شناسایی اینتگرون های کلاس 1و2 در جدایه های اشریشیاکلای طیور گوشتی استان فارس

 

اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند. کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرون‌ها شناسایی شده اند، معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند. مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان است. لذا هدف از این مطالعه شناسایی اینتگرونهای كلاس 1و2  و بررسی فراوانی آنها درجدایه های اشریشیا كولی طیور گوشتی و ارتباط آنها با مقاومت های چندگانه می باشد.

بدین منظور در ابتدا 300 نمونه‌ی اشریشیا کولی از نمونه های مدفوع کلواکی حاصل از 20 فارم طیور گوشتی استان فارس در طی سه مرحله‌ی، یک روزگی، 25-35 روزگی و پایان دوره (قبل کشتار) جداسازی گردید و آزمایش حساسیت آنتی بیوتیکی با بهره گرفتن از روش انتشار دیسک انجام شد.  در مجموع 139جدایه دارای مقاومت چندگانه  (38 نمونه مرحله اول، 55 نمونه مرحله دوم، 46 نمونه مرحله سوم) جهت بررسی حضور ژن های اینتگراز 1 و 2 به عنوان شاخص حضور اینتگرون ها بوسیله PCR مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج نشان داد که هر دو نوع اینتگرون در میان جدایه های مورد مطالعه حاصل از طیور، حضور دارد. به نحوی که فراوانی اینتگراز 1 (7/67% ؛ 139/94)، از فراوانی اینتگراز 2 (9/20% ؛ 139/29) بالاتر بوده و فراوانی حضور همزمان هر دو اینتگراز 6/8% (139/12) تعیین شد. فراوانی اینتگراز 1 در مراحل اول تا سوم نمونه‌گیری به ترتیب 4/68% (38/26)، 7/72% (55/40) و 9/60% (46/28) بدست آمد. فراوانی اینتگراز 2 در مراحل اول تا سوم نمونه گیری به ترتیب 6/2% (36/1)، 5/25% (55/14) و 4/30% (46/14) بود. فراوانی حضور همزمان هر دو اینتگراز طی مراحل اول تا سوم نمونه‌گیری به ترتیب 6/2% (38/1)، 7/12% (55/7) و 7/8% (46/4) تعیین شد. نتایج حاصل از توالی یابی یابی کاست های ژنی نیز حاکی از حضور ژن  orfF و 3 نوع ژن مقاومت به تریمتوپریم (dfrA)، استرپتومایسین (aadA) و اریترومایسین (ereA) بود. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد كه اینتگرون های كلاس 1و2 در جدایه های اشریشیا كولی طیور گوشتی وجود دارد و سبب مقاومت چندگانه در آنها می شود.

فهرست مطالب

 

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

فصل اول: مقدمه و هدف

1-1- مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

1-2- فرضیه ها و اهداف طرح…………………………………………………………………………………………………….. 4

 

فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود

1-2- اشریشیا کولی…………………………………………………………………………………………………………………….. 5

1-1-2-خصوصیات کشت…………………………………………………………………………………………………………… 5

2-1-2-خصوصیات بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………… 6

3-1-2-انتشار و راه های انتقال اشریشیا کولی در طیور………………………………………………………….. 6

2-2-آنتی‌بیوتک‌ها……………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-2-2- تعریف……………………………………………………………………………………………………………………………. 8

2-2-2-سابقه تاریخی………………………………………………………………………………………………………………….. 8

3-2-2-طبقه بندی آنتی‌بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………… 9

4-2-2- استفاده از آنتی بیوتیک در حیوانات مولد غذا ………………………………………………………… 10

1-4-2-2-مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در طیور………………………………………………………………………………. 12

5-2-2- منشاء مقاومت به آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………….. 15

6-2-2- مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیک…………………………………………………………………….. 15

1-6-2-2- تغییر یا جایگزینی اهداف دارو……………………………………………………………………………… 16

2-6-2-2-غیرفعالسازی آنزیمی دارو……………………………………………………………………………………….. 16

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

3-6-2-2- پمپ‌های خارج كننده دارو از سلول……………………………………………………………………… 17

4-6-2-2- کاهش جذب دارو………………………………………………………………………………………………….. 17

5-6-2-2- حفاظت از هدف…………………………………………………………………………………………………….. 18

6-6-2-2- بدام انداختن دارو………………………………………………………………………………………………….. 18

7-2-2- انتشار مقاومت به آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………….. 19

1-7-2-2- وراثت عمودی………………………………………………………………………………………………………… 19

2-7-2-2- انتقال افقی……………………………………………………………………………………………………………… 20

8-2-2- مکانیسم‌های دخیل در انتقال افقی…………………………………………………………………………… 20

9-2-2- عناصر دخیل در انتقال افقی ژن های مقاومت…………………………………………………………. 21

1-9-2-2- پلاسمید‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 21

2-9-2-2- ترانسپوزونها…………………………………………………………………………………………………………….. 22

3-9-2-2- اینتگرون‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 23

10-2- ساختار و ویژگی‌های اینتگرون‌ها…………………………………………………………………………………. 23

1-10-2- کلاس 1 اینتگرون‌ها ………………………………………………………………………………………………. 24

2-10-2- کلاس 2  اینتگرون‌ها………………………………………………………………………………………………. 26

3-10-2- کلاس 3 اینتگرون‌ها……………………………………………………………………………………………….. 27

4-10-2- سوپر اینتگرون‌های کروموزومی یا کلاس4…………………………………………………………… 27

11-2-کاست ژنی………………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11-2- تعریف……………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-11-2- انتقال کاست‌های ژنی………………………………………………………………………………………………. 29

12-2- اپیدمیولوژی اینتگرون‌ها و بر شناسایی اینتگرون‌ها در ماکیان…………………….. 32

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………. 34

2-3- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………… 35

1-2-3- نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………………. 35

2-2-3- آزمون های تاییدی……………………………………………………………………………………………………… 36

3-2-3- آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده برای آنتی‌بیوگرام …………………………………………………… 39

4-2-3- آزمون حساسیت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………………………. 40

5-2-3- روش ساخت نیم مک فارلند……………………………………………………………………………………… 41

6-2-3- نکات مورد توجه در انجام آزمایش آنتی بیوگرام……………………………………………………… 42

 

7-2-3- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام. 43

8-2-3- بررسی حضور مقاومت های چند گانه……………………………………………………………………….. 43

9-2-3- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی …………………………………………………… 44

10-2-3- انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز…………………………………………………………………….. 50

11-2-3- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز 1 و 2……………………………….. 52

12-2-3- الکتروفورز روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………. 53

13-2-3- شناسایی کاست ژنی اینتگرون……………………………………………………………………………….. 54

14-2-3- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاست‌های ژنی اینتگرون کلاس 1……………… 55

15-2-3- تعیین ترادف محصولات………………………………………………………………………………………….. 56

16-2-3- آزمون آماری…………………………………………………………………………………………………………….. 56

 

 

فصل چهارم: نتایج

1-4 نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس 1 و 2…………………………………………………………………….. 57

2-4 نتایج بررسی کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها……………………………………………………………….. 63

3-4 نتایج تعیین توالی کاست‌ ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها………………………………………………………. 65

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………… 67

 

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………………………. 75

 

پیوست ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 89

فهرست جداول

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

جدول1-1: طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر ………………………………………………. 10

جدول 1-3: دستگاه­ها وسائل آزمایشگاهی مورد استفاده……………………………………………………….. 34

جدول 2-3: مواد شیمیایی مورد استفاده…………………………………………………………………………………. 35

جدول 3-3: آنتی‌بیوتیک‌های استفاده شده برای آنتی‌بیوگرام……………………………………………….. 39

جدول4-3: دیسک‌های آنتی‌بیوتیک استفاده شده، مقادیر ماده موثره آن‌ ها

و تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی ………………………………………………………………………. 41

جدول 5-3: خصوصیات روش آزمایش آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن)

بر اساس معیارهای  CLSI (NCCLS)…………………………………………………………………………………… 42

جدول 6-3: اطلاعات  نمونه های کارشده ، گرفته شده  از مزارع گوشتی

شهرستان شیراز…………………………………………………………………………………………………………………………. 45

جدول 7-3: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز 1 واینتگراز 2…… 50

جدول 8-3: برنامه چرخه حرارتی  PCR برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس1 …… 50

جدول9-3: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژن های

اینتگراز 1 و اینتگراز 2……………………………………………………………………………………………………………… 51

جدول10-3: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کاست ژنی

اینتگرون کلاس 1………………………………………………………………………………………………………………………. 51

جدول11-3: غلظت استوک مواد اولیه مورد استفاده در واکنش زنجیره­ای پلیمراز…………….. 51

جدول 12-3: ساخت محلول کار آماده جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی

ژنهای اینتگراز…………………………………………………………………………………………………………………………….. 52

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

جدول 13-3: تهیه بافر TAE 50 بار………………………………………………………………………………………. 53

جدول14-3: ساخت محلول کار آماده جهت انجام  PCR برای شناسایی کاست ژنی

کلاس1 اینتگرون………………………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول 1-4: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی

بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز…………………….. 58

جدول 2-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز1 در جدایه های E. coli

جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی……………………………………………………………. 59

جدول 3-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز2 در جدایه های E. coli

جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی……………………………………………………………. 60

جدول 4-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز 1 و 2

در جدایه های E. coli  جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی……………………. 61

جدول 5-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز1 و ژن اینتگراز2 و حضور

همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli  مورد بررسی در این مطالعه…………. 62

جدول 6-4: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی

کلاس 1 اینتگرون‌ها در محصولات PCR تعیین ترادف شده…………………………………………………. 66

فهرست تصاویر

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

تصویر 1-1 مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک  …………………………………………………… 19

تصویر 2-1 سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی

به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند ………………………………………………………………. 21

تصویر3-1) ساختمان کلی یک اینتگرون ………………………………………………………………………………… 24

تصویر4-1: ساختمان کلی کلاس1 اینتگرون‌ها ……………………………………………………………………… 25

تصویر 5-1: ساختار کلاس 1 اینتگرون‌ یافت شده در Tn402……………………………………………….. 26

تصویر6-1: ساختار اینتگرون کلاس2 موجود در Tn7 …………………………………………………………… 26

تصویر7-1: ساختار اولین اینتگرون کلاس 3 از ژاپن …………………………………………………………….. 27

تصویر8-1: ساختار کاستها همراه اینتگرون ……………………………………………………………………………. 28

تصویر8-1:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون ……………………………………………………. 29

تصویر9-1: مکانیسم ورود و بیان کاست‌های ژنی توسط اینتگرون کلاس1 ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 31

تصویر1-4: تصوی ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………….. 63

تصویر 2-4: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها

با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز……………………………………………………………………… 64

تصویر 3-4: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها

با طول متفاوت پس از از الکتروفورز روی ژل آگارز………………………………………………………………….. 65

فهرست نمودارها

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

نمودار1-4: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی

بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز……………………. 58

نمودار 2-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز 1 در جدایه های E. coli

بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه……………………………………………………. 59

نمودار 3-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز 2 در جدایه های E. coli

بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه………………………………………………….. 60

نمودار 4-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز 1 و 2

در جدایه های E. coli  بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه…………… 61

نمودار 5-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز 1 و ژن اینتگراز 2 و حضور

همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli   مورد  بررسی در این مطالعه        62

مقدمه

 

کشف آنتی بیوتیک ها در اواخر دهه‌‌ی 1920 و آغاز استفاده از آنها در درمان و جلوگیری از عفونت در دهه1940 بدون شک یکی از پیشرفت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های بزرگ پزشکی در 100 سال گذشته است (دیویس، 2007، دیویس و دیویس، 2010). از آن زمان تا کنون آنتی‌بیوتیک‌ها به طور گسترده‌ای در درمان بیماری‌های عفونی انسانها و حیوانات استفاده شده‌اند. آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور به منظور افزایش رشد، درمان، پیشگیری و کوکسیدیواستات استفاده می‌شوند (گوآرداباسی و همکاران، 2008). استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در انسان و حیوانات سبب ایجاد نگرانی‌هایی در مورد توسعه‌ی باکتری‌ های مقاوم  و نیز باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه که یک خطر بالقوه برای جوامع انسانی و حیوانات هستند، شده است، چرا که مقاومت می‌تواند سبب شکست در درمان شود (اریال، 2001).

بر طبق تخمین مرکز” کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) در ایالات متحده آمریکا سالانه در حدود 147000 نفر در کشور آمریکا به علت مقاومت عوامل بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها جان خود را از  دست می دهند. همچنین تخمین زده می شود که استفاده غیر درمانی از آنتی بیوتیک ها در چارپایان اهلی 80% از کل آنتی بیوتیک های استفاده شده در ایالات متحده را شامل می شود.

صنعت طیور دومین صنعت کشور ما محسوب می‌شود. با این حال به علت نبود سیستم نظارتی دقیق، آنتی‌بیوتیک‌ها به شکلی خودسرانه و غیر معقول درطیور صنعتی مصرف می‌شوند. مشکل مهمی که استفاده غیر اصولی از آنتی‌بیوتیک‌ها ایجاد می‌کند، بقایای این داروها در محصولات دامی، خصوصا گوشت ماکیان و تخم مرغ می‌باشد که علاوه بر انتقال به انسان و افزایش فشار بر کبد وکلیه‌ها برای دفع دارو، سبب ایجاد مقاومت در میکروارگانیسم‌های انسانی در اثر مواجهه آنها با این بقایای آنتی‌بیوتیکی می‌شود.

با ظهور باکتریهای مقاوم به چندین آنتی بیوتیک درمان عفونتها در سرتاسر جهان به خطر افتاده است. گرچه به صورت کلاسیک مقاومت را به جهش های کروموزومی نسبت می دهند. اما مقاومت غالبا در ارتباط با قطعات خارج کروموزومی است که از سایر باکتری‌های موجود در محیط کسب می شود که این‌ها شامل انواع مختلفی ازقطعات DNA متحرک، مثل پلاسمیدها، ترانسپوزونها و اینتگرونها هستند. به محض اینکه باکتری‌های دارای مقاومت مستقر شدند، دوام آورده و در سرتاسر جهان پخش می شوند و سبب شکست بالینی در درمان عفونتها و ایجاد بحرانهای بهداشت عمومی می‌شوند (الکسون و لوی، 2007). اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند (استوکس و هال، 1989). اینتگرونها عموما بر اساس توالی پروتئین اینتگراز که عملکرد نوترکیبی را به آنها می‌دهد، طبقه بندی می شوند. بر اساس این توالی اینتگرونهای مقاومت (RIs ) به 5 دسته طبقه بندی شده اند ، که از میان آنها بیشترین حجم مطالعات بر روی کلاس 1 و2 و3  انجام شده است. بیش از 130 کاست ژنی مختلف شناسایی شده است که سبب ایجاد مقاومت به (تقریبا) تمام آنتی بیوتیک ها می شوند (مازل، 2006). کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرون‌ها شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. بنابراین به این اینتگرونها، اینتگرون‌های مقاومت (RIs [1]) یا اینتگرون‌های مقاومت چندگانه دارویی (MRIs [2])گویند (استالدر و همکاران، 2012). ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند (لوراستین هال و همکاران، 2003).

مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از طریق عفونتهای منتقل شونده از راه غذا در نظر گرفته شده است. مسبب آن پاتوژن‌های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا [3] مثل طیور به پاتوژنهای انسانی می‌باشد (باکس و همکاران، 2005). اینتگرونها در سرتاسر جهان در ارتباط با باکتری های گرم منفی توصیف شده اند و شاخصی برای مقاومت آنتی بیوتیکی