با توجه به این که امروزه توانمندسازی به یکی از مفاهیم اصلی توسعه پایدار تبدیل شده است و رابطه آن با توسعه پایدار به شکلی است که یا از اجزای آن یا عامل آن و یا معلول توسعه پایدار به حساب می­آید، لذا دستیابی به توسعه پایدار بدون توانمندسازی اقشار ضعیف جامعه امکان­ پذیر نیست. با توجه به اهمیت موضوع، در این تحقیق تلاش گردیده است تا با تحلیل فضایی، موانع و محدودیت­های توانمندسازی اقتصادی و اجتماعی خانوارهای روستایی تحت پوشش کمیته امداد سیستان مورد کنکاش قرار گیرد. جامعه آماری تحقیق شامل روستاهای با بیش از 50 خانوار تحت پوشش کمیته امداد می باشد که با بهره گرفتن از فرمول کوکران 40 روستا به عنوان حجم نمونه محاسبه گردید. روش تحقیق حاضر، توصیفی – تحلیلی و مبتنی بر بررسی منابع اسنادی، بررسی­های میدانی و تکمیل پرسشنامه بوده است. در تجزیه و تحلیل اطلاعات، از مدل تحلیل سلسله مراتبی (AHP) با کمک نرم­افزار Expert Choice و تحلیل­های فضایی و آماری از طریق نرم افزارهایArcGIS و SPSS استفاده شده است. نتایج حاصل از تحقیق بر اساس آزمون ANOVA نشان داد که وابستگی به آب رودخانه هیرمند با میانگین 5020/0، مشکلات سازمانی با میانگین 4900/0، ویژگی­های شخصیتی و فردی سرپرست خانواده با میانگین 4365/0 و مشارکت با میانگین 4179/0 بعنوان بالاترین عوامل در موانع یا محدودیت­های توانمندسازی اقتصادی و اجتماعی خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد شناخته شد. در همین راستا، دیگر نتایج تحقیق حاکی از آن است که بر اساس تحلیل های آماری، بین شدت اثرات موانع یا محدودیت­های اقتصادی و اجتماعی خانوارهای ساکن در روستاهای مرزی با سایر روستاهای سیستان اختلاف معناداری وجود دارد.

کلید واژه ­ها: خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد، روستا، توانمندسازی، تحلیل فضایی، سیستان.

 فصل اول: مقدمه و کلیات تحقیق

 

 

 

 

 

 

 

1-6-1- مطالعات خارجی.. 9

1-6-2- مطالعات داخلی.. 11

 

فصل دوم: مبانی نظری تحقیق

 

 

2-1-1- فضا 15

2-1-2- مکان در ارتباط با فضا 16

2-1-3- سازمان فضایی.. 17

2-1-4- توانمندسازی.. 17

2-1-5- مشاركت… 19

2-1-6- توانمندسازی و بهسازی مشاركتی.. 22

2-1-7- فقر و محرومیت اقتصاد. 22

2-1-8- كارآفرینی روستایی.. 23

2-1-9- توسعه. 23

 

2-2-1- تاریخچه و مبانی نظری مطالعات فقر. 26

2-2-2- دیدگاه های مرتبط با کارآفرینی.. 30

2-2-3- دیدگاه جامعه شناختی و جمعیت شناختی.. 30

2-2-4- دیدگاه روانشناختی.. 31

2-2-5- دیدگاه اقتصادی (کارآفرینی درون تئوری اقتصادی) 31

2-2-6- دیدگاه توسعه ای و محیطی.. 33

2-2-7- دیدگاه نهادی.. 33

 

2-3-1- دیدگاه روانشناختی.. 34

2-3-2- دیدگاه جامعه شناختی.. 34

2-3-3- دیدگاه علوم سیاسی.. 35

 

2-4-1- رویکردهای نظری توانمندسازی.. 36

2-4-2- فرایند توانمندسازی.. 37

2-4-3- چارچوب توانمندسازی.. 38

2-4-4- حوزه های توانمندسازی مددجویان.. 40

2-4-5- ساماندهی افراد و ایجاد تشکل.. 42

 

 

2-4-6- رویكردهای سازمانی.. 43

2-4-7- نظریه های گونه ی اول. 44

2-4-8- نظریه های گونه ی دوم. 45

2-4-9- نظریه های گونه ی سوم. 45

2-4-10- نظریه های گونه ی چهارم. 45

2-4-11- نوع شناسی کمیته امداد امام خمینی (ره) 46

2-4-12- اهمیت موضوع توانمندسازی در کمیته امداد امام خمینی (ره) 48

2-4-13- جایگاه کمیته امداد در توانمندسازی مددجویان تحت پوشش این نهاد. 49

2-4-14- توانمندسازی مددجویان.. 50

2-4-15- عوامل موثر بر توانمندسازی خانواده های تحت حمایت کمیته امداد. 51

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

 

3-1-1- موقعیت، حدود و وسعت منطقه مورد مطالعه. 56

3-1-2- توپوگرافی و ژئومورفولوژی.. 58

3-1-3- اقلیم. 59

3-1-4- منابع آب.. 64

 

3-2-1- جمعیّت و ویژگیهای آن.. 70

 

 

3-4-1- روش پژوهش…. 76

3-4-2- جامعه آماری و تعداد نمونه. 77

3-4-3- شاخصهای تحقیق.. 80

3-4-4- روش و ابزار گردآوری داده ها و اطلاعات.. 83

3-4-5- شیوه تجزیه و تحلیل داده‎ها 83

3-4-6- مدل تصمیم‎گیری چند شاخصه (MCDM) 84

3-4-7- فرایند تحلیل سلسله مراتبی (AHP) 86

3-4-8- روایی و پایایی ابزار تحقیق.. 90

 

فصل چهارم: یافته­ های تحقیق

 

 

4-1-1- وضعیت سنی پاسخگویان.. 94

4-1-2- وضعیت جنسی.. 96

4-3-1- وضعیت سواد. 96

 

4-2-1- علل قرار گرفتن تحت پوشش کمیته امداد. 98

4-2-2- روند تغییرات خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد. 99

4-3-3- شدت اثرات موانع یا محدودیتهای مطرح در توانمندسازی خانوارهای روستایی………………………..103

 

فصل پنجم: جمع­بندی و نتیجه گیری

 

 

 

فصل ششم: فهرست منابع

1-6- منابع ……………………………………………………………………………………………………………………………….121

1- مقدمه

فقر به عنوان یكی از مباحث مهم در ادبیات توسعه مطرح و زدودن فقر از یک جامعه یكی از اهداف اصلی توسعه­ اقتصادی است (خالدی و پرمه، 1384: 57). بانک جهانی دلایل فقر اقتصاد روستایی را در عواملی چون پایین بودن میزان درآمد سرانه، بازدهی كم زمین و فرصت­های محدود شغلی بر شمرده­اند و دلایل فقر اجتماعی روستایی را در سطح پایین سواد و بالا بودن بعد خانوار كه خود كاهش پس­انداز و صرف هزینه هنگفت برای بهداشت، آموزش، مصرف غذایی و مسكن را به دنبال دارد می­داند (رحیمی­سوره و رضوی، 1375: 281). بنابراین تامین رفاه اجتماعی از جمله مهم­ترین اهداف هر نظام اقتصادی است و فراهم نمودن شرایط مناسب برای زندگی تمامی اقشار جامعه وظیفه­ی اصلی كارگزاران و مسئولان اقتصادی كشور تلقی می­ شود. از این روست كه تغییر در رفاه اجتماعی یا هم زمان با آن تغییر در فقر از جمله زمینه ­های ارزیابی نظام­های اقتصادی به شمار می ­آید (فرج­زاده،1382: 10).

یكی از مهم­ترین اهداف تشکیل دولت­ها فراهم ساختن رفاه و توسعه برای جامعه است. فرایند توسعه همواره كنش دولت را در بر دارد. در نوشتارهای توسعه كشورهای جهان سوم، در مورد اهمیت دولت برای پیشبرد فرایند توسعه توافق كلی وجود دارد و به عنوان یكی از نیروهایی تلقی می­ شود كه نقش زیادی در فرایندهای تغییر این جوامع، از جمله در زمینه تغییر روستایی ایفا می­كند (دوفومیه، 1373: 18). از این رو ماهیت دولت­ها، فلسفه سیاسی و ایدئولوژیكی و ساختار آنها نقش اساسی در فرایند توسعه و از جمله توسعه روستایی دارد (شكوری، 1384: 51).

توسعه روستایی، از برنامه ­های توسعه هر كشور به شمار می­رود كه برای دگرگون­سازی ساخت اقتصادی- اجتماعی جامعه روستایی به كار می­رود. این برنامه­ها توسط دولت و كارگزاران آن، در مناطق روستایی به اجرا در می­آیند. دولت­ها برای دستیابی به این اهداف از ابزارهای مختلف و متفاوتی استفاده می كنند كه این موضوع در مورد دولت ایران نیز مصداق دارد.

در ایران دولت به منظور دستیابی به توسعه روستایی از ابزارهای مختلف استفاده كرده و اقدامات متعددی را به مرحله اجرا درآورده است. از جمله این اقدامات پس از انقلاب می­توان تشکیل نهادهایی همچون جهاد سازندگی، بنیاد مسکن انقلاب اسلامی و کمیته امداد امام خمینی را نام برد. هدف از ایجاد این نهادها عمران، آبادانی مناطق عقب مانده از توسعه و کمک به اقشار محروم جامعه علی­الخصوص نقاط روستایی فاقد امکانات بود.

در این میان کمیته امداد به عنوان نهادی شناخته می­ شود که به توانمندسازی خانوارهای محروم و آسیب­پذیر جامعه چه در نقاط شهری و چه روستایی می ­پردازد و نقش آن در مناطق روستایی با توجه به ماهیت اقتصادی- اجتماعی این نقاط پر رنگ­تر است.

با توجه به اهمیت موضوع در این پایان نامه تلاش بر این است تا موانع و محدودیت­های توانمندسازی اقتصادی و اجتماعی خانوارهای روستایی تحت پوشش کمیته امداد مورد بررسی قرار گیرد تا در نهایت راه­کار­های مناسب جهت تقویت و توانمندسازی این قشر از جامعه ارائه گردد. این پژوهش در قالب پنج فصل سازمان یافته است که:

در فصل اول؛ چارچوب پژوهش همراه با طرح مساله، ضرورت و اهداف پژوهش، فرضیات پژوهش و برخی از تجربیات گذشته در قالب پیشینه پژوهش بیان گردیده است.

در فصل دوم؛ مباحث نظری پژوهش پیرامون موضوع تحقیق در قالب نظریات و دیدگاه ­ها مورد بررسی قرار گرفته است.

در فصل سوم؛ متدولوژی و روش­های مورد استفاده در پژوهش و همچنین منطقه مطالعاتی از جنبه­ های طبیعی و انسانی مورد بررسی قرار گرفته و چشم­انداز وضع موجود ترسیم و بیان گردیده است.

فهرست مطالب

عنوان                                                                 صفحه

فصل اول: مقدمه ..1

مقدمه: 2

فصل دوم: کلیات و مروری بر مطالعات گذشته….8

2-1- تاریخچه. 9

2-2- طبقه بندی.. 15

2-3- ساختمان ویریون. 16

2-4- ساختمان و سازماندهی ژنوم. 16

2-5- تکثیر ویروس… 18

2-5-1- اتصال ورود ، پوشش برداری.. 19

2-5-2- پروموترهای ویروسی و تنظیم نسخه برداری.. 19

2-5-3 – سرهم بندی و رها شدن ویروس… 21

2-5-4- همانند سازی DNA ویروس… 21

2-6- الحاق DNA ویروسی در ژنوم انسان. 23

2-7- پروتئین های ویروسی.. 24

2-7-1- پروتئین های اولیه E1 تا E6.. 24

2-7-2- پروتئین E7.. 25

2-7-3- پروتئین های L1 و L2.. 28

2-8- تیپ بندی پاپیلوماویروس ها 29

2-9- بیماری زایی.. 29

2-9-1- عفونت پوستی.. 30

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

2-9-4- سرطان مقعد. 31

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

2-9-6- HPV در کودکان. 34

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

2-12- تشخیص…. 38

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

2-14-  درمان. 44

2-15- پیشگیری.. 45

2-16- واکسیناسیون. 46

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

2-17-4-  DNA واکسن ها 56

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

2-23-ادجوانت ها 86

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

2-25-کلونینگ ژن. 90

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

2-27- حامل های کلونینگ… 91

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

 

 

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

2-40-1 -فرضیات.. 103

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

 

فصل سوم: مواد و روش ها…104

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

3-10- SDS-PAGE. 114

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV  واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

3-16-1- انتقال در تانک… 124

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV  واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

3-23- روش برادفورد. 136

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

3-28-ادجوانت‌ فروند ناقص…. 139

3-29-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها 140

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

 

فصل چهارم: نتایج ….144

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش      SDS-PAGE.. 159

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 165

5-2-پیشنهادات و چشم اندازها 168

 References      …169

ضمائم:

فهرست اشکال :

شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….16

شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..18

شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..18

شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..30

شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….41

شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99

شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………151

شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و  E11 تا E20  برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………157

شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین  ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..158

ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………159

شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است……………………………………………..161

شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است…………..162

فهرست جداول:

جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53

جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………61

جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..62

ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..72

ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75

ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB  ……………………………………………………………………………80

جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105

جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………141

جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با بهره گرفتن از سرور BCPREDS……………….149

جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45………..150

جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان  می دهد…………………………………………………………153

جدول4-4. 20  اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2  ………………………………………………………………154

جدول 4-5. نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه……………………………………………………………………………..156

فهرست نمودار ها :

نمودار 4-1. نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروه های تجربی…………………………………………………………………….163

خلاصه

سرطان گردن رحم بعد از سرطان سینه دومین سرطان شایع زنان در سراسر جهان می باشد. بیش از 90% سرطان های گردن رحم ، واجد پاپیلوما ویروس های انسانی  (HPV)هستند. بیش از 100 نوع مختلف پاپیلوما ویروس انسانی وجود دارد که بیش از 40 گونه ژنوتیپی  این ویروس ها، عفونت زا هستند و از آن میان حدود 15 ژنوتیپ، کارسینوژن هستند که تحت عنوان ژنوتیپ های high-risk نام برده        می شوند و ژنوتیپ 18 و  16 در بین آنها عامل بیش از 90 % سرطان های مرتبط با این ویروس هستند.  پروتئین کپسید L1 پاپیلوما ویروس ها زمانی که در سیستم های بیان کننده پروتئین های یوکاریوتی و پروکاریوتی بیان می شوند ذرات ویروسی مانند  غیر عفونی را تشکیل می دهند که باعث القاء پاسخ آنتی بادی خنثی کننده ضد HPVs می شوند. این پروتئین اکنون نیز به عنوان واکسن استفاده         می شود و احتمالا وجود پروتئین2 L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند، هرچند که              اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنش های متقاطع را به خوبی القا     می نمایند. در حال حاضر واکسن هایی که برای ویروس HPV وجود دارد، نمی تواند تمام سروتیپ های پر خطر آن را پوشش دهد و از لحاظ قیمت نیز پر هزینه است.

در تحقیق حاضر طراحی یک واکسن یونیورسال چند اپی توپی برای پروتئین های ساختمانی اصلی ویروس های HPV که شامل  L1/L2 است با بهره گرفتن از استراتژی های  ایمونو انفورماتیک در بررسی 6 نوع پرخطر ویروس HPV سویه های 6،11،16،18،31،45، تلاش در طراحی و ساخت واکسنی شده است که این سروتیپ ها را پوشش دهد ، در این خصوص اقدام به شناسایی بهترین اپی توپ های برانگیخته کننده لنفوسیت هایB ، برای پیشگیری از وقوع  بیماری های مرتبط در جهت مطالعه به عنوان کاندید یونیورسال واکسن شد به این ترتیب با در نظر گرفتن بیشترین سطح تحریک شوندگی لنفوسیت های B- اپی توپ های پروتئین های کپسیدی L1 وL2، از نظر قابل دسترس ترین  اپی توپ ها با توجه به طراحی سه بعدی آن ها، در نظر گرفتن نواحی N گلیکوزیله شده، هیدروفیلیسیته و آنتی ژنسیته، بهترین اپی توپ ها شامل بیست اپی توپ بیست  اسید آمینه ای انتخاب و پس از آنالیزهای مثبت، ساختار نهایی مشتمل بر چهارصد اسید آمینه به صورت DNA طراحی  شد و به صورت 1200 نوکلئوتید ترجمه معکوس گردید، سپس در جهت بهترین بیان در E.coli بهینه سازی شد. آنزیم های برش گر BamHI و HindIII به ابتدا و انتهای توالی اضافه و سپس در غالب یک ساختار ژنی در کنار یکدیگر قرار داده شد. ژن طراحی شده مذکور ، توسط شرکت بیوماتیک سنتز شده و در پلاسمید pET28a کلون گردید. پس از دریافت پلاسمید مذکور، در سلول های E.coli BL21DE3 ترانسفرم گردید. بیان پلاسمید نوترکیب در سلول های باکتری با اضافه نمودن 1میلی مولار IPTG در طول 4 ساعت کشت انجام شد و سپس پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی   Ni-NTA خالص شد و خلوص با تکنیک SDS-page تائید شد و سپس در برابر آنتی بادی anti-His در وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. جهت بررسی ایمنی زایی، واکسن کاندید همراه با ادجوانت فروند ناقص همراه با گروه کنترل  PBS به گروه های موشی  BALB/c (n=6 ) دو بار و به فاصله 2 هفته بصورت زیر پوستی تزریق شدند که میزان تزریق در هر سری 10 میکروگرم بود. یک هفته پس از دومین واکسیناسیون موش ها ،توتال آنتی بادی ها به روش الایزای غیر مستقیم ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که واکسن کاندید تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص شده به وسیله ی Ni-NTA، یک باند در حدود 45 کیلو دالتون در وسترن بلات نشان داد. همچنین واکسیناسیون با واکسن کاندید یونیورسال بر پایه ی L1/L2 HPVs  منجر به افزایش قابل توجه در پاسخ ایمنی همورال در مقایسه با گروه کنترل شد.

واژه های کلیدی : پاپیلوما ویروس انسانی، پروتئین کپسید L1 و L2 ، چند اپی توپی، یونیورسال واکسن

فصل اول

 

مقدمه

پاپیلوما ویروس ها، گروهی از ویروس های DNA دار هستند که باعث ایجاد زگیل  یا پاپیلوم در انواعی از مهره داران عالی از جمله انسان ها می شوند. همچنین بعضی از پاپیلوما ویروس ها می توانند در حیوانات و انسان ها بدخیمی

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………1

فصل اول: کلیات                                                                                           

1-1- سرطان……………………………………………………………………………………………………………………………….3

1-2- علل سرطان………………………………………………………………………………………………………………………..3

1-3- خصوصیات سلول توموری…………………………………………………………………………………………………..5

1-4- روش ‌های درمان سرطان……………………………………………………………………………………………………..6

1-5- تاریخچه ی شیمی درمانی…………………………………………………………………………………………………. 6

1-6- مقاومت دارویی…………………………………………………………………………………………………………………..7

1-7-1- داروهای آلکیله کننده………………………………………………………………………………………………………8

1-7-2- آنتی متابولیت‌ها……………………………………………………………………………………………………………..8

1-7-3- هورمون‌ها……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-7-4- فراورده‌‌های گیاهی………………………………………………………………………………………………………….9

1-7-5- آنتی بیوتیک‌های ضدسرطان…………………………………………………………………………………………..10

1-7-5-1- اکتینومایسین…………………………………………………………………………………………………………..11

1-7-5-1-1- داکتینومایسین……………………………………………………………………………………………………..11

1-7-5-2-آنتراسیکلین………………………………………………………………………………………………………………13

1-7-5-2-1-دانوروبیسین………………………………………………………………………………………………………….14

1-7-5-2-2-دوکسوروبیسین هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

1-7-5-5- میتومایسین‌ها……………………………………………………………………………………………………………21

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

1-9-اکتینومیست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

1-9-1-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها………………………………………………………………………………….30

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33         

فصل دوم: پیشنه‌ی تحقیق                                                                                               

فصل سوم: مواد و روش­ها                                                                                              

3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

3-3- سویه‌های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

3-5- آماده‌سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

3-6- آماده‌سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

3-9- تولید متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………………45

3-10- استخراج متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………45

3-11- نگهداری عصاره‌ها………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

 

 

3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

ژوهش……………………………………………………………………….54

3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55

3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

3-19-  مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63

فصل چهارم: نتایج                                                                                                       

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

4-5- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74

4-6- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      

 منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                  صفحه

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27

جدول ‏1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها 29

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها 32

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

جدول ‏3‑2:دستگاه‌های استفاده شده 42

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

جدول ‏3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. 64

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها 70

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                  صفحه

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73

فهرست اشکال                           صفحه

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54

شکل ‏4‑1: تصاویر مربوط به بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار سلول A549 با عصاره باکتری‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….73

شکل ‏4‑2: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74

شکل ‏4‑3: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74

شکل ‏4‑4: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74

شکل ‏4‑5: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75

شکل ‏4‑6: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 638. 75

شکل ‏4‑7: مربوط به استخراج DNA اکتینومیست‌های منتخب… 76

شکل ‏4‑8: مربوط به استخراج ژن 16S rRNA می‌‌باشد. 77

فهرست پیوست‌ها

پیوست‏4‑1.. 102

پیوست‏4‑2.. 102

پیوست‏4‑3.. 106

پیوست‏4‑4. 121

 

چکیده

در این پژوهش توان تولید ترکیبات ضد سرطان ریه در اکتینومیست‌های بومی ایران که در مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران(UTMC) نگهداری می‌شوند مورد بررسی قرار گرفت.

ابتدا 40 سویه اکتینومیست که در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شدند به صورت تصادفی انتخاب شدند و مراحل اسپورزایی، پیش تخمیر و تخمیر آنها انجام شد. میزان سمیت عصاره‌های استخراج شده به دو روش  تست آرتمیا (assay Brine Shrimp) و تست رنگ سنجی (MTT) برروی دودمان سلولی A549 سنجیده شد. پنج سویه UTMC 863،UMC 877 ،UTMC 919 ، UTMC 638، UTMC 676 اثرات کشندگی روی دودمان سلولی A549 داشتند که نتایج تست سلولیMTT، نتایج بررسی ریخت شناسی سلولی را نیز تایید کرد. پنج سویه منتخب تحت شناسایی مورفولوژیک و مولکولی قرار گرفتند. نتایج این بررسی نشان داد که سویه UTMC 676 دارای 86/99% شباهت به Streptomyces aureoverticillatus (شماره دسترسی AY999774) و سویه UTMC 638 دارای 78/98% شباهت به Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi (شماره دسترسی AB184115) همچنین سویه های UTMC 863 وUTMC 877 به ترتیب دارای

فهرست مطالب

چکیده—————– 1

فصل اول

مقدمه—————– 2

فصل دوم

بررسی و مرور منابع— 5

2-1- تاریخچه زنبور عسل و پرورش آن در جهان و ایران———– 6

2-2- ارزش اقتصادی زنبور عسل—– 8

2-3- جایگاه سیستماتیک زنبور عسل-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 9

2-4- اصلاح نژاد در زنبور عسل—– 10

2-5- ژنوم زنبور عسل————— 12

2-6- تعریف نشانگر—————– 13

2-6-1- نشانگرهای مرفولوژیک—- 13

2-6-1-1- نشانگرهای مرفولوژیک و زنبور عسل-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 14

2-6-2- نشانگرهای مولکولی——- 16

2-7- نشانگرهای مولکولی و حشرات-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 17

2-8- کاربرد اصلی نشانگرهای مولکولی در مطالعات اکولوژیکی حشرات———- 18

2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبان-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 19

2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 21

2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها—– 22

2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئید-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 23

2-8-5- سیستماتیک مولکولی—– 24

2-8-6- حشرات تراریخته———- 25

2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده———— 26

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری— 30

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 31

2-11-1- نمونه DNA————— 32

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 32

2-11-3- روش کشف————— 33

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR—- 34

2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکی—- 34

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 34

2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکی——– 34

2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)———- 35

2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 35

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————— 36

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 37

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 38

فصل سوم

مواد و روش‌ها——– 40

3-1- جمع آوری نمونه‌ها———— 41

3-2- استخراج DNA زنبور عسل— 43

3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 45

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 45

3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 46

3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت  ng/µl25—— 47

3-4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 47

3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 49

3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR———— 50

3-7- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل————- 51

3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه‌های ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 54

3-9- روش های گروهبندی داده ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 55

 

 

3-10- تجزیه خوشه ای————- 56

3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک———– 56

3-12- تجزیه به مولفه های اصلی— 57

3-13- آنالیز داده‌های مولکولی—– 58

3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی—- 58

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی——– 60

3-16- آنالیز داده‌های مورفولوژیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 61

فصل چهارم

نتایج—————– 62

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——– 63

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایرانبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 63

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران—————- 64

4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—— 65

4-5- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مرفومتریکبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 66

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—— 67

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه– 72

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل—————- 72

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—— 73

4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—- 74

4-11- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مولكولی– 74

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسلبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 76

4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل در زنبورهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 77

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک————— 78

فصل پنجم

بحث و نتیجه‌گیری— 79

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 81

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه————- 87

پیشنهادات:———- 90

منابع—————– 91

فهرست جداول

جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

جدول 3-2 مواد واكنش، ‌حجم و غلظت نهایی اجزای واكنش زنجیره پلیمراز 48

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده 59

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل- 65

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی  و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه- 72

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل  بر اساس نشانگر ISSR- 74

جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

فهرست اشکال

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل- 41

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل- 42

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات– 43

شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات– 44

شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد- 46

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA- 47

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجیره‌ای پلیمراز 49

شکل 3-8: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات– 49

شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات– 50

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز 50

شکل 3-11: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR- 51

شکل 3-12: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز- 51

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده 60

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr   66

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با بهره گرفتن از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی- 67

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1  با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 69

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 70

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 70

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 71

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با بهره گرفتن از مارکر bp 50- 71

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73

شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده 73

شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-12: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل 77

شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی- 78

فهرست معادلات

معادله 3-1: محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-2: میزان چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-3: ارزشمندی باندها 53

معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-5: میانگین قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر- 53

معادله 3-7: شاخص نشانگری- 54

معادله 3-8: ضریب تشابه جاکارد- 55

 

چکیده

نشانگر مولکولی ISSR به منظور جداسازی نژادهای زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهای كارگر با بهره گرفتن از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیق سازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد نمره‌دهی و آنالیز صورت گرفت. نتایج نشان داد که باندهای آغازگرهای مورد مطالعه شده

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

فصل اول مقدمه

میکروبیولوژی هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………………………..1

مطالعات ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………………………2

جهش در ژنهای کد کننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول……….4

نقشه ژنتیکی………………………………………………………………………………………………………………………5

تولید مثل واسپورزایی………………………………………………………………………………………………………….6

اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………………………………6

پروموتورهای مورد استفاده در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11………………………………………..7

HARS1…………………………………………………………………………………………………………………………..8

بیان همزمان……………………………………………………………………………………………………………………….9

ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال……………………………………………………………………..10

تولید واکسن نوترکیب……………………………………………………………………………………………………….10

مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی………………………………………………………………………..11

ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBS………………………………………………………11

تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی………………………………………………………………………………….11

انتقال وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………12

جداسازی سویه های نوترکیب…………………………………………………………………………………………….12

تنظیم متابولیسم متانول……………………………………………………………………………………………………….12

فاکتور محرک رشد کلنی (G-CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

 

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با بهره گرفتن از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی  pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

 

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

 

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR  اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR  اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست

فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66

پیوست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………75

 

مقدمه

تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده  با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.

هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.

مواد و روش ها

cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده  مربوط به هانسونلا پلی مورفا  که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.

نتایج

ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با بهره گرفتن از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.

بحث

پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.

کلید واژه ها

هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک

فصل اول : مقدمه

در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:

1. رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
2. تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
3. تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.

1-1میکروبیولوژی هانسونلا

این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.

سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.

تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha

هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).