کپورماهیان دندان‌دار) در استان فارس با بهره گرفتن از نشانگر هسته‌یی ریزماهواره

چکیده

 بررسی تنوع ژنتیکی درون جمعیتی و بین جمعیتی ماهی گورخری فارسی

Aphanius farsicus Teimori, Esmaeili & Reichenbacher, 2011

(شعاع بالگان: کپورماهیان دندان دار) در استان فارس با استفاده

 از نشانگر هسته‌یی ریزماهواره

ساختار ژنتیکی ماهی بومزاد گورخری فارسی (Aphanius farsicus) حوضه‌ی مهارلو، از چهار منبع آبی مختلف شامل پیربنو، برم‌شور، دوبنه و برم بابونک با بهره گرفتن از نشانگر هستهیی ریزماهواره  (پنج جایگاه ژنی ریزماهواره‌یی Af7/ Af20/ Af20b/ Af61/ Af18) مورد مطالعه قرار گرفت. بر اساس نتایج به‌دست آمده هر 5 جایگاه ژنی 100% چند شکلی را نشان دادند. میانگین تعداد آلل‌ در سطح جمعیت‌ها 150/3 به‌دست آمد که پایین‌تر از مقدار مشاهده شده در ماهیان آب شیرین بود. میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده برابر 948/0 محاسبه شد که از میانگین هتروزیگوسیتی قابل انتظار (654/0) بیشتر بود. در بررسی تعادل هاردی-  واینبرگ، در دو جایگاه انحراف معنی‌داری (P<0.05) از تعادل مشاهده شد. نتایج به‌دست آمده از   FSTو  RST (013/0) تمایز ژنتیکی پایینی را میان مناطق نشان داد. همچنین بر اساس آنالیز واریانس مولکولی، تنها 1% تنوع مشاهده شده مربوط به بین جمعیت‌ها بود. به‌نظر می‌رسد که تبادل ژنی بالایی بین جمعیت‌های مورد مطالعه ماهی گورخری فارسی در چشمه های مورد مطالعه منطقه مهارلو وجود دارد.

کلمات کلیدی: حوضه مهارلو ، هتروزیگوسیتی، تبادل ژنی، ریز ماهواره، ماهی گورخری فارسی

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                صفحه

فصل اول: مقدمه

1- 1-  معرفی تاکسون مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………. 3

1- 1- 1-  جنس Nardo, 1827   Aphanius …………………………………………………………………….. 3

1- 1- 2-  ماهی گورخری فارسی Aphanius farsicus Teimori, Esmaeili & Reichnbacher, 2011      5

1- 1- 2- 1-  سیستماتیک……………………………………………………………………………………………… 5

1- 1- 2- 2-  ویژگی‌های مریستیک ……………………………………………………………………………… 6

1- 1- 2- 3-  رنگ……………………………………………………………………………………………………………. 6

1- 1- 2- 4-  زیستگاه……………………………………………………………………………………………………… 6

1- 2- معرفی حوضه‌ی آبی مورد مطالعه…………………………………………………………………………………….. 7

1- 2- 1-  دریاچه‌ی مهارلو…………………………………………………………………………………………………….. 7

1- 2- 2-  وضعیت حوضه‌ی آب ریز دریاچه‌ی مهارلو…………………………………………………………. 9

1- 2- 3-  چشمه های منتهی به دریاچه‌ی مهارلو………………………………………………………………. 10

1- 2- 4-  تشکیلات زمین شناسی……………………………………………………………………………………….. 11

1- 2- 5-  آب و هوا……………………………………………………………………………………………………………….. 11

1- 3-  مطالعات مولکولی……………………………………………………………………………………………………………… 11

1- 3- 1-  مطالعات تنوع ژنتیکی در ماهیان………………………………………………………………………… 12

1- 3- 2-  تکنیک‌های مولکولی…………………………………………………………………………………………….. 12

1- 3- 2- 1-  تکنیک‌های DNA……………………………………………………………………………………. 12

1- 3- 2- 1- 1-  تكنیک PCR………………………………………………………………………………………. 12

1- 4-  ژنوم هسته………………………………………………………………………………………………………………………… 13

1- 4- 1-  DNAتکراری…………………………………………………………………………………………………………. 13

1- 4- 1- 1-  VNTR ((Variable Number Tandem Repeat………………………………….. 14

1- 4- 1- 2- ریز ماهواره (Microsatellite) …………………………………………………………………… 15

1- 5- تعیین ساختار ژنتیکی جمعیت ………………………………………………………………………………………. 16

1- 5- 1-  مدل هاردی-  واینبرگ و دلیل انحراف از آن…………………………………………………….. 16

عنوان                                                                                                صفحه

1- 5- 2-  F- Statistics………………………………………………………………………………………………………… 18

1- 5- 3-  شباهت و فاصله‌ی ژنتیکی…………………………………………………………………………………… 19

1- 6-  هدف از انجام پژوهش………………………………………………………………………………………………………. 20

فصل دوم : مروری برمطالعات گذشته

2- 1-  مطالعات انجام شده روی جنس Aphanius…………………………………………………………………… 22

2- 2-  مطالعات انجام شده در مورد گونه Aphanius farsicus در ایران…………………………………. 24

فصل سوم: مواد و روش ها

3- 1-  نمونه برداری……………………………………………………………………………………………………………………… 26

3- 2-  مطالعات مولكولی……………………………………………………………………………………………………………… 28

3- 2- 1-  استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………… 28

3- 2- 1- 1-  ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………. 29

3- 2- 2-  انتخاب آغازگر……………………………………………………………………………………………………….. 30

3- 2- 3-  انجام واکنش زنجیره‌یی پلیمراز (PCR)……………………………………………………………… 31

3- 2- 4-  الکتروفورز محصول PCR…………………………………………………………………………………….. 34

3- 2- 4- 1-  تهیه‌ی آکریل آمید 30 درصد…………………………………………………………………. 34

3- 2- 4- 2-  تهیه‌ی X)10TBE((Tris, Boric Acid,EDTA)…………………………………… 34

3- 2- 4- 3-  آمونیوم پر سولفات 10٪(A.P.S) (Amonium per sulfate)……………….. 34

3- 2- 4- 4-  TEMED…………………………………………………………………………………………………… 35

3- 2- 4- 5-  تهیه ژل پلی آکریل آمید 7٪………………………………………………………………….. 35

3- 2- 4- 5- 1-  تجهیزات مورد استفاده……………………………………………………………………….. 35

3- 2- 4- 5- 2-  روش کار……………………………………………………………………………………………… 35

3- 2- 5-  رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با نیترات نقره…………………………………………………. 36

3- 2- 5- 1-  مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………… 36

3- 2- 5- 2-  تجهیزات مورد استفاده……………………………………………………………………………… 36

3- 2- 5- 3-  روش کار……………………………………………………………………………………………………. 36

3- 2- 6-  ثبت تصاویر……………………………………………………………………………………………………………. 36

3- 2- 7-  آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………. 37

عنوان                                                                                                صفحه

فصل چهارم: نتایج

4- 1-  نتیجه‌ی بررسی كیفیت و كمیت DNA استخراجی…………………………………………………….. 39

4- 2-  نتایج PCR………………………………………………………………………………………………………………………… 39

4- 3-  تعداد و طول آلل‌ها…………………………………………………………………………………………………………… 41

4- 4-  فراوانی آلل‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….. 41

4- 5-  تعداد آالل واقعی (Na) و موثر (Ne)………………………………………………………………………………… 42

4- 6-  تنوع ژنتیكی……………………………………………………………………………………………………………………… 43

4- 7-  تعادل هاردی-  واینبرگ………………………………………………………………………………………………….. 45

4- 8-  آنالیز آماری AMOVA……………………………………………………………………………………………………. 46

4- 9 جریان ژنی (ضریب مهاجرت)……………………………………………………………………………………………… 48

4- 10-  شباهت و فاصله ژنتیكی………………………………………………………………………………………………… 49

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5- 1-  تنوع ژنتیکی……………………………………………………………………………………………………………………… 52

5- 2-  تعادل هاردی-  واینبرگ………………………………………………………………………………………………….. 54

5- 3-  تمایز ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………………………….. 55

5- 4-  جریان ژنی ( مهاجرت)…………………………………………………………………………………………………….. 57

5- 5-  نتیجه گیری نهایی……………………………………………………………………………………………………………. 59

5- 6- پیشنهادها……………………………………………………………………………………………………………………………. 60

5- 7-  توصیه ها…………………………………………………………………………………………………………………………… 60

فهرست منابع و مآخذ

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

منابع انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                 صفحه

جدول 3- 1 منطقه‌های نمونه برداری و تعداد ماهی گورخری فارسی مورد مطالعه در این پژوهش    29

جدول3- 2 خصوصیات جایگاه‌های ژنی (آغازگر) مورد استفاده در این پژوهش……………………… 31

جدول3- 3 نوع و مقدار مواد مورد استفاده برای PCR در این پژوهش…………………………………… 31

جدول3- 4 برنامه چرخه حرارتی PCR جهت بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های ماهی

گورخری فارسی با بهره گرفتن از آغازگرAf7…………………………………………………………………………………….. 32

جدول3- 5 برنامه چرخه حرارتی PCR جهت بررسی تنوع ژنتیکی  جمعیت‌های ماهی

گورخری فارسی با بهره گرفتن از پرایمر Af20……………………………………………………………………………….. 32

جدول 3- 6 برنامه چرخه حرارتی PCR جهت بررسی تنوع ژنتیکی  جمعیت‌های ماهی

گورخری فارسی با بهره گرفتن از پرایمر Af20b………………………………………………………………………………. 32

جدول3- 7 برنامه چرخه حرارتی PCR جهت بررسی تنوع ژنتیکی  جمعیت‌های ماهی

گورخری فارسی با بهره گرفتن از پرایمر Af61……………………………………………………………………………….. 33

جدول3- 8 برنامه چرخه حرارتی PCR جهت بررسی تنوع ژنتیکی  جمعیت‌های ماهی

گورخری فارسی با بهره گرفتن از پرایمرAf18…………………………………………………………………………………. 33

جدول4- 1 شرایط  PCRدر جایگاه‌های ژنی مورد مطالعه در ماهی گورخری

فارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 40

جدول 4- 2 تعداد و طول آلل‌های به‌دست آمده (بر حسب bp) در پنج جایگاه ژنی مورد

مطالعه در ماهی گورخری فارسی…………………………………………………………………………………………………. 41

جدول 4- 3 فراوانی آللی در پنج جایگاه ژنی مورد مطالعه درماهی گورخری فارسی…………….. 42

جدول4- 4 تعداد آلل واقعی (Na) و موثر (Ne) در پنج جایگاه ژنی برای هر جمعیت ماهی

گورخری فارسی در منطقه‌های مورد مطالعه……………………………………………………………………………… 43

جدول4- 5  میانگین تعداد آلل واقعی (Na) و موثر (Ne) برای هر جمعیت ماهی

گورخری فارسی در منطقه‌های مورد مطالعه……………………………………………………………………………….. 43

جدول 4- 6 مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) و مورد انتظار (He) برای هرجمعیت از ماهی گورخری فارسی در منطقه‌های مورد مطالعه درهر جایگاه ژنی………………………………………………………………………………………………………. 44

عنوان                                                                                                 صفحه

جدول 4- 7 مقادیرهتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در سطح پنج   جایگاه ژنی در كل نمونه‌های ماهی گورخری فارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 44

جدول4- 8 میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) و مورد انتظار ((He برای هر جمعیت ماهی گورخری فارسی در منطقه‌های مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44

جدول 4-  9 بررسی تعادل هاردی-  واینبرگ در پنج جایگاه ژنی برای هر جمعیت ماهی  گورخری فارسی در منطقه‌های مورد مطالعه ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 45

جدول 4- 10 میزان FST محاسبه شده بر اساس آزمون  AMOVAبین جمعیت‌های ماهی گورخری فارسی در مناطق مورد مطالعه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 46

جدول4- 11 آنالیز واریانس مولكولی (AMOVA) ماهی گورخری فارسی. Df (درجه آزادی)،  SS(مجموع مربعات)،Ms  (انحرافات میانگین مربع)، Prob …………………………………………………………………………………………………………………….. 47

جدول 4- 12 میزان  RSTمحاسبه شده بر اساس آنالیز AMOVA بین جمعیت‌های ماهی گورخری فارسی در مناطق مورد مطالعه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 47

جدول4- 13 آنالیز واریانس مولكولی (AMOVA) در ماهی گورخری فارسی. Df (درجه آزادی)، SS (مجموع مربعات)، Ms (انحرافات میانگین مربع)، Prob …………………………………………………………………………………………………… 48

جدول 4- 14 میزان جریان ژنی محاسبه شده بین جمعیت‌های مناطق مورد مطالعه در ماهی گورخری فارسی بر اساس آنالیز AMOVA………………………………………………………………………………………………………………………………………. 49

جدول 4- 15 ماتریس فاصله ژنتیكی (اعدادزیر قطر) و شباهت ژنتیكی (اعداد بالای قطر) بین جمعیت‌های مناطق مورد مطالعه در ماهی گورخری فارسی……………………………………………………………………………………………………………………. 49

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                 صفحه

شکل1- 1-  الف: نر، ب: ماده و ج: زیستگاه طبیعی A. farsicus……………………………………………… 6

شکل1- 2-   عكس هوایی از دریاچه‌ی مهارلو و موقعیت آن نسبت به شهر شیراز……………….. 8

شكل1- 3-  عكس هوایی از دریاچه‌ی مهارلو و موقعیت آن نسبت به کوه‌های اطراف………….. 8

شكل 1- 4-   نقشه‌ی حوضه‌های آبریز استان فارس و موقعیت حوضه‌ی مهارلو و دریاچه آن در پهنه‌ی استان 10

شكل3- 1-  عكس هوایی از دریاچه‌ی مهارلو و موقعیت برخی از چشمه های مورد مطالعه در این پژوهش (نقاط قرمز رنگ) نسبت به آن……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 27

شكل3- 2-  عكس هوایی از حاشیه‌ی شمال غربی دریاچه‌ی مهارلو و آب‌های ورودی به آن 27

شکل 4- 1 نتایج  حاصل از FST به‌دست آمده از آزمون AMOVA در ماهی

گورخری فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………… 47

شکل4- 2 نتایج حاصل از  RSTبه‌دست آمده از  AMOVAدرماهی

گورخری فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………… 48

فصل اول

مقدمه