویهS99از طریق روش فنل داغ اصلاح شده تهیه می گردد. سپس با بهره گرفتن از EDAC وآدیپیک اسید دی هیدرازید، لیپوپلی ساکارید بهOMP کونژوگه می گردد و پس از انجام آزمایشات کنترل کیفی، کونژوگه حاصل جهت آزمایشات ایمنی زایی به خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق