فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات مشابه…………………… 1

1-1- خانواده پسود و موناداسه آ…………………………………. 2

1-2- تاریخچه P. aeruginosa…………………………………

1-2-1- خصوصیات مورفولوژیک P. aeruginosa…………………..

1-2-2- خصوصیات رشد………………………………… 5

1-2-3- هوازی‌های اجباریObligate aerobes……………………

1-2-4- مشخصات کشت………………………………….. 6

1-2-5- مواد آلی مورد نیاز……………………………….. 7

1-2-6- محیط‌های کشت………………………………….. 8

1-2-7- پیگمان………………………………… 9

1-2-8- شاخص‌های بیماریزایی در P. aeruginosa……………….

1-2-8-1- پیلی(Pili)……………………………….. 11

1-2-8-2- آلژینات (Alginate) ………………………………..12

1-2-8-3- اندوتوکسین…………………………………. 12

1-2-8-4- پروتئاز‌های خارج سلولی……………………….. 13

1-2-8-5- همولیزین‌ها……………………………….. 15

1-2-8-6- فسفولیپاز ‍C…………………………………

1-2-8-7- رامنولیپیدها ………………………………..15

1-2-9- توکسین‌های خارج سلولی……………………….. 16

1-2-9-1- اگزوتوکسینA…………………………………

1-2-9-2- اگزوآنزیم S…………………………………

1-2-10- لوکوسیدین با وزن ملکولی بالا……………………. 17

1-2-11- سیدروفورها……………………………….. 17

1-2-12- لیپاز……………………………….. 17

1-2-13- سیتوتوکسین……………………………….. 18

1-2-14- پایوسیانین ………………………………..18

1-2-15- سیستم ترشحی نوع III……………………….

1-2-16- اپیدمیولوژی…………………………………. 19

1-2-17- بیماریهای ناشی از P. aeruginosa……………..

1-2-17-1- باکتریمی…………………………………. 20

1-2-17-2- عفونت‌های گوش…………………………………… 20

1-2-17-3- عفونت‌های چشم…………………………………. 21

1-2-17-4- عفونت‌های مجرای تنفسی……………………….. 21

1-2-17-5- عفونت‌های استخوان و مفصل……………………….. 22

1-2-17-6- عفونت‌های سیستم عصبی مرکزی……………… 22

1-2-17-7- عفونت‌های دستگاه گوارش…………………………. 22

1-2-17-8- عفونت‌های پوست و بافت نرم……………………….. 23

1-2-17-9- عفونت‌های دستگاه ادارای……………………………. 24

1-2-17-10- باکتریمی…………………………………. 24

1-2-17-11- عفونتهای استخوان و مفصل………………………….. 24

1-2-17-12- عفونت‌های سیستم عصبی مرکزی………………. 24

1-2-17-13- اندوکاردیت عفونی…………………………………. 25

1-2-17-14- عفونت‌های مجرای تنفسی………………………….. 25

1-2-17-15- عفونت پوست و بافت‌های نرم……………………… 26

1-2-17-16- عفونت‌های ادراری………………………………..26

1-2-18- متالوبتالاکتاماز……………………………….. 27

1-2-19- شیوع مقاومت متالوبتالاکتامازها…………………. 27

1-2-20- انواع  تیپ‌های متالوبتالاکتاماز………………………. 28

1-2-21- The Imipenemase(IMP) Type……………………………

1-2-22- The Veronese Imipenemase (VIM) Type……………………

1-2-23- New Delhi Metalo β-lactamase-1 (NDM-1) Type…………..

1-2-24-  دیگر تیپ‌های متالوبتالاکتاماز………………………………..29

1-2-24-1- روش‌های تشخیص متالوبتالاکتاماز……………………… 29

1-2-24-2- سنجس حساسیت) آنتی بیوگرام) ……………………….29

1-2-24-3- روش E.Test به وسیله نوار MBL………………………….

مروری بر مطالعات گذشته………………………………… 31

فصل دوم: مواد و روش‌ها……………………………….. 34

2-1 بیان مسئله و اهمیت موضوع………………………………… 35

2-2- اهداف………………………………….. 36

 

 

2-2-1- اهداف اصلی طرح…………………………………. 36

2-2-2- اهداف ویژه طرح…………………………………. 36

2-3- سؤالات و فرضیات………………………………….. 36

2-4- نوع و روش مطالعه………………………………… 37

2-5- روش کار……………………………….. 37

2-5-1- انواع محیط کشت………………………………….. 37

2-5-2- مکانکی آگار(Mac Conkey agar)………………….. 37

2-5-3- محیط کشت  SIM………………………………….

2-5-4- روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول………….. 39

2-5-5- محیط کشت OF…………………………………

2-5-6- محیط کشت TSI………………………………..

2-5-7- محیط سیمون سیترات………………………………..40

2-5-8- محیط مایع( ( MR-VP…………………………………

2-5-9- طرز تهیه معرف VP…………………………………

2-5-10- طرز تهیه معرف MR…………………………………

2-5-11- تست اکسیداز……………………………….. 41

2-6- روش اجرای کار……………………………….. 42

2-6-1- جمع آوری نمونه‌ها……………………………….. 42

2-6-2- تعیین آنزیم متالوبتالاکتاماز…………………….. 43

2-6-3- آنالیز آماری…………………………………. 44

2-6-4- محدودیت و مشکلات اجرایی طرح……………… 44

2-7- جدول متغیرها……………………………….. 45

فصل سوم: یافته‌ها……………………………….. 46

3-1- نتایج…………………………………. 47

فصل چهارم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات………… 69

4-1- بحث………………………………….. 70

4-2- نتیجه گیری…………………………………. 75

4-3- پیشنهادات………………………………….. 75

Abstract…………………………………

فهرست مراجع…………………………………. 77

ضمیمه: پرسشنامه………………………………… 84

چکیده:

مقدمه و هدف: متالوبتالاکتامازها (MBL) آنزیم‌هایی هستند که توسط باسیل‌های گرم منفی غیر تخمیری مانند سودوموناس آئروژینوزا تولید شده و این سویه‌ها را نسبت به کارباپنم مقاوم می‌سازد در نتیجه سودوموناس‌های حامل ژنهای متالوبتالاکتاماز یک تهدید کلینیکی جدی بشمار می‌آیند. با توجه به اینکه مقاومت در گونه باکتریایی سودوموناس آئروژینوزا به واسطه داشتن متالوبتالاکتامازها در برابر آنتی بیوتیک‌ها رو به افزایش بوده و در کشورها، مناطق و حتی بیمارستان‌های مختلف شیوع آن‌ ها متفاوت می‌باشد بر آن شدیم تا شیوع این آنزیم را در نمونه‌های جمع آوری شده از بیمارستان‌های آموزشی یزد با بهره گرفتن از روش E Test بررسی کنیم.

مواد و روش‌ها: جامعه مورد بررسی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا جدا شده از بیمارستان‌های دانشگاهی استان یزد در سال‌های 92-91 می‌باشد. این مطالعه از نوع مطالعه ای توصیفی-تحلیلی از نوع مقطعی می‌باشد و ایزوله‌های سودوموناس با بهره گرفتن از آزمایشات بیوشیمیایی تعیین هویت گردیده و سنجش حساسیت به آنتی بیوتیک‌ها به روش دیسک دیفیوژن انجام شده و جهت تایید وجود آنزیم MBL در سویه‌ها از روش  E.  Testاستفاده شد .

نتایج: در این مطالعه 100 نمونه سودوموناس آئروژینوزا مورد بررسی قرار گرفت.31 نمونه(31 درصد) از کل نمونه‌ها مولد متالوبتالاکتامازها بودند. بین بازه های سنی ، جنس و نوع بخش باتولید MBL توسط ایزوله های سودوموناس آئروژینوزا  ارتباط معنی داری وجود نداشت (P.value> 0.05). فراوانی این آنزیم بترتیب در ایزوله های جدا شده از نمونه های زخم سوختگی(3/56 درصد)، ادرار(4/36 درصد)، ترشح خلط(2/22 درصد) ،  خون و کاتتر(04/19 درصد) و زخم(7/16 درصد) مشاهده شد. ارتباط معنی داری بین نوع نمونه و تولید انزیم متالوبتالاکتاماز دیده نشد. سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا بیشترین مقاومت را به ترتیب نسبت به کوتریموکسازول(85 درصد)، سفتازیدیم(83 درصد) و سفوتاکسیم(79 درصد) نشان دادند. همچنین بیشترین حساسیت سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا به آنتی بیوتیک‌های سیپروفلوکساسین(55 درصد)، جنتامایسین(52 درصد) و پیپراسیلین(41 درصد)داشتند.

نتیجه گیری: در این مطالعه بین سن و جنس و نوع بخش با فراوانی آنزیم متالوبتالاکتامازها ارتباط معناداری یافت نشد. بیشترین فراوانی این آنزیم در نمونه‌های  زخم سوختگی و در  بخش سوختگی به دست آمد. بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی به ترتیب به کوتریموکسازول ، سفتازیدیم و سفوتاکسیم و بیشترین حساسیت به سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و پیپراسیلین بود. نتایج نشان دادکه این ایزوله ها  علاوه بر کارباپنم ها نسبت به بسیاری از آنتی بیوتیک ها بخصوص سفاسپورین ها مقاوم هستند، لذا لازم است قبل از شروع درمان سنجش حساسیت انتی بیوتیکی و غربالگری این آنزیم  انجام شود.

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات مشابه

1-1- خانواده پسود و موناداسه آ

اعضای خانواده پسود وموناداسه آ، باسیل‌های گرم منفی متحرک با تاژک‌های قطبی هستند. اکسیداز مثبت بوده و در محیط‌های کشت ساده رشد می‌کنند. باکتری‌های پسودوموناس باکتری‌های خاکزی هستند که در خاک سبب ترشح سیدروفور شده و جذب آهن و برخی دیگر از عناصر ریزمغذی نظیر روی را امکان‌پذیر می‌سازد. بر خلاف جنس‌های متعدد، تنها ایزوله‌های مطرح در بالینی اعضای پنج جنس زیر می‌باشند: Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter و Moraxella [1]. بر اساس تشابه RNA  ریبوزومی (rRNA)، سود وموناداسه آ را به 5 گروه تقسیم کرده اند که تنها سه گروه V , II , I پاتوژن‌های انسانی هستند [2]. باکتریهای جنس پسودوموناس، به شکل میله‌ای راست یا کمی خمیده، دارای تاژک قطبی، بدون اسپور و گرم منفی می‌باشند. این باکتری‌ها هوازی و از نظر منبع انرژی و کربن کموارگانوتروف‌ هستند. از نظر نیازهای غذایی گونه‌های پسودوموناس نیاز غذایی بسیار ساده ای دارند. در شرایط آزمایشگاهی در محیط‌های حاوی مقداری ماده آلی در pH خنثی بخوبی رشد می‌کنند. متابولیسم گونه‌های پسودوموناس تنفسی بوده وحالت تخمیری ندارند. این باکتریها قادرند از 150 ترکیب آلی بعنوان منبع کربن وانرژی استفاده نمایند [3].

جنس پسودوموناس دارای 57 گونه است، که بسیاری از آنها بیماریزا نیستند. گونه‌های پسودوموناس در دو گروه فلوئورسنت و غیر فلوئورسنت دسته بندی می‌شوند، که P. aeruginosa ، P.fluorescens و  P.putida در گروه فلوئورسنت و  P.stutzeri  و P.mendocina در گروه غیر فلوئورسنت جای می‌گیرند. گونه‌های P.fluorescens و  P.putida، گاه در آبزیان عفونت پدید می‌آورند. ولی نام آشناترین آنها، P. aeruginosa است که در سطح پوست و غشاهای مخاطی و مدفوع وجود دارد و بیماریزای فرصت طلب در میزبانانهای گوناگونی است [4].

2-1- تاریخچه P. aeruginosa

سال‌ها قبل از آنکه P. aeruginosa شناخته شود، پزشکان ، مشاهده چرک متمایل به رنگ آبی- سبز را نشانه ای مهم برای وخیم بودن عفونت تلقی می‌کردند. اولین بار در سال 1850 میلادی، Sedillot حضور لکه‌های رنگی آبی- سبز را بر روی لباس جراحان مورد توجه قرار داد.  اما به علت اصلی آن پی نبرد، تا آنکه در سال 1860 میلادی، Fordos موفق به استخراج  رنگ دانه از این باکتری شد و ماده کریستالی بدست آمده از آن را پایوسیانین نامید. در سال 1862 میلادی، Luke این لکه‌های رنگی را در ارتباط با عفونت اعلام کرد و اظهار داشت که عناصر میله ای شکلی را در این چرک‌های آبی- سبز مشاهده کرده است. در سال 1882 میلادی، Gessard باکتری P. aeruginosa  را جدا نمود و آن را با سیلوس پاپوسیانوس[1] نامگذاری کرد [2].

در سال 1887 میلادی Gruber این باکتری را از چرک گوش جدا کرد، در حالی که مدتی بعد یعنی در سال 1889 میلادی، Charrin نقش بیماریزائی این باکتری را در حیوانات اعلام کرد.  در سال 1894 میلادی، Migula مشخصات اولیه P. aeruginosa  را بیان کرد.  در سال 1896 میلادی، Wasserman اعلام  نموده که نقش سم‌ها و مواد خارج سلولی P. aeruginosa  از خود سلول باکتری در بیماریزائی آن مهم تر است. Osler در سال 1952 میلادی، اظهار داشت که P. aeruginosa  احتمالا در عفونت‌های ثانویه نقش دارد. P. aeruginosa  به خاطر تولید فرآورده‌های گوناگون خارج سلولی و عدم اطلاع از چگونگی دقیق بیماریزائی آن به تدریج اهمیت و جایگاه ویژه خود را در علوم بیولوژی و پزشکی پیدا کرد و همگام با تکوین این یافته‌ها، نام‌های گوناگونی را مانند:

– bacterium aeroginosum

– micrococcus

– papocianos

– bacillus aerogenous

– papocianos bacillus

– pseudomonas payocyanoum

– payocyanou bacterium

– pseudomonas polycholor

برای آن در نظر گرفتند [6].

امروزه به این باکتری P. aeruginosa  می‌گویند که از چند واژه متفاوت تشکیل شده است.

1- کلمه پسودو، یعنی کاذب بودن و با توجه به متفاوت بودن شکل باکتری (به حالت‌های مستقیم و خمیده) در هنگام نامگذاری در ابتدای نام این خانواده قرار داده شده است.

2- کلمه موناد، این واژه کلمه ای یونانی است و به معنی واحد می‌باشد( قبلا واحد بیماریزائی که موجب عفونت می‌گردید به عنوان  موناد پیشنهاد گردیده بود. با در نظر گرفتن این تعریف، پسودوموناس ‌ها در واقع مربوط به واحدهای متغیر الشکلی بوده که برای ظهور خود در عفونت‌ها نیاز به اکسیژن دارند.

3- آئروژینوزا  ، این کلمه در زبان لاتین به معنای زنگ مس(اکسید مس) می‌باشد و در واقع، علت اصلی چنین تعبیری در مورد این باکتری‌ها مربوط به رنگ پیگمان (سبز یا آبی متمایل به سبز) تولید شده در کشت حاصل از این باکتری بوده است [6].

1-2-1- خصوصیات مورفولوژیک P. aeruginosa

باکتری‌های موجود در گونه P. aeruginosa  میله ای شکل، مستقیم یا کمی منحنی، گرم منفی، غیر اسید فست و بدون اسپور می‌باشند. این باکتری‌ها به وسیله یک یا تعدادی تاژک قطبی حرکت می‌کنند. طول این باکتری‌ها بین 5/1 تا 4 میکرون و عرض آن‌ ها بین 5/0 تا 1 میکرون متفاوت است. این باکتری‌ها در زیر میکروسکوپ  معمولاً به صورت منفرد، دوتائی و زنجره کوتاه دیده می‌شوند [7].

2-2-1- خصوصیات رشد

aeruginosa ، هوازی اجباری بوده که در انواع مختلفی از محیط‌های کشت به سهولت رشد می‌کند.

3-2-1- هوازی‌های اجباری Obligate aerobes

ارگانیسمهایی هستند که از نظر تنفس بیشتر انرژی خود را با بهره گرفتن از اکسیژن و توسط واکنشهای فسفویلاسیون اکسیداتیو تولید می‌کنند و اکسیژن در این فرایند نقش پذیرنده نهایی الکترون بعهده دارد. در نتیجه این میکروارگانیسم‌ها نیاز به اکسیژن و پتانسیل اکسیداسیون و احیاء(EH) بالا دارند و بنابراین غالباً در سطح مواد غذایی که در معرض اکسیژن است حضور دارند مانند پسودوموناس‌ها که اتانول را به اسید استیک اکسید می‌کند و منجر به فساد محصول و تبدیل آن به سرکه می‌گردد.

اما سه آنزیم که باکتری را در مقابل این رادیکال‌ها محافظت میکنند عبارتند از:

– سوپراکسید دیسموتاز[1]  که به اختصار ((SOD  نیز نامیده می‌شود.

– کاتالاز

– پراکسیداز

باکتری P. aeruginosa دارای آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است [8].

4-2-1- مشخصات کشت

1. aeruginosa ، هوازی اجباری بوده که در انواع مختلفی از محیط‌های کشت به سهولت رشد می‌کند و بوی انگور می‌دهد. برخی از نژادهای آن، خون را همولیز می‌کنند [4]. این باکتری سه تیپ دارد. کلنی‌های تیپ یک این باکتری گرد، دارای لبه‌های نامنظم، دارای 3-2 میلی متر قطر با سطح مات، در قسمت داخلی برجسته و قوام کره ای می‌باشد. کلنی‌های تیپ دو، کوچکتر، برجسته و شبیه کلنی کلی فرم‌ها می‌باشد و بالاخره کلنی‌های تیپ سه خشن، برجسته و کاملا چروکیده است. کلنی‌های تیپ یک و دو، درون سرم فیزیولوژی ایجاد سوسپانسیون پراکنده و یکنواخت می‌نمایند. اما تیپ سه، تشکیل سوسپانسیون گرانولی را میدهد. هر سه شکل کلنی ممکن است در یک محیط کشت دیده شوند، به طوری که گاهی با گونه‌های متفاوتی از این باکتری اشتباه می‌شوند [9].

در کشت‌های تهیه شده از افراد مبتلا به فیبروزیس سیستیک، ارگانیسم‌های P. aeruginosa ، كلنی‌های موكوئیدایجاد می‌کنند. این امر ، نتیجه تولید زیاد آلژینات – یک اگزوپلی ساکارید – می‌باشد. در افراد مبتلا به فیبروزیس سیستیک، به نظر می‌رسد که یک اگزوپلی ساکارید، ماده ای بین سلولی را می‌سازد، که زندگی ارگانیسم به شکل بیوفیلم را ممکن می‌کند [4].

تولید پیگمان آبی-  سبز قابل انتشار در محیط کشت، تشخیص P. aeruginosa را مورد تایید قرار می‌دهد. اما در برخی کشت‌ها، پایوسیانین تشکیل نمی شود و فقط بر روی بعضی محیط‌های کشت،  پایوسیانین تولید می‌شود. توانایی تولید پایوسیانین ممکن است به طور غیر قابل برگشتی در محیط‌های کشت از بین برود لذا اگرچه مشاهده پیگمان پیوسیانین تشخیص P. aeruginosa را تائید می‌کند، ولی ندیدن آن دلیل بر رد تشخیص نیست. اکثر کلنی‌های P. aeruginosa دارای بوع مطبوع میوه ای به علت تولید

 –o امینواستوفنون ناشی از تریپتوفان می‌باشد. بر روی محیط آگار مغذی، بسیاری از کشت‌های P. aeruginosa  به خصوص کلنی‌های تیپ یک و سه، قسمت‌های رنگین کمان مانندی را با جلای فلزی به نمایش می‌گذارند. در زیر این این قسمت‌ها در درون محیط کشت، کریستال‌هائی دیده می‌شود و در داخل آن‌ ها، ارگانیسم‌های متلاشی شده وجود دارد. این تحلیل رفتگی‌های پلاک مانند به هنگام رشد بر روی آگار را Berk در سال 1963 تحت عنوان  اتوپلاک[1]  نامید. به عقیده Zaget  و Sierra در سال 1960، اتولیز به علت حضور آنزیم‌های پروتئولیتیک  که سلول‌های مرده را هضم می‌کند ایجاد می‌شود و کریستال‌ها در واقع نمک‌های اسید چرب آزاد شده در نتیجه اتولیز می‌باشند. P. aeruginosa  بر روی محیط مکانکی آگار به خوبی رشد می کند و محیط‌های کشت مایع واجد حلقه سفید رنگ ضخیمی از مواد لزج و چسبنده  به جدار شیشه هستند که اکثرا تشکیل غشاء نازکی را در بالای محیط می‌دهد. پیگمان سبزرنگ نیز بیشتر نزدیک به سطح محیط مایع دیده می‌شود [6].