فهرست مطالب

عنوان …صفحه

: مقدمه

مقدمه………………………………………………………………2

 

مروری بر پژوهش­های انجام شده…………………………………………………8

2- 1- مطالعات فیتو شیمیای……………………………………………8

2- 2- مطالعات ضدمیکروبی و آنتی­اکسیدانی……………………………………………12

2- 3- مطالعات ساختاری و فراساختاری……………………………………………15

اهداف پژوهش…………………………………………………………..20

 

.22

3- 1 -انتخاب نمونه…………………………………………22

3- 2- آماده‌سازی نمونه‌ها جهت مطالعات سلولی تکوینی با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری (1978Roland, )……………………………………………………………….23

3- 2- 1- تثبیت (Fixation)…………………………….. 23

3- 2- 2- آبگیری (Dehydration)……………………………………………24

3- 2- 3- نفوذ پذیری (Infiltration)……………………………………………24

3-2 -4- قالب­گیری (Embedding)……………………………………….25

3- 2- 5- برش ‌گیری (Sectioning)……………………………………………25

3- 2- 6 – رنگ‌آمیزی (Staining)……………………………………………………26

3- 2- 7- مشاهده و عكس­برداری (Observation and Photography)………………………………………………26

3-3- آماده سازی نمونه ها جهت مطالعات میکرومورفولوژیک با بهره گرفتن از میکروسکوپ الکترونی نگاره (Bozzola and Russel,1998)………26

3-3-1- تثبیت (Fixation)………………………………………………………….27

3- 3- 2 – آبگیری (Dehydration)………………………………………………………27

3-3-3- چسباندن (Mounting)…………………………………………………………28

3-3-4- پوشش دادن (Coating)……………………………………………..28

3-3-5- مشاهده و عکس­برداری (Observation and Photography)…………………………28

 

نتایج………………………………………………..30

4- 1- ویژگی­های مورفولوژیک آویشن دنایی……………..30

4- 2- بررسی­های میکروسکوپی………………………………………………31

4-2-1- جوانه انتهایی……………………………………………..31

4- 2- 2- بافت شناسی و تغییرات تکوینی ساقه…………………………..33

4- 2- 3- ساختار درونی و تغییرات تکوینی در برگ………………….34

4- 2- 4- کرک­های اپیدرمی در برگ آویشن دنایی……………………36

4- 2- 4- 1- بررسی­های ساختاری………………………………….36

4- 2- 4- 2- تمایزیابی کرک­های غده­ای……………………………39

4- 2- 4- 2- بررسی­های میکرومورفولوژیک…………………………….41

 

بحث و نتیجه ­گیری………………………………………………………….98

5- 1- بررسی مورفولوژیک………………………………………..98

5- 2- مطالعات میکروسکوپی…………………………………………….99

5- 2- 1- جوانه انتهایی و بنیان گذاری برگ……………………99

5- 2- 2- ساختار و تغییرات تدریجی ساقه…………………………101

5- 2- 3- تغییرات تدریجی برگ……………………..102

5- 2- 4- کرک­های اپیدرمی…………………..105

 

 

5- 2- 4- 1- تنوع و پراکندگی…………………………105

5- 2- 4- 2- تمایز یابی کرک­های غدهای…………………….109

5- 2- 4- 3- رابطه بین نمو انواع کرک و تکوین برگ و ساقه …………..114

مقدمه

تیره نعناعیان (Lamiaceae) یکی از بزرگ­ترین تیره­های گیاهی و دارای 178 جنس و 3000 گونه است. گونه­ های این تیره تقریباً در سراسر جهان پراکنده­اند و به طور خاص در مناطق مدیترانه­ای تجمع دارند (قهرمان، 1373).

آویشن (Thymus) یکی از جنس­های تیره نعناعیان است که در زیر خانواده Nepetoideae قرار دارد و از نظر فیلوژنی با جنس های Origanum، Zataria و Micromeria قرابت و خویشاوندی دارد. مبدأ پیدایش این جنس دوران سوم زمین­ شناسی است و در فلور خشکی پسند این دوره آثار آن را یافته­اند و بدنبال توسعه مناطق خشک بخصوص در دوره پلیوسن و بعد از آن تا به امروز تکامل جنس صورت گرفته است (جم­زاد، 1388). در فلور ایرانیکا، برای سهولت شناخت جنس­های تیره نعنا، آنها را به پنج گروه تقسیم کرده ­اند و آویشن در گروه گیاهانی که دانه آنها لعاب­دار است قرار می­گیرد (قهرمان، 1373).

در مورد تعداد گونه­ های آویشن از نظر تاکسونومیک گزارش­های متفاوتی وجود دارد، تعداد گونه­ های آن در بعضی از گزارش­ها به 800 می­رسد، اما با در نظر گرفتن کمترین مقدار تنوع مورفولوژیک، 215 گونه از این جنس گزارش گردیده است. نام جنس Thymus از کلمه یونانی Thyo به معنای عطر گرفته شده است. تفسیر دیگری که در رابطه با نام این جنس وجود دارد کلمه یونانی Thymos به معنای قوت است و Thymus به گروهی از گیاهان اتلاق می­شده که دارای اثر تقویت کننده و محرک بوده ­اند (جم­زاد، 1388). آویشن ها به علت داشتن عطر و همچنین خواص دارویی در همه جای دنیا مورد استفاده قرار می­گیرند. وجود غده­های ترشحی در سطح برگ­ها و گل­های گیاه سبب و عامل اصلی عطر و بو و خواص دارویی در گیاه است (جم زاد، 1388).

این جنس در ایران 18 گونه معطر و چندساله دارد گونه­ های انحصاری آن در ایران عبارتند از:

1. persicus, T. marandensis, T. daenensis, T.lancifolius

و دیگر گونه­ های آن:

1. fallax, T. kotschyanus, T. transcaspicus, T. armeniacus
2. eriocalyx, T. nummularius, T. pubescens, T. carmanicus
3. caucasicus, T. transcaucasicus, T.linearis, T. armeniacus
4. fedtschenkoi, T. migricus

این گونه­ ها علاوه بر ایران در ترکیه، قفقاز، عراق، هند، آذربایجان شوروی، ارمنستان، ترکمنستان و پاکستان نیز می­رویند (جم­زاد، 1391).

آویشن دنایی(T. daenensis) در مناطق کوهستانی استان­های زنجان، کردستان، همدان، لرستان، اصفهان، کهگیلویه و بویراحمد، چهارمحال و بختیاری، فارس و مرکزی می­روید. گیاهان این گونه دارای ویژگی­های زیر می­باشند: خشبی، کوتاه قد، بالشتکی، به ارتفاع 15 تا 30 سانتی­متر، راست، بدون انشعاب، تقریبا بدون کرک تا کم و بیش کرکدار. برگ­ها به طول 10 تا 20 و به عرض 2 تا 5 میلی­متر، کم و بیش گسترده، از میان گره کوتاه­تر، خطی تا سرنیزه­ای باریک، بدون دمبرگ، نوک تیز، سطح زیرین برگ با رگبرگ میانی برجسته و 2تا 3 جفت رگبرگ جانبی برجسته، جفت سوم تا نیمه برگ امتداد یافته. با تعداد زیادی غده ترشحی قرمز رنگ در هر دو سطح. گل­آذین کله­ای انتهایی، گاهی کشیده، چرخه های پایینی دور از یک­دیگر و بندرت دارای دمگل­آذین. برگه­ها تقریبا شبیه به برگ­ها، کوتاه­تر و تقریبا پهن تر از آنها، سبز رنگ، به ندرت قرمز مایل به بنفش. کاسه به طول 3 تا 5/4 میلی­متر، لوله­ای یا استکانی، دندانه­ های لبه بالایی به طول 5/0 تا 1 میلی­متر، نزدیک به هم به طرف بیرون برگشته، مشخصاً کوتاه­تر از دندانه­ های لبه پایینی. جام گل به طول 5تا 6 میلی­متر، قرمز رنگ. زمان گل­دهی تابستان (جم­زاد، 1391).

عدد کروموزمی در جنس آویشن بسیار متنوع است. حالت­های پلی­پلوئیدی شامل تترا و هگزا پلوئید گزارش گردیده است. عدد پایه کروموزمی 7=x است. اعدا کروموزمی 24=n2 تا 90=n2 برای گونه­ های Thymus گزارش گردیده است، ولی معمول­ترین اعداد کروموزمی 60، 56، 30 و 28=n2 می­باشند (جم­زاد، 1388).

خواص داروئی و معطر بودن آویشن باعث شده است که این گیاه در زمره گیاهان ارزشمند قرار گیرد. اسانس گل و برگ­های آویشن دارای اثر ضد­اسپاسم، ضد­نفخ، ضد­روماتیسم، ضد­سیاتیک و ضد­عفونی کننده قوی است (Stahl-biskup, 2002). عمده­ترین ترکیبات موجود در اسانس آویشن­ها تیمول و کارواکرول می­باشند. این­ها دو ترپنوئید هستند که تنها در تعداد محدودی از گونه­ های گیاهی از جمله آویشن­ها وجود دارند. وجود غده­های ترشحی در سطح برگ­ها و گل­های گیاه عامل اصلی عطر و بو و خواص دارویی در گیاه است (جم­زاد، 1388).

ساختار­های ترشحی در بیشتر گیاهان آوندی وجود دارند و موقعیت مکانی، ساختار و مواد ترشحی متفاوتی دارند. مواد معمولا از سلول­های ترشحی به بیرون از گیاه رانده می­شوند یا در فضا­های درون سلولی تخصصی شده محدود می­شوند (Fahn, 1988).

ساختار­های ترشحی داخلی شامل: سلول­های ترشح کننده، مجاری و کیسه­های ترشح کننده و سلول­های شیرابه­دار هستند. ساختار­های ترشحی خارجی شامل هیداتود، نوشجای و کرک­های اپیدرمی می­باشند. کرک­های اپیدرمی زوائد تک سلولی و چند سلولی هستند و در دوگروه غیرغده­ای و غده­ای قرار می­گیرند (Fahn, 1990).

کرک­های غیر­غده­ای از لحاظ شکل و آناتومی متنوعند و ممکن است تک سلولی یا چندسلولی باشند و هر دو نوع این­ها می­توانند ساده یا منشعب باشند. کرک­های چند سلولی ممکن است منشعب، یک ردیفه، دو ردیفه یا چند ردیفه باشند. دیواره­ های عرضی بین سلول­ها مشخص و یا غیرقابل تشخیص است. ممکن است در طول، اندازه و حالت سلول متقارن و یا غیر متقارن باشند. می­توانند در پهنا متحدالشکل باشند و یا پهنایشان در طول تار تغییر کند و نوک آنها باریک شود و یا کند باشد. ضخامت دیواره می ­تواند متنوع باشد و یا مواد تزریق شده در دیواره آن­ها می ­تواند دیواره­ها را به حالت نرم سینوسی و یا سیخی درآورد. انشعابات در کرک­های چند سلولی منشعب، ممکن است چندسلولی و یا تک سلولی با طول­های مساوی یا متغیر، متناوب و یا متقابل و در یک یا چرخه­های بسیار، با ظاهری منگوله­ای باشند (Werker, 2000). کرک­های فلسی، Tشکل، چندسلولی ستاره­ای و کرک­های یک ردیفی، تک سلولی ساده یا چند­سلولی از انواع غیر­غده­ای هستند (Fahn, 1990).

 کرک های غده­ای بسیار متنوع­اند و در بسیاری از تیره­ها وجود دارند، ولی اغلب در تیره­های Solanaceae، Lamiaceae، Rosaceae و Cannabinaceae یافت می­شوند. براساس موارد زیر رده­بندی می­شوند: ترکیب شیمیایی موادی که ترشح می­ کنند، روش تولید آن­ها، ساختار، موقعیت (غده­هایی مشابه ولی روی اندام­های رویشی و یا زایشی) و وظیفه­ی آن­ها.

در کرک­های غده­ای تک­سلولی بین قسمت رأسی و قاعده­ای، تمایز مورفولوژیک وجود دارد. غده­های چندسلولی تیپیک شامل یک سرِ یک یا چند سلولی ترشحی، یک پایهِ یک تا چند سلولی، یک Base با تعداد کمی سلول و گاهی اوقات یک سلول گردنی (بین سر و پایه). تفاوت­هایی بین سلول­های پایه و سر ترشحی وجود دارد. در سلول­های پایه پایین­ترین سلول می ­تواند بسیار واکوئلی باشد درحالیکه سلول بالاتر ممکن است سیتوپلاسم متراکم داشته باشد، که به طور واضحی با عملکرد و نقش متفاوت آن­ها ارتباط دارد(Fahn, 2000) . کرک­های غده ای شامل کرک­های ترشح کننده نمک، کرک­های ترشحی شهد، غده ترشحی موسیلاژ، غده­های گیاهان گوشتخوار، تار ترشحی، کرک­های گزنده و کرک­های ترشح کننده مواد چربی دوست که روغن­های اسانس را در خانواده نعناعیان ترشح می­ کنند، می­باشند  .(Fahn, 1990)­کرک­های ترشح کننده مواد چربی دوست ممکن است پایه­ کوتاه یا بلند، منشعب یا بدون انشعاب، سر و پایه­ تک سلولی یا چند سلولی، سر سپری (peltate) یا تاجدار (capitate) داشته باشند و در ظرفیت خود برای ذخیره اسانس در فضای بین دیواره و کوتیکول متنوع می­باشند (Fahn, 2000). کرک peltate شامل یک سلول پایه، یک سلول ساقه کوتاه و یک سر گسترده متشکل از تعدادزیادی سلول­های ترشحی که در یک ردیف قرار گرفته­اند می­باشند. کرک­های capitate از یک سلول پایه، ساقه یک تا چند­سلولی و یک سر شامل یک یا دو سلول تشکیل شده اند. ترایکوم­های غده­ای دارای یک لایه کوتیکول می­باشند با بلوغ کرک لایه کوتیکولی از دیواره سلولزی فاصله گرفته و اسانس در فضای زیرکوتیکولی ذخیره می­ شود و در اواخر اندازه بزرگی در کرک­های peltate دارد. برخی از ترکیبات فرار اسانس ممکن است از کوتیکول عبور کنند اما بسیاری از مواد تنها پس از پارگی کوتیکول به بیرون راه پیدا می­ کنند (Fahn, 1988).

 

2- 1- مطالعات فیتو شیمیایی

ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس آویشن به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته و شناسایی شده ­اند. دو گروه اصلی ترکیبات شیمیایی موجود در این جنس ترپنوئید­ها و فلاونوئید­ها هستند. این ترکیبات نقش اصلی را در اثر­های دارویی این گیاهان ایفا می­ کنند. اسانس ­ها در گیاهان خانواده نعنا در کرک­های غده­دار و یا در غده­های ترشحی چسبیده به سطح برگ آن­ها ذخیره می­گردند (جم­زاد، 1388).

بخش های هوایی گلدارT. daenensis  وT. Kotschyanus   از استان همدان جمع­آوری شد. اسانس آن­ها توسط GC و GC/MS مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. 26ترکیب از اسانسT. daenensis شناسایی شد، ترکیبات اصلی شامل تیمول 7/74%، پاراسیمن 5/6%، بتا­کاریوفیلن 8/3%، و متیل کارواکرول 6/3% می­باشند .(Nickavar et al., 2005)

همچنین سرشاخه­های گلدار T. daenensis، در 4 منطقه استان اصفهان با GC و GC/MS آنالیز شد. در میان 27 ترکیب شناسایی شده، پنج ترکیب تیمول، پاراسیمن، گاما-ترپینن، کارواکرول و بتا­کاریوفیلن بالاترین غلظت را به خود اختصاص می­ دهند (برازنده و باقرزاده، 1386).

ترکیبات موجود در اسانس چهار گونه آویشن جمع­آوری شده از استان لرستان با GC و GC/MS آنالیز و مقایسه شد. ترکیبات اصلی موجود در اسانس T. daenensis سیس­سابینن­هیدرات (2/9%)، الفا­ترپینول (18/13%) و کارواکرول (38/12%) بودند (Safaei-Ghomi et al., 2009).

تنوع اسانس T. daenensis در 11جمعیت جمع­آوری شده از استان­های فارس و کهگیلویه و بویراحمد در مرحله کامل گلدهی مورد بررسی قرار گرفت با بهره گرفتن از GC و GC/MS 22 ترکیب جدا شدند که ترکیبات اصلی کارواکرول (1/80-3/47%)، تیمول (2/72-1/53%)، جرانول (7/75-6/65%)، بتا کاریوفیلن (9-7/1%)، پاراسیمن (9/10-1/0%)، گاما ترپینن (8/7-1/0%) بودند. بر اساس تنوع در ترکیبات اسانس جمعیت­ها به سه کیموتیپ دسته بندی شدند (Bahreininejad et al., 2010).

هاشمی و همکاران ترکیبات فرار از بخش­های هواییT. daenensis  جمع­آوری شده از منطقه الشتر را با روش headspace solvent microextraction و روش hydrodistillation بررسی کردند. ترکیبات اصلی موجود در عصاره ژرانیول (2/37-9/34%)، ژرانیل استات (7/18-3/15%)، ژرانیال (2/11-0/9%)، نرول (3/8-4/6%) و نرال (3/9-1/7%) بودند (Hashemi et al., 2010).

همچنین T. daenensis از ملایر در چهار مرحله نموی جمع­آوری شد. اسانس گیاه با روش hydrodistillation بدست آمد و با GC و GC/MS آنالیز شد. بیشترین اسانس (4/3%) در مرحله گلدهی بدست آمد. اجزاء اصلی اسانس در تمام مراحل رشد، تیمول، آلفا­ترپینن، پارا­سیمن، متیل­کارواکرول و آلفا­توجین بودند. درصد بالای تیمول (8/73%) در مرحله گلدهی، آلفا­ترپینن (59/9%) در مرحله رویشی، پارا­سیمن (0/9%) و متیل­کارواکرول (9/4%) در مرحله خواب دانه و آلفا­توجین (42/1%) در مرحله جوانه زدن بدست آمد (Rustaiee et al., 2010).

در تحقیق دیگری T. daenensis از 22 منطقه از استان­های اصفهان و چهارمحال­و­بختیاری جمع­آوری شد و عصاره توسط دستگاه HPLC آنالیز شد. نتایج نشان داد ارتفاع از سطح دریا بر میزان تیمول اثر معنی دار و مثبت دارد و بر میزان کارواکرول اثر معنی داری ندارد (کریمی و همکاران، 1389).

گل­پرور و همکاران اسانس T. daenensis کشت شده درگل­خانه و مزرعه تحقیقاتی را در دوره رویشی، ظهور آغازه­های گل، ظهور 50% گل­آذین­ها، گل­دهی کامل و زمان تشکیل بذر بررسی و مقایسه کردند. آنالیز اسانس به وسیله کروماتوگراف گازی صورت گرفت. بیشترین درصد اسانس 41/1% از مرحله گل­دهی و بیشترین میزان تیمول 1/84% از مرحله رویشی حاصل شد (گل­پرور و همکاران، 1390).

بخش­های هوایی T. daenensis در مرحله گل­دهی از 5 منطقه از کوه­های زاگرس جمع­آوری شد. ترکیبات شیمیایی اسانس بوسیله GC و GC/MS بررسی شد. همه اسانس ­ها حاوی مقدار زیادی مونوترپنوئید (0/83-4/75%) و مقدار کمی سس­کوئی­ترپن (0/4-7/1%) بودند و تیمول جزء اصلی تمام اسانس ­ها شناخته شد. بر­اساس درصد ترکیبات اسانس و مارکر­مولکولی RAPD این 5 جمعیت به دو دسته اصلی تقسیم شدند. خوشه اول (اراک و ملایر) شامل تیمول به عنوان جزء اصلی اسانس و خوشه دوم (الشتر، همدان، دنا) سرشار از کارواکرول بود (Rustaiee et al., 2011).